水稻冷诱导基因OSCOIN的功能分析

对于双子叶模式植物拟南芥在逆境应答中的机理研究已取得了很大的进展，但在单子叶植物中的相关研究相对滞后。在单子叶植物水稻中仅仅报道了一些转录因子类基因以及与代谢有关的酶类基因，但与低温有关的分子伴侣、离子通道和载体等类基因的研究少见报道。 受低温诱导的水稻基因OsCOIN（AK104280）来自水稻10K cDNA芯片，它的cDNA全长有1593bp，开放阅读框内为1089bp，编码363个氨基酸，蛋白质的计算分子量42kDa，等电点5.25。在基因组序列中有7个外显子，6个内含子。生物信息分析显示，OsCOIN在第72—106氨基酸间形成一个指环结构域。OsCOIN蛋白没有跨膜区，定位于细胞质和细胞核。通过酵母双杂交实验证明了指环蛋白OsCOIN没有转录活性，故不是转录因子。RT-PCR结果表明，OsCOIN在所选的11种水稻组织中都有不同程度的表达，4C处理0.5h时OsCOIN基因开始较强地表达，持续较强地表达到4C处理48小时，72h时OsCOIN的表达量下降到起始的水平。另外,该基因表达还受ABA和盐诱导。 利用农杆菌介导的转化手段，得到三个OsCOIN超表达株系和六个RNAi株系。RNAi株系分蘖增多、植株矮化。为了分析OsCOIN与逆境胁迫的关系，实验中分析了超表达植株对低温等胁迫的耐性。结果表明，4C处理60h、72h、84h后，所有植株都出现萎蔫，恢复生长两周后超表达植株的存活率(分别为76.2%、71.4％和50％)明显高于野生型的存活率(分别为52.4%、22.2%和14.8%)。超表达OsCOIN水稻中，OsLti6b、OsNAC6和OsP5CS的表达量明显增加，而OsDhn1和OsDREB1a的表达量明显地降低，OsCDPK7和OsLti6a表达水平未受影响。 上述结果表明OsCOIN基因的过量表达抑制了OsDhn1和OsDREB1a的表达，促进了OsLti6b、OsNAC6和OsP5CS的表达。OsCOIN基因参与的低温响应途径与ABA相关，OsCOIN超表达植株不仅能耐低温，而且对盐和干旱胁迫有一定的抗性。

水稻G蛋白偶联受体OSGPCR1功能的研究

水稻是世界上最重要的粮食作物，也是单子叶植物的模式植物，它为全球近一半的人口提供食物，但是低温、高盐、干旱等非生物胁迫，每年都会在全世界范围内造成水稻大面积减产。G蛋白介导的信号途径是传递胞外信号比较保守的作用机制之一。动物细胞对于G蛋白及其受体(GPCRs)的研究已经取得了很大的进展。而植物细胞中对它们的研究刚刚起步。本文从越冬稻低温响应芯片上筛选到一个膜蛋白，它编码一个推测的G蛋白偶联受体(G protein-coupledreceptor, GPCR)，据此我们将其命名为OsGPCR1，并对其进行深入研究。 OsGPCR1的cDNA全长为1407bp，编码468个氨基酸，在蛋白水平上的同源性比较结果显示，该基因与动物中研究的比较多的异源三聚体G蛋白偶联受体(G Protein- Coupled Receptor)同源性达到44%。经过跨膜结构域预测表明OsGPCR1具有9TMs结构，以GFP为标签的亚细胞定位表明OsGPCR1定位在膜上。GTP酶活性测定试验表明，OsGPCR1蛋白能够激活水稻RGA的GTP酶活性，此外，以泛素裂解体系为基础的酵母双杂交实验表明，OsGPCR1能够与RGA相互作用。说明OsGPCR1编码的蛋白是水稻中的一个G蛋白偶联受体。 OsGPCR1的表达受低温、干旱、高盐的诱导，但不受ABA，GA，ACC，IAA的诱导。在『F常生长条件下，OsGPCR1在水稻各器官中均有表达，但强弱有所不同。 在拟南芥和水稻中超表达OsGPCR1都能显著增强转基因植物对干旱、高盐、低温的耐受性。而在水稻中抑制OsGPCR1的表达，转基因水稻呈现出干旱、高盐、低温的敏感性。对转基因拟南芥下游基因的分析表明，超表达OsGPCR1能够在非胁迫条件下激活CBF途径中相关基因的表达。结合OsGPCR1不受ABA诱导的表达模式，我们推测OsGPCR1可能是通过不依赖于ABA这条途径而传递信号的。借助超表达和转反义水稻材料，利用水稻全基因组芯片研究OsGPCR1靶基因的结果表明，不论OsGPCR1基因表达量的降低或上升，都导致大约30%的与转运相关的基因的表达量发生改变。这暗示OsGPCR1可能通过囊泡运输传递胞外信号。此外FM4-64对超表达和转反义水稻幼根细胞染色标记后，OsGPCR1反义抑制水稻细胞内囊泡在细胞两端呈聚集状，即形成“BFA区间”，而超表达OsGPCRI水稻细胞内囊泡呈密集状。这些结果都表明OsGPCR1可能通过调控囊泡运输而将胞外胁迫信号传递进胞内。

