全缘叶绿绒蒿的谱系生物地理学研究

青藏高原是我国植物多样性和特有性最高的地区，其中横断山区由于复杂的地质变迁历史和独特的地貌已成为研究物种多样性的一个热点。全缘叶绿绒蒿是分布于青藏高原及其周边地区的高山植物，该物种的谱系生物地理学研究不仅有助于揭示横断山区的物种分化机制及地理分布格局的形成过程，而且有助于探讨青藏高原隆升及新生代晚期气候变化对横断山区物种遗传结构的影响。 本研究对全缘叶绿绒蒿的12 个群体、153 个个体的叶绿体DNA trnS-trnfM片段进行了序列测定，比对校正后该片段的长度为877－962 bp，其中含6 个突变位点和5 个插入缺失（两个7 bp，两个39 bp，一个6 bp）。根据这些变异，可分为12 种叶绿体单倍型（H1-H12）。全缘叶绿绒蒿在物种水平上的核苷酸多态性分别为π = 0.00152 和θ = 0.00122，单倍型多样性为HE 为0.791，群体之间的遗传分化系数FST 为0.46579。中性检测结果显示无论在物种水平还是在群体水平，都没有显著偏离中性模式，说明该物种近期没有经历明显的瓶颈效应或奠基者效应等历史事件。我们从地理上将全缘叶绿绒蒿的群体分为四个地区，即云南、川西、川北和青海地区。AMOVA 分析显示群体间的遗传分化系数FST为0.46579，大多数的核苷酸多态性来自群体内（53.42%），其次来自于地区内的群体间（40.44%），而四个地区之间的分化非常小，仅占6.14%。失配分析显示在整个物种的分布范围内呈现单峰式样（r = 0.0475, P = 0.07924），这种分布虽然是不显著的，但P 值接近显著的临界，说明可能存在不明显的扩散，但在各个地区内的群体都没有扩散的迹象。 比较单倍型的地理分布和单倍型之间的进化关系，发现川西和川北地区存在明显差异，这两个地区都拥有比较古老的单倍型，也具有地区特异的稀有单倍型，因此很可能是全缘叶绿绒蒿在冰期时的避难所。云南地区只具有一个古老单倍型H1，这种分布可能是由川西和川北避难所的南迁造成的，也可能该地区自身就是古老单倍型H1 的发源地。青海地区只有两种古老的单倍型，由于冰期后物种有往高纬度迁移的趋势，因此这个地区的单倍型可能是在冰期后由川西和川北迁移过去的。全缘叶绿绒蒿在横断山区单倍型的片段化分布及多个避难所的存在可能与该地区独特的高山低谷相间地貌以及受多次冰期影响有密切关系。

沙冬青抗冻组份的分离纯化和afp基因克隆的尝试

本文用三种方法分离纯化沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）叶片抗冻蛋白质。从70%硫酸铵沉淀后的上清液中得到了一种碱性的小分子物质，UiS，具有较高的溶解度( 260 mg/ml)和较强的降低溶液冰点的能力（200 mg/ml，冰点小于-20℃）：从10%硫酸铵和26%氯化铵共沉淀物中分离到一种抗冻蛋白-B3，B3分子量为39.8 kDa，热滞活性为0.45℃(10 mg/ml)：从沙冬青叶片热稳定蛋白质中用双向电泳一电泳回收法分离到afp,其分子量为40 kDa,pl为9.0。热滞活性为0.9℃(20 mg/ml)，和其他抗冻蛋白质进行比较，没有发现相同的类型。afp和uis在叶片含量都很高，可能是沙冬青抗冻生理过程中两种主要物质，它们对于沙冬青抵御-20℃左右的冷冻温度具有重要的意义。afp N端序列为SDDL SFTF NKFV PCQT DILF，据此合成了六段5’引物和一段3’引物，用RT - PCR方法从叶片中扩增出一段200 bp左右的片段。

水稻颖花开裂突变体的鉴定及颖花开裂基因srs-1的定位

　　水稻(Oryza sativa L.) 颖花开裂 (split rice spikelet，SRS) 突变体是从水稻品系 8902s 花药培养得到的双单倍体群体中筛选出的同源异型突变体。以窄叶青8号为母本，SRS突变体为父本配制杂交组合，其F2群体中正常植株和突变植株的分离比例符合3:1，说明颖花突变性状是由单隐性基因决定的。 利用扫描电镜观察 SRS突变体花器官形态发生过程。其性状表现为内外稃变软变长，不抱合，在外稃基部又着生一朵花，两浆片基部融合，质地呈稃片状，雄蕊和雌蕊形态正常，且可育。该突变体的突变性状与拟南芥APETALA1的突变表现相似，说明两者在形态建成方面具有相似之处。由于 SRS 突变体第一轮和第二轮花器官发生了变化，根据 ABC 模型，srs-l基因应属于同源异型 A 组基因。 采用BSA法在F2群体中建立DNA正常池和突变池，利用RAPD技术筛选与突变基因srs-l连锁的分子标记。从520条随机引物中筛选出了引物S465能在两池间扩增出分子量为900 bp的差异片段，并证明其在F2群体中表现共分离。将此DNA片段克隆后作为RFLP探针pS465A，该探针与srs-l基因紧密连锁，在DH群体的RFLP分子连锁图谱上成功地将它们定位于第三染色体上。 本研究是利用水稻同源异型突变体为材料，研究水稻花器官发育基因的首例报道。