太行花TrMADS3基因的结构、功能和进化研究

休眠是温带多年生植物的特性之一。为了适应温带地区寒冷的冬季，多年生植物的分生组织通常在秋末冬初进入休眠状态，这样有利于它们在低温下的存活。因此，温带多年生植物的生长和开花具有季节性。植物的生长发育需要与季节的交替变化同步，才能适应环境，保证繁殖成功。多年生植物通过“生长－休眠－生长”的循环过程适应温带地区寒冷的冬季。休眠既有利于植物存活又可调节开花时间。因此，探索温带多年生植物休眠过程的分子调控机理具有重要的应用价值。 太行花（Taihangia rupestris）是蔷薇科仙女木族的一种多年生草本。它生长在海拔1000到1200米的温带山区。太行花需要两个生长季节才能开花，这一点与模式植物拟南芥、水稻不同。在第一个生长季节花芽诱导，花序发育到秋末冬初时进入休眠状态;过冬花序包裹在叶柄基部，接近土壤表面;到了第二个生长季节，花进一步发育完全，开花结果。休眠过程对太行花花序的存活以及来年的开花时间控制非常关键，对这个过程的调控基因的研究不仅有助于理解太行花休眠的分子机制，还将为其它经济植物在这个方面的研究提供资料。 本研究以太行花为研究材料，从它的过冬花序中分离得到了一个MADS-box基因，分析了它的序列结构、系统发育关系、表达式样和功能，探讨了FLC亚家族基因在太行花这种多年生植物和一年生、两年生植物之间发生的表达功能分化。主要研究结果包括： 1. 从太行花的过冬花序中分离出了TrMADS3基因。氨基酸序列分析结果表明它是MIKCc型MADS-box基因，系统发育分析结果表明TrMADS3与FLC类基因聚在一起。 2. 实时定量PCR和RT-PCR实验显示TrMADS3在冬季休眠期太行花的花序、根、叶中广泛表达。从十月底到一月底的冬季低温期户外太行花植株中TrMADS3表达量比同期温室植株的表达量高，也比夏季户外植株的表达量高。对温室植株进行低温处理能明显上调TrMADS3的表达量，而短光照、干旱、高盐和脱落酸（ABA）处理对TrMADS3的表达影响不明显。 3. 用原位杂交的方法分析了TrMADS3的表达式样。营养器官中，TrMADS3在营养顶端分生组织、叶原基、幼叶边缘细胞中表达量高;生殖器官中，TrMADS3在侧生分生组织、花序原基、花原基、幼苞片、萼片原基、花瓣原基、雄蕊原基、心皮原基、发育中的雄蕊、心皮中表达量高。TrMADS3的表达模式反映了TrMADS3调控营养生长和不同阶段的花序、花发育过程。 4. TrMADS3在拟南芥中异位表达不影响拟南芥开花时间。在高盐和干旱胁迫条件下，TrMADS3异位表达能够明显提高转基因拟南芥后熟种子的萌发率。 5. 建立了太行花的组培体系。 综上所述，TrMADS3属于FLC进化支，这一亚家族基因还未在多年生植物中报道。TrMADS3在太行花休眠期表达量很高。在实验控制条件下，一至两周低温能够明显促进TrMADS3表达量的上调。低温处理后回到生长温度的太行花在一月内依然保持较高的TrMADS3的表达。原位杂交实验显示TrMADS3在营养和生殖分生组织中表达量高。TrMADS3在拟南芥中异位表达促进后熟种子在高盐和干旱胁迫下萌发。因此，我们推测TrMADS3具有响应低温调节太行花休眠期营养和生殖分生组织活性的功能。在一、二年生植物中分离的FLC-like基因响应春化作用，具有抑制花芽诱导的保守功能，这些基因在营养器官中表达，受春化作用调节，对应一、二年生植物的成花诱导受春化作用促进的过程，但TrMADS3在太行花营养和生殖器官中均表达，对应太行花花芽诱导后营养和生殖器官均进入休眠状态的生理特性，因此，我们推测FLC-like基因有可能在太行花这种温带多年生植物和一、二年生植物之间发生功能分化。

水稻AP2/EREBP转录因子基因OsDRE和OsRAF的功能分析

AP2是一个大的转录因子家族，因其成员含有一个60-70 个氨基酸残基的保守结构域即AP2结构域而得名，它们的功能涉及植物花的发育以及植物对生物或非生物逆境的应答反应。根据它们所含的AP2 结构域的数目，这个家族可分为AP2亚家族和EREBP 亚家族。 AP2亚家族成员含两个AP2结构域，EREBP 亚家族成员含一个AP2结构域。一般来说，AP2 亚家族的成员主要参与植物发育过程的调控;EREBP 亚家族成员则主要参与对逆境的应答反应。按照它们响应外界刺激的类型和AP2结构域中结合顺式作用元件的核心氨基酸的不同，EREBP亚家族又可分为ERF和CBF/DREB两大类群，ERF 类主要响应生物类逆境的诱导，CBF/DREB类则响应干旱、低温等非生物胁迫的刺激。 根据AP2保守结构域搜索，水稻基因组中一共有147个AP2/EREBP成员，但其中功能得到证实的还非常有限。为了解更多AP2基因在植物生长发育过程中的功能，我们先从水稻基因组数据库中搜索到含有AP2/EREBP 结构域的推测基因序列，选择其中40个扩增并成功扩增出31个，将这些DNA片段点在尼龙膜上，然后用水稻叶片cDNA 作模板标记探针，与固定在膜上的推测基因杂交。杂交结果作为选择基因进行功能分析的重要依据。 OsDRE就是我们选择进行研究的一个表达较强的基因。首先，通过RACE 克隆得到OsDRE 的cDNA全长 1589bp，它编码318个氨基酸。Blast 搜索和保守结构域序列比对分析以及进化树分析显示它是一个新的ERF 基因。RT-PCR分析表明该基因在水稻各种组织中表达量比较一致，而且，OsDRE 既不对植物生长物质如乙烯，水杨酸（SA），茉莉酸甲酯（MJ），脱落酸（ABA），赤霉素（GA3），油菜素内酯（BR）的诱导起反应，同样也不响应环境因子如低温、干旱条件的处理。这些结果说明OsDRE是一个不响应胁迫相关因素的诱导的、组成型表达的水稻基因。用OsDRE的非保守区域构建的RNAi 载体转入水稻后未能使转基因水稻产生异常表型，然而，OsDRE在水稻和拟南芥中的过量表达都导致转基因植物出现植株矮小、开花延迟、生长周期延长以及育性降低等表型，说明OsDRE对生长和发育的影响在水稻和拟南芥中是一致的。 基于以上原因，我们选择在遗传分析方面有明显优势的拟南芥作为材料，对OsDRE基因功能进行研究并得出以下结论：（1）瞬时表达和随后的过量表达证明OsDRE定位于细胞核中，过量表达OsDRE引起转基因植株的生长周期变长、抽苔时间延迟和抽苔时莲座叶的数量增多;（2）过量表达OsDRE通过一种不影响细胞数量的方式抑制了细胞的膨胀从而导致植物器官以致整个植株变小，而且，在此过程中部分器官的形态也受到了影响;（3）OsDRE过量表达能激活已知位于乙烯信号途径下游的基因表达并且转基因植株幼苗在黑暗中出现下胚轴及根缩短变粗的现象，提示OsDRE 可能部分参与了乙烯信号途径下游的反应。 除此之外，我们还初步分析了另一个EREBP基因，并将其命名为OsRAF。氨基酸序列分析表明该基因与大麦的RAF 基因在蛋白水平上相似性最高。Northern 杂交结果进一步显示，与RAF 一样，OsRAF 也是根中优势表达的基因，并且它的表达量在乙烯或低温的诱导下增加。对转基因植株的观察和瞬时表达表明OsRAF 定位于细胞核中。 综上所述，对水稻基因OsDRE 和OsRAF的分析表明， OsDRE是一个新的ERF基因，它不受乙烯等因素的诱导并且过量表达该基因导致转基因植株出现细胞膨胀受到抑制等一系列的表型。另外，OsRAF在水稻根中优势表达并受乙烯和低温的诱导，目前，与之相关的功能研究正在进行。

复苏植物牛耳草干旱诱导的ACC氧化酶及乙烯调控的引导蛋白基因的克隆、表达与功能分析

本文以耐旱的牛耳草(Boea hygrometirica)为材料，研究了乙烯合成关键酶之一——ACC氧化酶编码基因（BhACO1）在干旱复苏过程中的诱导表达及其编码蛋白的酶活，分析了乙烯在干旱复苏过程中的积累及其对叶片复苏能力的影响和对干旱诱导基因的调控，探讨了一个受乙烯调控的干旱诱导的引导蛋白编码基因（BhDIR1）的表达及其功能。 利用cDNA微阵列技术从牛耳草干旱2h的叶片中得到一个ACC氧化酶基因片段，经5’-RACE得到全长cDNA，命名为BhACO1。BhACO1包含317个氨基酸，与其它植物中的ACC氧化酶具有80%左右的序列相似性。BhACO1基因受乙烯和干旱诱导、但ACC氧化酶抑制剂氯化钴可抑制其干旱诱导表达。BhACO1基因受ABA、2,4-D、SA、H2O2、CaCl2、EGTA及热害和盐害的诱导，但不受冷害诱导。原核表达的GST-BhACO1融合蛋白在体内体外均表现出ACC氧化酶的活性，而过量表达BhACO1的转基因植物的蛋白提取物也表现出较野生型更强的ACC氧化酶活性。 乙烯在牛耳草叶片干旱复水过程中随着时间延长而逐步积累。外源乙烯可诱导叶片黄化，但不影响叶片在复水后的复苏能力;氯化钴处理可部分地抑制乙烯合成而降低牛耳草叶片在干旱过程中乙烯的释放量，同时导致叶片失去复苏能力。与对照相比，氯化钴处理的叶片在干旱时仍可维持较低的离子渗漏水平，但复水后发生大量离子外渗，表明细胞膜完整性也遭到破坏;光系统ІІ活性下降程度在干旱时与对照相似，但复水后完全丧失。 乙烯诱导牛耳草干旱响应基因BhDohb561，BhLEA2和BhDIR1的表达，但不影响牛耳草干旱响应基因BhCML1，BhGRP1，BhSGP和BhLEA1的表达。除BhLEA1外，上述基因在干旱过程中的诱导表达均可被氯化钴预处理所抑制，尤其是BhSGP最明显。 BhDIR1在牛耳草干旱复水过程中mRNA明显地积累，乙烯、ABA、CaCl2、EGTA、H2O2、SA和热害、冷害、盐害都可诱导其表达。BhDIR1编码一个199个氨基酸的小分子量蛋白质，与松柏等植物中发现的可能参与木质素合成的引导蛋白具有约20-30%的序列相似性。与其它引导蛋白相同，BhDIR1在N’端包含一个外泌的信号肽，GFP定位分析表明BhDIR1定位于细胞膜和壁上。 上述结果表明，乙烯在牛耳草叶片耐脱水复苏反应中有不可或缺的作用，而ACC氧化酶所催化的反应是干旱诱导的乙烯合成中的关键步骤。氯化钴预处理通过抑制干旱过程中的乙烯合成，影响一系列基因的干旱诱导表达导致叶片在生理水平和细胞水平上造成了损伤，或是使牛耳草失去了在复水过程中原有的修复能力而无法恢复生命力。BhDIR1作为乙烯调控的下游靶基因之一，可能通过调控木质素的单体间的连接方式而改变木质素的物理性质来影响细胞壁的机械强度和柔韧性，减少干旱对细胞造成的机械伤害。