H-OLE1基因的克隆与功能鉴定及维管组织分化的激素调节

脂肪酸是生物体内普遍存在、具重要生理功能的物质，亦是重要的化工原料。研究脂肪酸生物合成及其调控，既是揭示生命活动基本规律的需要，又具巨大的经济价值。多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)是一种甲基嗜热酵母，能合成多聚不饱和脂肪酸，是研究脂肪酸生物合成的理想材料之一。为阐明多形汉逊氏酵母细胞中脂肪酸生物合成途径、关键步骤、调节机理，并利用此系统生产有用脂肪酸，我们开展了不饱和脂肪酸生物合成关键酶基因--△9-脂肪酸去饱和酶基因研究。 以P. angusta IFO 1475的P-OLE1基因为探针，Southern杂交分析，发现在亲缘关系很近的不同种类的甲基嗜热酵母如H. pofymorpha、Pichia angusta、P. pastoris、P. methanolica和Candida boMinii中Δ9-脂肪酸去饱和酶基因的结构多形性。 构建了H. polymorpha CBS 1976染色体Δ9-脂肪酸去饱和酶基因座位的限制性酶切图谱，进而分离了3.4 kb BamHI-XhoI基因片段并进行全序列分析，结果表明这个片段含1个与已克隆的酵母Δ59-脂肪酸去饱和酶基因高度同源的、由1353 bp组成的ORF。推导的H-OLE1多肽具脂肪酸去饱和酶的一些基本特征，如含2个结构域：1个位于N一端、含3个保守的组氨酸簇、具催化功能，另1个位于C-端、参与脱饱和反应中电子传递、类似细胞色素b5。将这个序列申报DDBJ，获得Accession number为：AB024576，推导的蛋白的氨基酸序列的Accession number为：BAA75902。 为验证H-OLE1基因的功能，建立了多形汉逊氏酵母DNA电穿孔实验系统，进行了遗传互补测验。发现完整的H-OLE1基因可互补缺乏Δ59-脂肪酸去饱和酶活性的多形汉逊氏酵母营养缺陷型fadl突变体，却不能互补相应的酿酒酵母olel突变体，而由酿酒酵母GAP表达框架和H-OLE1 ORF组成的嵌合基因可互补上述olel突变体。说明H-OLE1基因编码Δ9-脂肪酸去饱和酶，多形汉逊氏酵母的Δ9-脂肪酸去饱和酶和酿酒酵母的脂肪酸脱饱和系统相亲和，而H-OLE1基因的启动子在异源细胞中没有活性。 为研究H-OLE1基因的转录及其调节规律，通过一系列实验，首次找到了可在研究多形汉逊氏酵母基因表达时用作内标的GAP基因。Northern杂交发现，H-OLE1基因在细胞中以较低水平表达，产生1.5 kb的转录子;基因表达略受不饱和脂肪酸的抑制;在多形汉逊氏酵母HOLE1基因的转录调节中，Choi等在酿酒酵母OLE1基因中发现的脂肪酸调节元件FAR可能不是关键的。 利用基因敲除技术，通过转化H-OLE1∷S-LEU2线性DNA到多形汉逊氏酵母二倍体细胞(fadl／FADl)中，首次构建了多形汉逊氏酵母H-OLE1基因的破坏株。遗传学和分子生物学研究表明，破坏株细胞中线性DNA定位串联多拷贝整合到染色体中并置换了fadl突变部位。利用气相色谱分析了ΔH-OLE1破坏株、fadl-2突变株、野生型菌株及含H-OLE1基因转化子的细胞总脂肪酸，发现多形汉逊氏酵母细胞中除18:0→18:1(Δ9)→18:2(Δ9,12)→18:3(Δ9,12,15)这个脂肪酸去饱和主路外，还可能存在其它几个脱饱和反应与延长反应，如16:1(Δ9)→16:2(Δ9,12)→18:2(Δ11,14);16:1(Δ9)→18:1(Δ11)→18:2(Δ11,15)等。 近年维管组织分化研究进展迅速，取得大量可喜结果，也存在许多不足，如细胞分化调节机理，特别是激素诱导的分子机理研究比较薄弱。为建立研究维管组织分化的理想系统，研究嫁接体发育的激素调节机制，在Parkinson和Yeoman发明的离体茎段嫁接系统的基础上，研究了激素对嫁接体发育特别是维管组织分化的影响。 采用不同的嫁接方法，用试管苗对黄瓜离体茎段自体嫁接、亲和性的黄瓜／黑籽南瓜与不亲和性的黄瓜／绿豆离体茎段嫁接组合进行研究，建立了嫁接过程简单、污染率低的试管苗离体茎段嫁接系统。利用往培养基中添加或不加植物激素研究嫁接体发育，发现通过改变培养基中的植物激素，可使亲和的嫁接体难以形成贯通砧木和接穗的维管束桥，也可诱导非亲和性的嫁接体产生维管束桥。初步研究证明利用植物激素可以克服嫁接不亲和性，这一结果是嫁接基础理论研究的一个重要进展，对揭示嫁接亲和性机制具重要意义。由于黄瓜绿豆嫁接组合中，砧木绿豆是可以固氮的豆科植物，研究结果具有潜在的应用前景。 详细地研究了外源IAA和玉米素(ZT)对黄瓜自体嫁接系统中维管束桥形成时间和数目特别是贯通砧木和接穗的管状分子数的影响。当砧木和接穗培养基中都没有添加植物激素时，嫁接接合部难以产生维管束桥，也难以产生贯通的管状分子。当培养基中添加植物激素时，维管束桥数和贯通的管状分子数随激素浓度和种类的不同而不同。本实验的最佳激素条件是：在接穗培养基中加IAA 1.0 mg／L和ZT 0.25 mg／L，在砧木培养基中加ZT 0.25 mg／L。研究表明在试管苗离体茎段自体嫁接系统中，外源激素是嫁接成功的必要条件。试管苗离体茎段嫁接系统是一个理想的研究植物维管组织分化的新系统。 通过对嫁接体发育期接合部及嫁接体各部分IAA、玉米素及玉米素核苷(Z+ZR)的ELISA分析，发现嫁接接合部维管束的再生受IAA和Z+ZR含量的共同调节;连接接穗和砧木维管束桥的分化比维管束的网联要求更高的IAA水平及LAA(Z+ZR)比率。 上述结果为利用嫁接系统研究维管组织分化机理奠定了基础，使进一步研究嫁接体发育的激素调节机理成为可能。