油菜素内酯对脯氨酸积累的影响

环境胁迫诱导的脯氨酸积累是植物一种非常显著的代谢适应机制。和其他胁迫应答反应一样，脯氨酸积累也受到各种植物激素和信号分子的调控，如脱落酸、钙离子等。本论文的研究目的在于了解植物激素油菜素内酯（BR）在拟南芥脯氨酸积累中的作用。 首先，我们发现拟南芥经不同浓度的24-表油菜素内酯（EBL）预处理后，200mM NaCl诱导的脯氨酸积累受到不同程度的抑制。同时脯氨酸合成途径的关键基因P5CS1以及OAT的诱导表达减弱，降解途径的关键酶基因PDH1的转录水平有所上调，说明脯氨酸积累程度的降低是相关基因表达的调控的结果。BR缺陷型突变体det2-1和不敏感突变体bin2-1在盐胁迫下的脯氨酸积累均高于野生型，而且det2-1的P5CS1受到的诱导增加，PDH1的表达有所下调。说明BR在脯氨酸积累中起负调控的作用。 经不同浓度的24-EBL处理后，50µM ABA诱导的脯氨酸积累受到明显抑制。det2-1和bin2-1在ABA处理下脯氨酸积累均高于野生型，但是ABA不敏感突变体abi1-1在盐胁迫下的脯氨酸积累并没有受到BR的抑制。说明BR可以特异地抑制由ABA介导的脯氨酸积累，而对不依赖ABA途径介导的脯氨酸积累没有明显影响。但是，BR处理后并没有改变ABA诱导的P5CS1的转录水平。 上述BR对脯氨酸的抑制作用是在短日照（8小时光照）条件下得到的，而在长日照（16小时光照）条件下生长和处理材料时，24-EBL对盐胁迫或ABA诱导的脯氨酸积累都略有促进作用。det2-1和bin2-1中的脯氨酸积累仍比野生型高。由以上的结果推测光照增加可以抑制BR对脯氨酸积累的抑制作用。 我们还对det2-1和bin2-1在生长发育各个时期的盐敏感性进行了初步鉴定。det2-1在种子萌发阶段对盐胁迫和ABA超敏感；在幼苗生长阶段det2-1和bin2-1在长势、存活率、根长以及鲜重方面对盐胁迫都比野生型更敏感，外加24-EBL可以部分恢复det2-1的盐敏感性；成株阶段bin2-1则表现出比野生型明显的抗盐性。这些结果表明BR可能对拟南芥盐响应有重要调节作用。

甘蓝型油菜中脯氨酸积累的分子调控机制

　　渗透胁迫下植物中游离脯氨酸的积累被普遍认为对植物有保护作用。本文对甘蓝型油菜（Brassica napus）中的脯氨酸积累及其调控机理进行了研究。正常生长条件下幼苗叶中脯氨酸含量最高，根中脯氨酸含量最低，盐胁迫后不同部位脯氨酸积累程度相近。盐浓度200 mM起，幼苗开始有明显脯氨酸积累,并随着浓度的增加而增加。PEG处理后脯氨酸积累要明显高于ABA和盐胁迫处理后脯氨酸积累。在成株中，生殖器官中脯氨酸含量明显高于营养器官中脯氨酸含量。 　　我们克隆了编码Δ1-二氢吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）,鸟氨酸转氨酶(OAT)和脯氨酸脱氢酶(PDH)的四个基因的cDNA。通过Southern杂交检测P5CS基因在甘蓝型油菜及其亲本白菜型油菜和甘蓝中的拷贝数，发现杂交条带在4倍体油菜中并没有显著的多于其两个2倍体亲本，推测有可能是在物种进化的过程中发生了基因丢失。 　　利用实时定量PCR的方法检测了渗透胁迫下甘蓝型油菜中BnP5CS，BnOAT和BnPDH等基因的表达水平。在ABA处理，盐处理和干旱处理时，BnP5CS1和BnP5CS2的表达在脯氨酸积累开始前就开始有明显上调，但是BnP5CS1的上调水平要比BnP5CS2高许多。BnOAT在ABA处理后表达水平没有太大的变化，在盐胁迫后甚至有一点下调，在干旱处理后却表现为一定程度的上调。另一方面，BnPDH的表达在ABA处理，盐胁迫和干旱胁迫后都受到了抑制。在成株不同器官相关基因表达的研究中发现，BnOAT在叶中表达量最高，BnP5CS和BnPDH在花蕾和花中的表达水平都比其他器官中要高。 　　我们的结果说明，渗透胁迫下甘蓝型油菜中的脯氨酸积累是脯氨酸合成途径的诱导和脯氨酸降解途径的抑制共同作用的结果。在轻度的渗透胁迫下，谷氨酸合成途径占主导地位，而在较为严重的渗透胁迫后期，谷氨酸合成途径和鸟氨酸合成途径共同起作用。甘蓝型油菜生殖器官花和花蕾中脯氨酸的代谢非常旺盛，说明脯氨酸可能在花发育中起着一定的作用。

野生稻OrbHLH2基因的克隆及功能分析

　　bHLH（basic/helix-loop-helix）型的蛋白作为转录因子中的一个家族，控制一系列的生物学过程，例如细胞分化、细胞命运决定等。该家族的共同特点是具有一个bHLH型保守结构域，大约由60个氨基酸组成，在功能上划分为给两个部分：N端的碱性区域和C端的HLH区域，前者具有结合DNA的功能，后者参与了蛋白的二聚化，主要由疏水氨基酸组成。水稻中大多数的bHLH转录因子其功能还不清楚。 　　本论文利用同源克隆的方法，从水稻中得到与拟南芥ICE1同源性最高的基因，并命名为OsbHLH2，然后我们从野生稻中克隆到相关基因OrbHLH2。OrbHLH2 的cDNA全长为1961 bp，编码525个氨基酸。OrbHLH2与拟南芥、荠菜、毛果杨中推测的类ICE1蛋白之间的同源性分别达到46.1%、 45%、 41.2%，推测OrbHLH2可能是一个类ICE1蛋白。亚细胞定位实验结果表明，OrbHLH2定位于细胞核中；酵母自激活实验表明OrbHLH2具有自激活活性，因此推断OrbHLH2可能是一个转录因子。在水稻中对其组织表达模式进行分析发现，OsbHLH2在幼根、老根、幼茎、老茎、幼叶、老叶等组织中表达量极低，而在穗部的表达量很高，这暗示了OrbHLH2可能在水稻发育的特定阶段起重要作用；分析OsbHLH2对各种胁迫的响应，发现该基因在水稻中的表达不受低温、高盐、ABA等胁迫的诱导。 　　将OrbHLH2在拟南芥中异源超表达，转基因材料在发育上没有发现明显的表型改变。分析转基因拟南芥对不同胁迫的耐受性，结果表明：转基因拟南芥对高盐、渗透胁迫的抗性明显增强；分析一些抗逆标记基因的表达水平，发现与转基因拟南芥在高盐条件下DREB1A/CBF3、RD29A、COR15A和KIN1的表达量有不同程度的上调，暗示了在胁迫条件下OrbHLH2可能通过对DREB1A/CBF3途径中的基因的激活，来启动植物对逆境胁迫的响应，从而提高植物的抗逆性。该结果对于提高农作物的抗逆性具有潜在的应用价值。