小麦春化相关基因的克隆及其功能分析

一． 小麦相关基因ver203F cDNA全序列克隆与功能分析 　　根据本实验室通过差异筛选技术克隆到的与春化相关的基因cDNA verc203的序列，设计PCR 5’端PCR引物，利用RACE（rapid amplification of cDNA ends）克隆策略，得到春化相关基因ver203基因的同源基因ver203F cDNA的3’端序列，长度为1,197bp。Northern分析表明ver203F全长约为1.5 kb，且其表达具有春化处理的特异性。根据3’RACE克隆的ver203F 3 ’端核苷酸序列设计了3’端PCR引物，利用5’RACE克隆到该基因的5’端片段，经DNASIS核酸分析软件分析将5’45RACE和3’RACE DNA序列拼接合并，得到ver203F全长cDNA，从TdT加尾5’末端到poly A全长为1,561 bp，5’端起始密码子ATG上游非编码区－1～－192共了192bp，终止密码子TGA到poly A的非编码区有253bp，cDNA编码区全长1,119 bp，推测编码373氨基酸残基。国际基因序列数据库检索表明该基因序列（GenBank/EMBL/DDBJ：AB012013）与大麦茉莉酸诱导基因有部分同源性。因上推测该基因在调控开花过程中可能参与茉莉酸介导的信号传导途径，ver203F作用的发挥可能需要其它蛋白的参与，或ver203F本身就是一个受体蛋白。 　　为了研究ver203F基因的功能，将通过3’RACE克隆到的ver203F 3’端序到分别构建正义和反义植物表达载体，通过花粉管通道法、农杆菌介导的叶圆片法以及农杆菌介导的真空转化法分别转化小麦、烟草和拟南芥菜。获得转基因植株后，PCR、DNA Dob Blot、Southern Blot分析以及GUS活性检测证明外源基因已整合到转基因植株中，并得到表达。在获得的小麦、烟草和拟南芥菜转基因植株中，它们开花时间都相应地推迟，表明正常植物体内该基因在控制营养生长向生殖生长的转变中起作用。ver203F可以影响小麦和拟南茶菜花序的发育，首先无论正义还是反义都使得花序的发育受到抑制，在小麦中表现为顶部小穗退化，在拟南芥菜中表现为顶花。其次在转化正义基因的转基因拟南芥菜中，观察到产生的顶花为对称的两朵或以对称的两朵顶花基部为生长点长出丛生花，这种对称花的麦型小麦小穗中小花的表型相类似，说明ver203F基因可能在小麦小花的发育过程中也起着重要作用。 二． 春化相关基因ver17在开花过程中功能的分析 以春化处理冬小麦（京冬1号）幼苗cDNA为材料，通过减法杂交与差异筛选得到春化相关cDNA克隆verc17。为了研究该基因的功能，以包含CaMV 35S启动子的pBI221为载体，将ver17cDNA片段分别从两个方向插入pBI221的BamH I－Sma I, Xba I－BamH I间，构建正义和反义表达质粒：p17S和p17X，通过花粉管通道法转化小麦。对T0和T1两代转基因小麦的观察发现，在转化反义基因p17X的转基因小麦首先表现为抽穗推迟，其次穗的顶部和基部小穗严重退化，另外还发现转化反义基因的小麦败育现象严重（主要是花粉败育），因此推测ver17基困能可具有以下几方面的特点：a．春化诱导型表达;b．促进植物开花;c．促进穗顶端和基部花的发育，减少其退化;d．影响雄蕊的发育。

棉花抗黄萎病基因工程研究和防卫反应相关基因的克隆

系统获得性抗性(Systematic acquired resistance, SAR)是植物抵御病原菌侵染的最有效手段，利用基因工程技术导入SAR信号发生过程中的关键基因后，植物的SAR基因表达量提高并且对病原菌侵染的反应速度加快，因此植物的抗病性得以增强，与传统的抗病基因工程技术相比它对病原菌没有专一性，许多学者称之为广谱抗病基因工程，该领域已成为目前抗病基因工程研究的热点和前沿。 NDR1和NPR1基因在植物的SAR发生中起着重要的作用，前者功能定位在ROS(reactive oxygen species)的激活和随后的水杨酸(SA)诱导合成之间，突变株病原菌诱导后SA合成能力降低，SAR发生减弱，目前还没有对该基因进行过量表达分析的报道;后者功能定位在SAR信号转导级联反应之中的SA积累和随后的SAR基因表达之间。该突变株在病原菌侵染时不产生病程相关蛋白(PRs)，表现为感病，而对照抗病;过量表达该基因的转基因拟南芥对多种病原菌的侵染产生抗性，PR1等PRs蛋白的表达量也提高，异源表达该基因的水稻对白叶枯病的抗性也提高。本研究利用RT-PCR方法从拟南芥中克隆了这两种基因，序列分析表明拟南芥Wassilewskija生态型的NDR1基因与Columbia生态型相比，共有7处碱基不同，引起编码氨基酸变化4处，而NPR1基因与报道的Wassilewskija生态型来源的NPR1基因完全相同。 我们构建了35S启动子驱动的NDR1和NPR1基因的植物组成型高效表达载体，利用农杆菌介导法转化烟草，PCR和Southern鉴定外源基因已经整合到植物基因组中。抗病性分析显示过量表达NDR1和NPR1基因的烟草对晚疫病和赤星病的抗性都有明显提高，说明这两个基因的在其它植物中异源表达后，都能提高植物对多种病原菌的抗性。 本论文提出了利用这两个基因来培育抗黄萎病棉花的设想，一方面为解决这个“世纪性”难题积累新的资料，另一方面也为其它作物的抗病基因工程提供新的经验。利用35S启动子驱动的NDR1和NPR1基因的植物组成型表达载体分别对陆地棉品种石远321进行花粉管通道法转化。同时，还探讨了这两个基因在棉花中的共转化实验，希望它们的“协同增效”能进一步提高棉花的抗病性。对其中2001年夏天在南京注射所获得的5,000粒种子在三亚进行100 g/ml卡那霉素筛选，初步鉴定分别获得转NDR1和NPR1基因株系26和24棵，PCR进一步鉴定其中分别有12和7棵为转基因阳性，转基因频率分别为0.50％和0.27％，目前利用营养钵蘸根法对其二代进行抗枯、黄萎病鉴定，结果显示有转基因植株对枯、黄萎病的抗性都明显增强，进一步的鉴定正在进行中。2002年初海南注射分别获得转NDR1和NPR1基因以及共转化种子22,000、10,500和12,500粒种子，2002年夏在中国农科院植保所黄萎菌病圃筛选抗黄萎病单株，并利用100 g/ml卡那霉素初步筛选出了一批抗性植株，每种转基因株系随机挑选5株进行PCR鉴定，结果显示为阳性。进一步的抗黄萎病鉴定和筛选以及分子分析正在进行中。 同时，本文还探讨了病原菌诱导型启动子在广谱抗病基因工程应用的可能性。根据烟草的Pr1-a启动子已知序列设计引物，PCR扩增启动子序列后,构建病原菌诱导型NPR1基因植物表达载体，并对棉花进行转化，获得种子11,500粒，利用同上的筛选方法，获得了一致的结果，目前抗黄萎病鉴定、分子检测以及生物学分析正在进行中。 最后，鉴于抗生素标记在转基因植物的应用引起了许多“安全性”争论的事实，还构建了无筛选标记的表达载体对抗虫棉进行转化，这样在生产上可以直接获得抗虫棉抗黄萎病棉花新材料，也为其它作物抗病基因工程积累经验。 本研究还提出了一种较为有效的提取高质量棉花总RNA的方法，与原来一些棉花RNA纯化方法相比，该方法所用都为常规试剂，易于重复，质量高。并且利用获得的总RNA构建了黄萎菌激发子诱导的cDNA文库，滴度测定为1╳107pfμ/μg，插入片段大小在5 00~2 000 bp范围内。 鉴于NPR1基因研究的重要性，本研究还利用简并引物PCR技术从海岛棉和陆地棉的基因组中都分离到了NPR1基因的同源片段，大小都为208 bp，与拟南芥NPR1基因的相应部分的同源性分别为66％和65％，它们之间的同源性为87％，目前该基因的全长正在分离鉴定中。 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIPs)在植物的防御反应中起着重要的作用，通过分析已知20余种pgip基因序列的保守区，设计简并引物，PCR扩增海岛棉（Gossypium barbadense）7124 cDNA文库，得到一条长561 bp的片段，序列测定后分析确认为pgip基因的一部分。根据此序列和棉花病原菌诱导的cDNA文库载体中已知部分设计RACE引物，扩增后，5’和3’RACE分别得到666bp和906 bp的片段。序列分析表明它具有完整的编码框，产物为330 aa的蛋白质。序列分析该蛋白具有10个串联的LRR(leucine-rich repeat)区，与柑桔(Citrus)和枳(Poncirus)的pgip基因的同源性分别为69.2%和68.7%。进一步PCR扩增得到该基因的全长阅读框，并且获得了相应的基因组片段，序列分析发现该基因没有内含子。这是从棉属植物中克隆的第一个pgip基因。