植物分子伴侣热休克蛋白90（Hsp90）的分子作用机理及抗逆基因工程研究

热激蛋白90是广泛存在于各类细菌和真核生物中的一类高度保守的分子伴侣，它对维持细胞生命是绝对必需的。对Hsp90的相关认知主要来源于对动物和酵母细胞的研究，植物Hsp90的研究甚少。由于植物的特殊性，因此对植物Hsp90的研究是对Hsp90未知功能的有力补充。拟南芥中有7个Hsp90蛋白，其中AtHsp90-1、AtHsp90-2、AtHsp90-3和AtHsp90-4定位在细胞质中，AtHsp90-5、AtHsp90-6和AtHsp90-7分别定位在叶绿体、线粒体和内质网中。本文对拟南芥中的AtHsp90-1、AtHsp90-2、AtHsp90-5、AtHsp90-6和AtHsp90-7五个基因进行了克隆，并分别利用酵母互补、双杂交和拟南芥过表达体系几个层面进行了功能分析。 我们利用酵母穿梭载体p416GPD构建了五个AtHsp90基因的酵母表达载体，将其转入Hsp90基因点突变和条件型缺失的酵母菌株iG170D和R0005中。酵母功能互补实验表明细胞质定位的AtHsp90-1和AtHsp90-2可以在各种胁迫条件下互补酵母Hsp90的功能，而定位于细胞器中的AtHsp90-5、 AtHsp90-6和AtHsp90- 7则在任何条件下都不能互补酵母Hsp90的功能。我们还对转基因酵母进行了液体培养的动态观测和细胞膜完整性检测，其结果和固体培养的结果一致。这说明细胞质Hsp90的功能具有一定的保守性，细胞器Hsp90的功能有其特殊性。 热激蛋白90在执行其生物功能时，需要和大量的辅助因子相互作用，因此我们利用酵母双杂交体系检测了AtHsp90-1、AtHsp90-2、AtHsp90-5、AtHsp90-6和AtHsp90-7五个Hsp90蛋白和Hsp70、p23、Cyp40、NOS等几个辅助因子之间的相互作用情况。双杂交结果显示AtHsp90-1和AtHsp90-2几乎不和所选的这几个辅助因子相互作用，AtHsp90-5可以和所有的辅助因子相互作用、AtHsp90-6可以和除Hsp70以外的辅助因子相互作用，AtHsp90-7也可以和所有的辅助因子相互作用但和Hsp70及Hsp70t-2和互作较其他辅助因子弱一些。可以看出胞质Hsp90和细胞器Hsp90在和辅助因子相互作用时有一定的差异。 为了进一步了解拟南芥个Hsp90基因在抗非生物逆境中的作用，我们又将AtHsp90-2、AtHsp90-5、AtHsp90-7基因插入植物表达载体pBI121，用农杆菌介导的浸蕾法将这三个基因转入拟南芥并在其中过量表达，并研究了这些基因的过表达植株的种子和幼苗对多种模拟非生物逆境的响应。结果显示，转基因种子和幼苗对ABA、盐(NaCl)、干旱(甘露醇)、高温、氧化、高钙等非生物逆境都表现出了敏感，转细胞器Hsp90的种子和幼苗比转细胞质Hsp90的更为敏感。但在高浓度钙离子胁迫下，幼苗表现情况与盐、旱和氧化等非生物逆境处理下的情况正好相反，转细胞器Hsp90的幼苗比转细胞质Hsp90的长得健壮。这些结果表明Hsp90参与了植物抵抗非生物逆境的反应，其作用可能是通过ABA和Ca2+途径实现的，然而体内Hsp90的动态平衡可能才是植物抵抗非生物逆境的关键。