青蒿素生物合成相关基因的克隆、大肠杆菌表达与分子分析

利用现代分子生物学和基因工程技术手段，克隆青蒿素生成途径的关键酶基因，研究关键酶基因对青蒿素生物合成的调控规律，是打破青蒿素生物合成的限速步骤，大幅度提高青蒿素含量，最终达到利用植物生物技术工业化生产青蒿素的目的必须解决的关键问题。本论文基于此目的，开展了青蒿素生物合成相关基因的分子克隆工作。 用RACE方法从青蒿高产株系001中克隆了一个新的1886bp的全长倍半萜合酶cDNA。克隆的倍半萜合酶氨基酸序列与烟草马兜铃烯合酶、莨菪岩兰螺旋二烯合酶、棉花杜松烯合酶的一致性分别为39%，38%和41%;与青蒿柏木脑合酶、紫穗槐二烯合酶和一个推测的倍半萜合酶克隆cASC125的一致性为50%，48%和59%。cDNA编码区序列被克隆进原核表达载体pET-30a，并在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达，但过量表达的蛋白主要是以不溶性蛋白形式存在。RT-PCR分析表明此基因在茎、叶和花中表达，在根中没有表达。 用RT/PCR方法从青蒿高产株系001中克隆了amorpha-4, 11-diene合酶cDNA。将该cDNA插入原核表达载体pET3d并在大肠杆菌BL21（DE3）中过量表达。Southern blot分析表明AMS基因在青蒿基因组中至少有3个拷贝。AMS基因组DNA有一个复杂的结构，包含有7个外显子和6个内含子。RT/PCR分析表明AMS基因在叶片、茎和花中表达，而在根中没有表达。 用RACE方法首次从青蒿中克隆了一个1539 bp全长鲨烯合酶cDNA。青蒿鲨烯合酶氨基酸序列与拟南芥、烟草、人类、酵母鲨烯合酶的一致性分别为70%、77%、44%、39%。青蒿鲨烯合酶基因组DNA有一个复杂的结构，包括14个外显子和13个内含子。全长的或C末端截短的鲨烯合酶cDNA被克隆进原核表达载体pET30a并在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达。但在含有全长的鲨烯合酶cDNA的大肠杆菌中并没有观察到预期大小的鲨烯合酶表达，而C末端截短30个疏水氨基酸的鲨烯合酶可在大肠杆菌中过量表达。

低能N+诱导拟南芥突变体DNA变异的研究

低能离子束的诱变效应首先由我国科学家发现并将其广泛应用于育种实践，但是离子注入诱导DNA变异的研究结果主要是以微生物离体质粒DNA为材料获得的，以活体高等生物为材料的研究尚未见报道。 我们以30 keV N+（注入剂量80×1015 ions/cm2）注入拟南芥后获得的稳定突变体T80II为实验材料，对突变体植株进行了RAPD标记，并将T80II和对照部分RAPD特异条带进行克隆测序和DNA序列分析。结果显示，在可分辨的总计397个RAPD条带中，T80II株系中有52个条带表现出差异，包括条带的缺失和增加，条带变异率为13.1%;克隆的T80II序列中，平均每16.8个碱基出现一个碱基变异位点，表现出较高频率的碱基突变。碱基突变的类型包括碱基的颠换、转换、缺失、插入等。在检测到的275个碱基突变中，主要是单碱基置换（97.09%），碱基缺失或者插入的比例较小（2.91%）。在碱基置换中，转换的频率（66.55%）高于颠换的频率（(30.55%)。此外，构成DNA的四种碱基均可以被离子束辐照诱发变异，而且每一种碱基都可以被其它三种碱基所替换，但是胸腺嘧啶（T）的辐射敏感性要高于其它三种碱基。通过分析突变碱基周边序列，对低能N+离子注入拟南芥突变体引发的碱基突变热点进行了讨论。 另外，低能离子注入诱变获得的突变体特异表达基因的克隆方面也没有报道。我们以突变体T80II作为实验材料，用PCR增效的减法杂交技术构建了T80II特异表达的cDNA减法文库，克隆特异表达的cDNA片段，并对其中1个与14-3-3 protein GF14 nu (GRF7) gene有部分同源性、长712 bp的cDNA片段进行了讨论。我们的研究证明通过减法杂交技术克隆低能离子诱发的突变体特异表达的cDNA是可能的，这为低能离子注入技术在分子生物学上的应用开辟了一个新思路。