羊草cDNA文库的构建及果聚糖水解酶的分离与鉴定

羊草(Leymus chinensis(Trin.) Tzvel.)又称碱草，隶属禾本科赖草属，是欧亚大陆草原区东部草甸草原及干旱草原上的重要建群种之一。作为一种兼具重要经济价值和生态价值的优良牧草，羊草受到了广泛的关注。但长期以来，对羊草的研究主要集中在生态学、生殖生物学方面，在分子生物学方面知之甚少。为了保存羊草基因资源，并在基因水平上研究羊草生物代谢的调控机理，本研究采用羊草根、叶片混合后做为材料，构建cDNA文库，并对文库中部分基因序列进行了分析。同时从中克隆获得羊草果聚糖水解酶全长基因并对这些基因进行了深入的生物信息学分析、转化毕赤酵母研究初步确定其功能，为深入了解羊草代谢的分子机制提供理论依据。主要结果如下： 1. 成功地构建了羊草根、叶混合cDNA文库，原始文库滴度达到4×106 pfu/ml，扩增文库滴度接近1011 pfu/ml ，重组率达97% 。PCR检测插入片段，均在0.5 kb到3 kb之间，l kb以上占68%。从文库中检测到了TC、γ-TMT、FEH基因，文库覆盖度达到要求且为PCR筛选文库提供了可能。 2. 随机挑取经检测过的597个单克隆进行测序，去除插入片段小于和污染序列后，获得了584条高质量的序列。所有584条EST序列与NCBI的核酸数据库比对时，有30.99%的EST序列与己知序列有很大的同源性：而与蛋白质数据库进行比对时，有61.27%的EST序列与已知序列有很大的同源性。核酸比对中，有32.87%的序列为未知功能新基因，而蛋白质比对结果只有11.27%的序列为未知功能新基因。其中获得5条全长基因。 3. 文库中测序得到果聚糖水解酶（FEH）片段，依据其核酸、蛋白序列，以羊草根茎为材料，结合果聚糖水解酶基因的保守序列设计引物，通过 RACE 方法，获得羊草果聚糖水解酶基因 Lc 1-FEH 的全长序列（2040bp），包含一个 1803bp 的开放阅读框，采用生物信息学方法对该基因编码蛋白质进行功能分析，该基因编码的氨基酸序列具有明显的果聚糖水解酶类蛋白特征(NDPNG，FRDP 和[WEC (V/P)D] 结构域)，其分子量为 66.8kD，等电点 pI 为 5.49，是一种酸性蛋白质。同源性分析结果表明Lc1-FEH与单子叶植物小麦、大麦和黑麦草细胞壁类酵素酶同源性最高，分别为89％、87％ 和72％。运用实时定量方法对Lc 1-FEH表达量在羊草发育各时期及不同逆境处理下进行测定，结果发现，幼苗中以叶中表达量最低，根茎中表达较高，成苗中花梗中的表达量最高；Lc1-FEH在转录水平明显受碱、ABA、SA及低温胁迫诱导，随着胁迫时间延长，表达量迅速增加，到达到最大值，之后表达水平逐渐降低，在盐、干旱的诱导下的表达量迅速降低。 4. 羊草果聚糖水解酶Lc1-FEH基因在毕赤酵母中的高效表达 将pMD-Lc1-FEH 质粒经双酶切后构建果聚糖酵母表达载体 pPICZα- Lc1-FEH 。将重组表达载体线性化后电击转化毕赤酵母Pichia pastoris X33，经抗生素 Zeocin 和酵母 PCR 筛选获得高效表达酵母工程菌。毕赤酵母表达的果聚糖水解酶蛋白经SDS-PAGE 分析表明Lc1-FEH表观分子量为 67 kD 左右。其最适反应 pH 值为 5.5，在 pH 值为 4.5~6.5 的范围内能保持较高的酶活力；表达Lc1-FEH的最适反应温度为 30 ℃；在温度在 20～30℃度范围内有较高的酶活。 Lc 1-FEH能够水解含有β-2，1糖苷键类型果聚糖：蔗果四糖、菊粉、6-蔗果三糖；而对β-2，6糖苷键类型果聚糖：6-蔗果三糖、新蔗果三糖、细菌类果聚糖及蔗糖基本不具水解活性。

显花植物器官形成激素调控的分子机理研究

本论文以显花植物水稻和拟南芥为对象，研究植物器官形成激素调控的分子机理。发现拟南芥干细胞决定基因WUS和ABA信号关键调节因子ABI3间存在相互调节关系，它们对质体和根毛发育等具有调控作用；运用细胞学手段对OsAGAP和OsRMC调控根发育的机理进行了研究。这些结果为了解ABA、生长素和JA等激素对分生组织或根等器官的形成的调控机理提供了新资料。 拟南芥WUS基因是一个重要的干细胞决定基因。在茎尖分生组织和花分生组织的动态平衡调节中各存在一个反馈调节环：WUS促进CLV3的表达，而CLV3 反馈抑制WUS表达，它们共同决定干细胞的数目；在WUS+LFY 和AG之间也存在一个类似的反馈环，负责花器官的正常启动和终止。本工作发现在外源ABA 存在下，拟南芥WUS功能获得突变体sef (stem ectopic flowers)子叶黄化过程受到抑制，即sef突变体对ABA 的敏感性降低，而且在sef突变体中ABI3转录水平下调，说明WUS 抑制ABI3的表达。另一方面，在abi3突变体中WUS转录水平下降，启动子分析发现WUS是ABI3所在的B3结构域家族基因的靶基因，酵母单杂交实验表明B3家族蛋白FUS3可以与WUS调控区结合；外源ABA 处理pWUS::GUS植株发现ABA可使WUS异位表达，暗示受ABA信号诱导的B3类转录因子可与WUS调控区结合，从而促进WUS的表达。这些结果支持ABI3/WUS间的反馈调节机理，该调节环可能参与调控拟南芥质体和根毛发育等过程。 双子叶和单子叶植物的发育和器官形成高度依赖生长素极性运输（PAT）， 生长素输入和输出载体的准确定位对于极性运输的正常进行是必要的。在双子叶模式植物拟南芥中，生长素输出载体PIN1的转运和定位受小G蛋白ARF鸟苷酸转换因子GNOM介导。本实验室克隆到一个水稻ARF GAPase激活蛋白OsAGAP， 其超表达引起PAT改变且干扰主根和侧根的发生及发育。前期生理实验显示超表达植株侧根的表型可被膜渗透性生长素NAA恢复，但不能被载体依赖型生长素IAA和2, 4-D恢复。为了解释OsAGAP过表达引起根系发育受到抑制的表型，本工作主要从细胞学角度继续深入分析OsAGAP介导生长素运输的机理。实验发现，OsAGAP超表达植株中AUX1在细胞中分布改变；生长素输出载体PIN1和PIN2的定位不受影响；该基因的超表达使囊泡聚集，形成类似囊泡运输抑制剂BFA处理后的结构；OsAGAP与细胞转运系统中的高尔基体存在部分共定位。以上结果表明OsAGAP调节小G蛋白Arf的活性，参与调控生长素极性运输过程，进而调控根系发育。通过对JA诱导的OsRMC蛋白的膜定位分析及转基因植株根中JA合成水平的测定，为研究此蛋白参与JA信号、调控根系发育提供了直接证据。 此外，论文还对拟南芥STAR2基因的功能进行了一定的初探。