小麦春化相关基因元件克隆分析与小麦矮化突变体的研究

一、 春化相关基因全长cDNA序列及其启动子的克隆与分析研究 通过建立小麦（Triticum aestivum. L. cv Jingdong No.1）胚芽春化cDNA文库，以春化相关基因VER2的3’端序列为探针，筛选获得全长1195 bp cDNA序列，它编码300个氨基酸。在VER2中存在植物疾病抗性反应蛋白和茉莉酸诱导凝集素两种蛋白的结构域。另外在VER2蛋白中存在核定位信号和多种磷酸酶的作用位点，VER2可能参与了多种调控途径。 以VER2基因的cDNA为探针，利用改进的池式PCR以及高密度膜杂交筛选的方法，从小麦TAC基因组文库中获得41,788 bp的基因组克隆，该序列含有11个基因，其中VER2基因位于第三个基因。VER2基因组序列含有3个内含子，4个外显子与cDNA序列100%同源。通过对转录起始点和转录终止点的分析，进一步证明从cDNA文库筛选得到的VER2基因为全长序列。 对VER2基因的上游启动子区域进行分析，发现基因上游启动子区存在三个小的重复序列，每个片段有482 bp，另有两个较大的重复序列，每个片段有2,161 bp。对上游2.8 kb启动子区（不含重复序列）的响应元件分析，其包括ABA响应元件（ABRE）、茉莉酸甲酯响应元件（Me-JARE）、胚乳特异性表达元件、参与淀粉酶合成的元件以及存在类似GA响应元件（ATAACAAAC）如ATAACATAC等等。根据VER2基因上游6 kb序列结构特点，将VER2启动子区域进行缺失突变形成10个片段，分别以GUS和GFP为报告基因构建成瞬间表达载体和植物表达载体等四类质粒。通过基因枪方法将最大片段（6 kb）驱动GFP报告基因的瞬间表达载体转入经春化处理或未春化处理的小麦幼叶中，结果发现GFP在春化处理的幼叶中表达，而在未春化处理的幼叶中不表达，说明VER2基因的启动子驱动基因转录受春化处理调控。 二、 小麦矮化突变体的研究 通过对小麦矮化突变体gaid遗传生理分析发现该突变体为半显性阻断GA信号途径，由此发现在赤霉素信号途径中，α-淀粉酶的诱导一定程度上通过某些与株高相关的基因控制。突变体gaid呈现对高浓度的脱落酸更敏感，当ABA浓度达到10-6M时，突变体的生长几乎完全受到了抑制，而野生型的生长需要ABA浓度达到10-5M时才能完全受到抑制。通过突变体gaid对乙烯等抑制型生长调节剂的响应实验研究，首次提出GA调控植物伸长生长存在两条信号途径，即GA基础水平信号途径（GA basal level signaling pathway）和GA正常水平信号途径（GA normal level signaling pathway），而乙烯以及高浓的GA合成抑制剂（如PAC）是通过第一条途径（GA基础水平信号途径）起作用。光形态建成中对植株生长的抑制作用存在独立于GA的信号途径。 突变体gaid的根系在强光照（63.5 Es-1m-2）和培养基内（低氧）的生长条件下，表现出弯曲、变短、加粗等异常性状，而随光照强度的减弱，这种根系异常生长的表型也减弱，在暗培养中则完全消失，但无论在哪种环境条件下，相对野生型对照而言，突变体的种子根短、侧根少。低浓度的ABA（10-8M）可以恢复突变体gaid根系在强光低氧条件下的正常生长发育。然而利用IAA及其极性运输的抑制剂（TIBA）、乙烯生物合成前提物（ACC）及合成抑制剂（AOA）处理突变体gaid，并没有发现突变体根系的生长发育得到恢复。 突变体gaid可能是一个新的属于小麦GA信号途径中的负调控基因（GAID）发生了突变或超表达，导致其负调控作用增强，呈现半显性的矮化突变。在与另一已知小麦GA信号途径中的负调控基因RHT的关系研究上发现，GAID可能对RHT蛋白磷酸化后的降解途径起抑制作用。通过双向电泳发现突变体gaid与野生型对照（京冬1号）在生长过程中存在差异蛋白，这将有助于对GA信号途径分子机理的深入研究。

小麦茉莉酸诱导基因的克隆及表达模式分析

茉莉酸（JA）以及茉莉酸甲醋（MeJA）统称为茉莉素（jasmonates），是由 亚麻酸起始合成的一类具环戊酮基的广泛存在于植物界的类激素，它们对于植物 的发育和抗逆性等都起着重要的作用。为了进一步的了解茉莉酸的生物合成以及 功能，我们对”冬小麦中的茉莉酸生物合成、低温环境中的作用及对拟南芥开花时 间的影响等方面进行了研究。 为了方便分离茉莉酸诱导的基因，我们构建了一个高质量的小麦茉莉酸诱导 文库。未扩增时滴度为3一4xlo6pfu/ml，平均插入的长度为1.2kb。TaJIP是一个 JA诱导的基因，进一步的Northern分析发现它亦可以被低温诱导表达，这给了 我们一个提示，JA信号系统可能参与了植物对低温反应的过程。当外源施加JA于拟南芥时，无论是春化处理或者没有春化处理，无论是C24 还是Col生态型，开花时间都有所增加，而且进一步的NOrthern实验证明，这 种外源的JA的处理延迟开花的现象是与开花抑制基因FLC表达水平的增加相平 行，与长日促进途径中的主效基因CO的表达水平无关。这种JA处理延迟开花的 现象与FLC表达水平增加相平行的现象，表明了JA有可能是通过作用于FLC， 使它的表达水平增加来延迟开花。 Aos（Allene oxide synthase）是茉莉酸合成的脂氧合酶途径中的第一个关 键酶。我们克隆了小麦中的该基因并作了表达分析。它的开放阅读框（ORF）约 1410 bp，编码的多肤长约470个氨基酸，推测其蛋白分子量为51.9 kDa，pI为 9.39。Southern分析表明其在基因组中的拷贝数为3个。其mRNA表达可被外源 的JA强烈的诱导。处理10小时达到高峰。RNA原位杂交表明，该基因在幼苗 中组织特异表达，主要集中在幼叶，特别是在维管束区域，与大麦中的AOS不 同的是，它还在胚芽鞘和茎尖的维管束区域有强烈的表达信号。原位杂交还显示 La3十并不能阻断JA对它的诱导表达

植物对重金属砷和镉胁迫适应的分子机理初探

随着现代工业的发展，重金属污染日趋严重。重金属污染引发的环境和健康问题在许多国家都有报道，我国的重金属污染状况也不容乐观。土壤和水体中的重金属污染可以通过食物链进入人体，对人类健康造成很大的危害，如诱发癌症 和畸胎等。 植物修复是一种利用植物对重金属或有机污染物的超富集能力清除或减低污染的环境生物技术。植物修复的生物学机制的研究为这项技术走向实用化奠定了基础。植物修复近期的进展可能来自于可更有效地富集重金属的植物品种的选择、土壤条件的改善等;但长远看来，植物修复技术的巨大进步将取决于新的可更好地抵抗重金属或降解有机毒物的基因的鉴定和克隆，并通过转基因技术创造一批新的植物品种，如可迅速大量富集重金属的高生物量的用作环境净化的植物，以及可排拒重金属吸收的粮食、蔬菜和水果等作物。 本研究针对砷污染的植物修复机制，以超富集砷的凤尾蕨属植物——蜈蚣草为试材取得了如下进展： 1． 以从砷污染地区采集的蜈蚣草（Pteris vittataL．）为植物材料，利用抑制消减杂交(SSH)分离了经砷诱导处理与其对照间表达有差异的cDNA片段，以期得到与砷富集密切相关的基因。其中筛选到的一个cDNA片段与ABC transporter (ATP-binding cassette transporter)有较高的同源性。通过RACE方法对该基因进行了克隆，并进行了初步的结构和功能分析。结果表明所获得的PvABCTl (Accession No. AY496966)为一全长cDNA，长度为2165 bp，其中开读框架为1791 bp，编码597个氨基酸。该基因所编码的蛋白中含有2个ABC transporter特性结构域，1个ATP-binding cassette和2个ATP/GTP结合位点(P-loop)，没有明显的跨膜区。 2． 对蜈蚣草在砷胁迫下PvABCT1基因的表达模式进行了研究。转录水平分析表明PvABCT1的表达受砷的诱导。进一步通过PvABCTl-GFP融合基因在洋葱细胞中的表达进行亚细胞定位，结果显示该基因可能定位于细胞质中。 3． 为了研究所克隆的PvABCT1基因的功能，本研究构建了PvABCT1的酵母表达载体，把该基因转入因ACR3基因缺失而对砷敏感的酵母突变株。酵母功能互补实验表明PvABCT1不仅不能与ACR3基因功能互补，反而使酵母对砷的敏感性增加，同时酵母细胞中的砷含量较未转化的酵母细胞增加。即在转入PvABCT1后，酵母细胞吸收了更多的砷。这暗示该基因与蜈蚣草中砷的高吸收有关。 针对食品重金属污染问题，本研究探讨了减低蔬菜对重金属吸收的方法及其 作用机理，取得了如下进展： 1．研究了钙离子和镧离子对镉离子胁迫下生菜种子萌发和植株生长的影响，结果表明在种子萌发时外施4 mM CaCI2或0.04 mg/L La(N03)3均可提高生菜对重金属镉的抗性。 2．通过检测0.5 mM CdCl2胁迫下生菜植株中的镉含量以及外施钙离子或镧离子后相应的镉含量，发现4 mM CaCl2可以增加镉胁迫下生菜植株中镉的积累;而0.04 mg/L La(N03)3可以降低镉胁迫下生菜植株中镉的积累。 3．对生菜中植物络合素合酶基因进行了克隆，通过RT-PCR分析以及植物络合素( phytochelatins，PCs)的检测，探讨了外施钙离子或镧离子对镉胁迫下生菜植株中植物络合素合酶基因在转录水平的表达量、植物络合素含量以及镉的积累三者之间的关系。结果表明：4 mM CaCl2可以提高镉胁迫下生菜植株中植物络合素合酶基因在转录水平的表达以及植物络合素的含量，增加镉的积累;而0.04 mg/L La(N03)3虽然同样可以提高植物络合素合酶基因在转录水平的表达以及植物络合素的含量，却能降低镉胁迫下生菜植株中镉的积累。这暗示外施钙离子可以促进用于重金属污染环境修复的植物对重金属的吸收，而外施镧离子可以用于降低叶菜类蔬菜中重金属镉的积累。

一种小G蛋白TaRAN1在植物细胞周期和发育过程中的功能研究

　　小G蛋白作为信号转导中重要的分子开关， 进化相当保守，与许多不同的调控因子和效应器分子相互作用，产生细胞功能的多样性。近年来，人们不断发现植物中小G蛋白家族的新成员，也不断揭示小G蛋白的新功能，许多植物特有的信号途径和功能需要小G蛋白这个重要的分子开关来完成，使它越来越成为人们研究的热点问题。但是，有关植物中Ran GTPase及其编码基因的研究工作报道很少，对与之相互作用的调控蛋白研究进展也刚刚开始。 　　TaRAN1 (AF488730) 是小麦来源的Ran同源蛋白编码基因，全长1055 bp, 编码221个氨基酸，它在植物发育过程中的功能还没有任何报道。本论文在验证了它是小G蛋白Ran家族的成员后，从分子水平上还发现它在植物细胞周期调控、对生长素以及胁迫应答信号转导过程中都起着重要作用，这也说明了它可能作为信号转导过程中重要的转换因子，参与了很多细胞的基本生理过程。 　　利用原核表达系统及亲和色谱的方法纯化了TaRAN1融合蛋白，并用放射性标记的GTP和竞争实验证实了它具有特异的GTP结合活性。TaRAN1的转录产物在小麦幼茎和花芽等分生组织活动旺盛的器官表达较多，而在老叶中表达较少。利用洋葱表皮瞬时表达系统分析表现，TaRAN1蛋白主要定位于细胞核，但其没有典型的核定位信号。 　　细胞周期一直是生物学领域中的热门问题，人们虽然在动物细胞中取得了很大进展，但在植物细胞中的研究远落后于动物。裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）是研究细胞形态和细胞周期的良好系统，利用此系统发现超表达TaRAN1的酵母细胞表现出许多新的细胞学表型，例如G2细胞周期延滞、染色体对紫外线敏感、细胞超长或多隔细胞的出现等;反义表达TaRAN1的酵母细胞呈近圆型、具有高度凝集的核并且生长速度缓慢、核质混合和无核细胞的数目明显增加。流式细胞仪检测实验也证实其细胞周期的异常。这些结果推测TaRAN1蛋白可能参与细胞周期的有丝分裂过程和发育的调控机制，并且在维持染色体结构稳定和完整性方面起着重要的作用。通过免疫荧光实验观察表明，超表达转基因酵母的微管多呈异常的狭小扇形结构，反义表达TaRAN1的酵母微管不能形成丝状结构，推测TaRAN1还可能参与微管（包括纺锤体）的结构形成过程。最后，我们用超表达TaRAN1的转基因拟南芥和水稻也证实了它的功能，其生长点表现出分生组织增多的原基、根生长点的有丝分裂指数有所改变、出现异常的细胞分裂时相等有关细胞周期异常的现象，更进一步说明了TaRAN1确实参与着细胞周期的调控过程，推测其与细胞周期从G2期进入M期的过程有关。 　　TaRAN1基因受IAA的诱导表达，且随着浓度的增加表达量增强。超表达的TaRAN1植株（包括拟南芥和水稻）的根表现出对外源生长素异常敏感，侧根显著变少，地上部分表现出生长素过量的表现型，顶端优势减弱，分蘖增多，生长周期延长等。HPLC测定转基因植物的IAA含量，明显高于对照。所以，TaRAN1可能还参与了复杂的生长素信号转导过程。TaRAN1基因还受各种胁迫处理的诱导表达，并且超表达植株对胁迫的忍受能力有明显提高，这说明TaRAN1还参与了胁迫信号应答的相应机制。Ran蛋白这些新功能目前还未见到其它报道。