高山植物唐古特红景天（Rhodiola algida Var.tangutica）抗冻蛋白的研究

抗冻蛋白（AFP）或热滞蛋白（THP）最早是从极区鱼和昆虫中发现的一类特殊蛋白质，其共同特性是能阻止体液内冰核的形成和生长，降低体液的冰点，使其冰点低于熔点（热滞效应）。近几年的研究表明，AFP在某些植物、细菌、真菌中也存在。生长在极端低温环境中的高山植物体内是否也存在AFP，据我们掌握的资料，还未见这方面的报道。为此，我们选择了青海高原海拔4000米高山生长的唐古特红景天为实验材料，并在这种植物中发现了抗冻蛋白。主要实验结果概括如下： 1. 唐古特红景天叶片有很强的抗冻性，可耐受-26.5 ℃的冰冻温胁迫。在北京地区夏季（7月）驯化20天后，半致死温度（LT_(50)）升高为-15.5 ℃。叶片质外体蛋白抽提液有明显的热滞效应（0.2 ℃），在AFP中存在糖基。SDS-PAGE分析表明，质外体AFP为分子量在43-85KD范围内的五条多肽。 2. 光镜组织化学切片显示，在红景天叶片中存在蛋白质量丰富的细胞;电镜细胞化学研究揭示，在细胞壁外层及细胞间隙中分布着明显的经钌红特异染色的糖蛋白，这种糖蛋白因环境温度升高而减少。结合前述的实验结果，确认这种细胞壁外层及细胞间隙中的糖蛋白，即抗冻蛋白。 3. 以唐古特红景天叶片为外植体，在MS+BA_2+NAA_(0.2)固体培养基上可诱导出黄绿色，松脆愈伤组织。愈伤组织细胞在同样成分的液体培养基中培养获得成功。在悬浮培养液中可检测到分泌蛋白的存在。经SDS-PAGE分析表明，经低温锻炼或ABA诱导后，细胞分泌蛋白的多肽谱带数增加。与此相对应的是，细胞的抗冻能力也明显提高。PAS染色揭示，多肽中均含有糖基。 4. 通过测定热滞值，确信细胞分泌蛋白是具有抗冻活性的糖蛋白。