羊草生殖生物学研究

羊草 (Leymus chinensis (Trin.) Tzvel. ) ，隶属禾本科赖草属，是欧亚大陆草原区东部的重要草原建群种之一。羊草是牧草之王，属于我国有比较优势的战略性生物资源，对我国北方畜牧业发展以及保护生态环境均具有重要作用。 羊草较弱的有性生殖特性限制了其应用，本文从实验生物学角度，研究了羊草有性生殖的基本特点，并试图通过现代分子生物学手段探讨自交不亲和性的有关机理。本论文的主要结果如下： 1. 实验发现羊草具有自交不亲和性。以6 个羊草居群为材料，测定得知开放授粉时的结实率在6.5% - 56.7%之间，自交时结实率为0.6% - 4.3%，差异极其显著; FDA 染色法检测结果显示羊草成熟花药中有活性的花粉达到92.2% 以上;在发育时间顺序和空间结构上，羊草雌蕊、雄蕊适于异花和自花授粉;花粉柱头亲和性实验表明，自交花粉只有5.5%-11.7% 是亲和的，杂交花粉亲和率达到了60.0%-84.8%，说明自交花粉在柱头上萌发受到抑制，其次，荧光显微镜还观察到“不亲和花粉”在进入柱头后生长缓慢，或停止延伸。 2. 初步确定羊草自交不亲和性具有配子体型遗传特点。以不同居群羊草杂交后的姊妹系作为实验材料，观察到自交组合的亲和率变幅为0 % - 6.9 %，杂交组合的亲和率具有连续性变异和变幅较宽的特点（47.5％ - 96.0 %），且正反交结果具有一定的一致性（88.2％），表现出配子体遗传特性。 3. 羊草居群内结实率存在一定变异。以羊草单株为单位分别进行自交、随机互交和开放授粉，结果显示三者的平均结实率分别为4.6%，18.1% 和35.7%，株间的变异系数分别为33.4%，21.2%和17.1%，这些株间的变异均达到统计上的显著差异;同时羊草自交、杂交和开放授粉之间具有一定的相关性，显示羊草的这种株间差异与株系本身的生理特性相关。 4. 分离了羊草硫氧化还原蛋白 H 基因(ThioLc)并对其功能进行了分析。克隆了ThioLc全长和cDNA序列。序列分析结果显示，DNA全长2257 bp，包括3 个内含子和4 个外显子，与水稻Thio h 的cDNA 序列相比，具有 32.0% 的同源性;Southern 杂交显示 ThioLc 在羊草基因组中是单拷贝;Northern 杂交显示 ThioLc 在羊草根、茎、叶和幼小的雌蕊中没有表达, 在成熟雌蕊和幼小的花粉中微量表达, 在成熟花粉中大量表达，说明分离的羊草硫氧化还原蛋白H 基因具有花粉特异表达特点。 5. 原核表达的ThioLc 蛋白具有较高的催化活性。构建了ThioLc 基因的原核表达载体，检测证明ThioLc基因在大肠杆菌中正常表达;提取表达蛋白，纯化，用胰岛素和二硫苏糖醇反应体系进行硫氧化还原蛋白的催化作用反应，结果表明表达的蛋白具有催化活性。这一结果为进一步搜寻靶向蛋白和研究该蛋白的结构、功能和作用方式奠定了基础。

植物络合素合酶基因的功能分析及其应用

植物络合素（phytochelatins，PCs）是含有γ-Glu-Cys重复结构的小分子多肽，其结构通式为：（γ-Glu-Cys）n-Gly（n=2-11）。植物络合素（PCs）由植物络合素合酶（PCS）催化谷胱甘肽（GSH）聚合而成，能够络合重金属离子而具有解毒功能，这是植物解毒重金属胁迫的重要机制之一。本文克隆了来源于重金属抗性植物绊根草（Cynodon dactylon cv Goldensun）的植物络合素合酶基因，通过基因工程手段使其在烟草中过量表达，得到了一些有望用于植物修复（phytoremediation）的工程植株。同时，在水稻（Oryza sativa）种子中利用RNAi技术抑制植物络合素合酶基因的表达，以降低重金属离子在人类最重要的粮食作物水稻的籽粒中的积累。 1. 通过RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）方法从抗性植物绊根草中克隆了植物络合素合酶基因CdPCS1，其1515 bp的读码框编码一个含505个氨基酸的蛋白质，蛋白质序列分析表明它具有植物络合素合酶的结构特征，同时还具有磷酸化位点和亮氨酸拉链结构。 2. CdPCS1基因可以互补对铜和镉离子敏感的酵母突变株ABDE-1（cup1Δ）中缺失的金属硫蛋白基因CUP1的功能，也可以互补对砷离子敏感的酵母突变体FD236-6A（acr-3Δ）中的离子外排载体基因ARC3的缺失。 3. 将CdPCS1转入烟草，共获得过表达CdPCS1的烟草44个株系，其中融合GFP的株系16个。对T0代的转基因植株的PCs含量以及重金属抗性和吸收能力进行了分析，其中抗性实验表明，在300μmol/L 的Cd2+离子胁迫11天之后，野生型植株的叶片出现斑点状坏死，而两个转基因烟草株系S6和K49的植株没有出现受伤害症状。在100μmol/L的CdSO4处理一周后，转基因植株中的PCs含量比对照有不同程度的提高，最多提高了2.88倍。当用300μmol/L Cd2+处理9天再用600μmol/L Cd2+处理2天后，Cd的积累量比野生型植株增加了2倍多;用50μmol/L As3+处理7天再用100μmol/L As3+处理2天后，转基因植株对As的积累量最多增加了3倍多。说明转入绊根草PC合酶基因的烟草增加了植物络合素的合成，并由此增加了对镉离子的抗性以及对镉离子和砷离子的积累。 4. 对转基因烟草中的CdPCS1进行了亚细胞定位研究。在激光共聚焦显微镜和荧光显微镜下分别用转基因烟草叶片组织和叶肉细胞原生质体观察融合GFP的CdPCS1，结果表明融合蛋白定位于细胞核中。 5. .利用RNAi技术抑制水稻种子中植物络合素合酶基因的表达，共获得39个转基因株系。其中35个株系为种子特异性ZMM1启动子驱动OsPCS1基因的RNAi，其余4个株系由组成型的Ubiquitin启动子驱动。RT-PCR的分析结果表明：一个由ZMM1启动子驱动的RNAi转基因水稻株系的种子中，OsPCS1的mRNA水平比对照中的下降了一半。

大蒜重金属抗性基因的克隆及其功能分析

金属硫蛋白（metallothionein，MT）和植物络合素（phytochelatin，PC）是植物中能够与金属离子结合的两大类多肽。二者均富含Cys，但前者是mRNA的编码产物，后者是酶促反应的产物，植物络合素合酶（PCS）则是合成PC的关键酶之一。目前已发现许多植物同时存在金属硫蛋白基因和植物络合素合酶基因。研究重金属胁迫下这两类基因的表达对了解植物的重金属抗性的分子机制具有重要意义，同时还可以为培育能用于植物修复的品种提供新思路。 本论文从大蒜中克隆了一个type 2 MT基因，命名为AsMT2a，将其在大蒜中的表达模式与大蒜的植物络合素合酶基因（AsPCS1）进行了比较，并对二者的过表达转基因拟南芥的重金属抗性进行研究。其主要结果如下： 1． AsMT2a基因全长525 bp，编码79个氨基酸，其中有14个Cys 残基。 推测的氨基酸序列分析表明其Cys的位置和数目与来自其它植物的type 2 MT蛋白的完全一致。 2． RT-PCR的结果显示，大蒜根部AsPCS1的表达在Cd处理的短期（1 hr）内迅速增强，同时PCs含量也大幅度增加。但AsMT2a的表达在Cd处理10 hr后才有明显的增加。说明AsPCS1可能在植物对重金属的急性解毒方面起主要作用，而AsMT2a则在植物对重金属长久耐性中的离子平衡方面起更大作用。暗示在大蒜暴露于Cd胁迫的不同时期AsPCS1和AsMT2a基因可以互相协调而对重金属胁迫作出反应。此外，在不同胁迫条件下，AsPCS1和AsMT2a的表达模式不同，其中Cd、As和热激可以促进根中AsPCS1的表达和PCs的积累。 3．将AsPCS1和AsMT2a转入对砷和镉敏感的酵母菌株 FD236-6A中，RT-PCR的结果显示这两个基因均可在酵母中稳定表达，对转化子的重金属抗性实验表明这两个基因均可提高转化子对砷和镉的抗性。 4．将AsPCS1和AsMT2a 置于 CaMV 35S启动子下转入拟南芥中，RT-PCR结果表明，这两个基因均可在拟南芥中表达。有趣的是，AsPCS1在拟南芥中存在两个转录本，且二者均具有完整的ORF，其推测的氨基酸序列相差38个氨基酸。说明部分AsPCS1在拟南芥中经过了精确的剪切和拼接过程，但其机制尚不清楚。 5．在Cd 胁迫下，AsPCS1的超表达拟南芥的生长好于野生型植株，主要表现在转基因拟南芥的根较长，根数目较多;但在As胁迫下AsPCS1转基因植株与野生型植株没有明显的差别。与此不同的是将AsMT2a转入拟南芥后，转基因植株的As抗性明显增强，同样表现在根长度和根数目上。进一步将AsPCS1和AsMT2a同时转入拟南芥进行超表达，在Cd胁迫下，转基因植株的生长好于野生型植株，且种子萌发率也较高。 6．Cd和As胁迫下，AsPCS1过表达植株的PCs含量增加，同时Cd和As的积累量也明显增加，其中Cd胁迫下Cd含量增加最多，平均比野生型对照增加4倍;而As胁迫下As含量比野生型对照增加1.2倍。在Cd和As胁迫下，AsMT2a过表达植株的Cd和As积累量与野生型相比分别增加1.4倍和0.8 倍。双价基因AsMT2a +AsPCS1过表达植株的 Cd 积累量是野生型的5.8倍，是AsMT2a过表达植株的2.4 倍，是AsPCS1过表达植株的1.2倍。 在克隆AsMT2a的同时，我们还从大蒜中克隆到了一个金属硫蛋白基因家族的新成员，命名为AsMT2b，并对其功能进行了初步探讨。主要结果如下： 1．AsMT2b 全长520 bp，其开读框架为243 bp，编码80个氨基酸，其中含有15个Cys 残基。对推测的氨基酸序列分析表明AsMT2b的N端和C端domain内，Cys的数目和排列方式与其它type 2 MT蛋白明显不同。 其N 端domain内的结构为CXXC——CXC——CXC——CXCC，C端domain 内的结构为CXXC——CXC——CXC。暗示AsMT2b 可能具有与其它MT不同的生物学功能。 2．在较低浓度Cd（200 µM）胁迫下，AsMT2b的表达量随着处理时间（24 hr内）的延长而降低，但随着处理浓度的升高（500 µM）和处理时间延长（48 hr），其表达量又逐步增强，说明AsMT2b可能在胁迫强度增大到一定值时方起作用。 3． 将AsMT2b转入对Cd和As敏感的酵母菌株FD236-6A中，发现AsMT2b对酵母As抗性的提高贡献不大，但可明显提高酵母对Cd的抗性。 4．对AsMT2b的超表达拟南芥的重金属抗性分析表明，与野生型植株比较，转基因植株具有较强的Cd抗性，表现在Cd胁迫下，种子的萌发率较高，根较长，侧根数较多。但在As胁迫下，转基因植株的生长和野生型没有明显差异。可以看出，转AsMT2b的拟南芥对重金属的抗性不同于转AsMT2a的植株，前者的抗Cd性较强，而后者的抗As性较强。 5． Cd胁迫下，AsMT2b过表达拟南芥的Cd含量明显增加，平均比野生型对照植株增加70％，但各个株系的增加幅度不一致。 另外，我们还对CdCl2胁迫下，大蒜幼苗中镉的积累及氧化胁迫和抗氧化能力的变化进行了研究。结果表明在CdCl2 胁迫下，大多数Cd在根部积累，而只有少量的Cd积累于叶片中。5 mM 和10 mM CdCl2 抑制SOD和CAT的活性，但随着处理时间的延长，二者的活性回复到对照水平或高于对照。在CdCl2胁迫下，POD的活性明显增强，同时脂质过氧化产物积累。这些结果说明镉胁迫下，植物细胞中氧化胁迫加剧，而抗氧化酶活性的增强是植物对次生氧化胁迫的一种适应策略。 综上所述，在重金属胁迫下， AsPCS1和AsMT2a之间及AsMT2a和AsMT2b之间均表现出明显的协调反应。这种协调反应可能是植物维持细胞内离子稳态的机制之一。而重金属胁迫下，过表达AsPCS1，AsMT2a或AsPCS1+AsMT2a的拟南芥体内的重金属含量明显增加，表明这些基因可望用于重金属污染土壤的植物修复中。