水稻抗旱性与光合特征的资源评价及其根系抗旱生理基础的研究

为了挖掘和利用野生资源抗旱和高光效的有益基因性状，本研究针对野生种的抗旱生理性状、光合作用和抗旱关系进行了测定，同时利用野生稻和栽培稻远缘杂交获得不同光合特点的后代材料进行了胁迫反应试验，并以栽培稻（陆稻和水稻）为材料研究了抗旱反应中根系的激素信号变化。旨在明确水分胁迫条件下，水稻不同野生种对干旱反应的差异及其机理，以及进一步鉴定有效的抗旱指标，为今后育种和生产实践提供理论依据和指导。主要结果如下： 1．通过对具有不同抗旱性状的四个野生种O.Granulata、O.Alta、O,Officinalis、O.Latifolia水分胁迫处理的抗旱相关生理性状的变化特点的研究表明：(1)在胁迫早期，野生种间黎明前叶片水势没有明显的差别，随着胁迫加剧，种间差异显示明显。耐旱性弱的野生种（O.Granulata、O.Latifolia）黎明前叶片水势和中午水势下降幅度大于耐旱性强的野生种( O.Alta、O.Officinalis)。这表明在一定的干旱处理程度下，黎明前叶片水势和中午水势可以反映出不同种间植株忍受干旱胁迫的能力。(2)四个野生种的植株在轻微胁迫时，膜稳定性呈现出增强的趋势，这可能与干旱胁迫的适应性相关。随着胁迫时间的延长，胁迫程度的加重，叶片膜稳定性破坏，植株叶片渗漏率增加。(3)在胁迫条件下，不同野生种表现出茎杆中糖分增加，叶片的光合酶和光合速率下降，且抗旱性弱的品种这种变化比抗旱性强的品种更加明显。这可能是由于干旱处理降低了同化物的运转和淀粉合成，导致了糖分积累。(4)在水分胁迫条件下，植株中的ABA浓度增加而IAA浓度下降，其中ABA的浓度增加与种间的抗旱性相关。抗旱性差(O.Granulata、O.Latifolia)的野生种叶片ABA浓度增加幅度高于抗旱性强的野生种（O.Alta、O.Officinalis）。Officinalis和Alta在水分胁迫下，仍比Granulata 和Latifolia具有较高的分蘖，这可能与其在胁迫下具有较高GA3浓度有关。 2．通过对20个野生种叶片膜电解质泄漏率的比较，研究其叶片细胞膜稳定性的特点表明，46℃的温度，水浴时间24小时是较适宜的条件。在适宜的处理条件下，Longistaminata、Punctata渗漏率较低，表明其具有良好的膜稳定性：O. Officinalis、O.Glumaepatula、O.Glaberrima，O.Latifolia、Meridionalis、Rufipogon (105697)、100889、Nivara (80683)、Sativa( IR-36)电解质泄漏率居中在60-80%;O.Alta、Rampur6、Azucena、Rufipogon (105599)、Bartlic、Rufipogon(104640)、105429、Minuta (101099)、HP4的渗漏值均较高，表明其膜稳定性较差，尤其是Minuta。此外，叶片光合速率和叶片膜稳定性的关系并不完全一致，在育种时应选择光合速率较高而叶片膜稳定性好的品种，O.Longistaminata因其具有较高的光合速率和较好的膜稳定性，是一个值得关注的材料。 3．研究了栽培稻（Oryza sativa）和普通野生稻（Oryza rufipogon）的杂种后代F3，即：Azucena×Rampur6杂交得到的Fi植株(25007-10)，通过自交得到其F3代植株，在水分胁迫下不同光合速率类型植株以及相关的抗旱生理特点。结果表明， (1)光合速率高的株系黎明前叶片水势下降较大，而中午叶片水势下降却较小：光合速率低的株系黎明前叶片水势下降幅度较小，而中午叶片水势下降幅度却较大，这表明水分胁迫下，植株中午叶片水势与植株的光合速率密切相关。(2)在轻微水分胁迫下（缓慢干旱0-40天），所有株系经受抗旱锻炼的植株，其叶片渗漏率均下降，膜稳定性增强;随着胁迫时间延长（胁迫后40-80天）其叶片泄漏值上升，这可能是由于：水分胁迫下通过植株的渗透调节能力，使得叶片中累积的有机溶质增加：且干旱胁迫使得叶片的质膜破坏，电解质外渗，相对电导率提高。 (3)水分胁迫下，从不同光合速率类型的植株，其光合速率的变化看：高光合速率类型的植株，在水分胁迫下光合速率的下降幅度，要大于光合速率较低类型的植株。在水分胁迫下，SHPl-2株系后代比SHPl-1株系具有较强的抗旱性，能维持较高的光合速率。 (4)在水分胁迫下，不同光合速率的株系，其气孔阻抗均增加：低光合速率的株系，气孔阻抗上升幅度大于高光合速率类型的株系，并且其气孔阻抗上升的时间要早于高光合速率的株系。 4．研究了两个陆稻品种Azucena、IRAT104和两个水稻品种IR64、Salumpikit，在干旱胁迫下根系木质部汁液中内源激素的变化。(1)干旱复水后不同时间进程中，各品种木质部汁液内源激素的变化看，IRAT104和Salumpikit木质部汁液中ABA含量迅速降低，其下降幅度较大。说明ABA作为胁迫信号，通过木质部汁液传递干旱信息;在干旱胁迫解除后，ABA的浓度亦发生相应的变化。(2)在对根系施加不同压力后，测定其木质部汁液内源激素变化，结果表明：在不同的根系压力下，不同品种间（IR64、Salumpikit、IRAT104和Azucena） 木质部汁液中GA3含量变化较大，其中两个陆稻品种IRAT104和Azucena均较高，两个水稻品种IR64和Salumpikit均较低。这表明，在不同的压力下，陆稻品种（Azucena和IRAT104）比水稻品种（IR64和Salumpikit）具有较高的GA3含量;在胁迫条件下，维持较高的GA3含量，这有利于其维持正常的生长发育。(3)在干旱胁迫及复水过程中，根据木质部汁液中ABA和GA3含量变化的结果表明，虽然Azucena和IRAT104均属于陆稻品种，但二者的抗旱性不同。(4)水稻品种木质部汁液的pH值高于陆稻品种。木质部汁液中pH在干旱胁迫下升高，复水后又降低，其可作为干旱胁迫的一个信号，它与木质部汁液中ABA联合调节植株对干旱的生理生化反应。 上述结果表明，叶片水势与水分胁迫密切相关，可作为植株抗旱性的鉴定指标;抗旱性强的品种，叶片水势下降幅度小，有利于维持较高的水势，保证植株生长发育的需要。严重干旱使得所有品种的质膜稳定性降低，电解质外渗，相对电导率提高;抗旱性强的品种的质膜伤害程度小，电导率上升幅度小，表明其质膜稳定性好，对干旱的忍耐能力强。质膜稳定性的变化实际上反映了品种的耐旱性，所以是一种综合而又比较准确的抗旱鉴定指标。对于酶和激素的测定方法，由于操作比较烦琐，且数据分析和产量比较复杂等原因，不太适合于常规的大田选育工作中。水稻的抗旱性是多种生理生化变化综合作用的结果，因此进行水稻抗旱性鉴定时，不能使用单一的生理生化指标，而应对多个指标进行综合分析，依据综合值对水稻品种的抗旱性进行评价较为科学。

红松种子休眠的研究

对影响红松种子休眠的因素进行了系统和深入的研究，主要结果如下： 1：自然成熟的种子，蕴包在雌配子体中的胚胎在形态上已发育成熟，但未充分成长。胚体的后生长与贮藏条件有关，主要取决于胚体吸水的程度，与温度关系不大，而胚体颜色由乳白色转变为乳黄色与温度关系密切，可能是生理后熟的标志。 2：夹破中种皮后，种子萌发率很低，说明红松种子坚硬中种皮的机械阻力不是导致休眠的重要因素。 3：在离体胚培养中外加ABA及种子经ABA溶液浸泡后的发芽试验证明，红松种子所含的ABA对种子萌发没有明显的抑制作用。ABA不是导致休眠的主要因素。 4：用未经预先浸种吸胀的种子直接进行各种快速催芽效果不佳，凡种皮破烂者极易霉烂，发芽率很低。 5：冷、热砂藏和流水贮藏比较试验表明，红松种子至少需要3个月以上的低温层积处理以完成其生理后熟。 6：红松种子有透气性障碍，剥除种皮或低温砂藏后，种皮对氧气的阻碍作用明显减弱。 7：未经低温砂藏的种子几乎不含还原糖，仅有少量的低聚糖和淀粉，缺少直接作用为种子萌发初始的呼吸代谢原料，低温砂藏后，脂酶及异柠檬酸裂解酶的活性增强，脂肪水解后，经乙醛酸循环生成糖，低温砂藏30天后，胚的还原糖含量从0.05%增加到0.97%。因此脂肪的代谢直接或间接关系到种子生理后熟，还原糖含量的升高是生理后熟的重要生化标志。离体胚在无外源糖份补给的情况下不能生长及干种子必须预先浸泡3～4天才能萌发，都说明了红松种子的萌发与否关键在于能源“启动”。 8：H2O2处理能提高种子发芽率表明，红松种子的萌发初期可能与PP途径运转有关。 9：光照、黑暗及光、暗交替条件下发芽试验表明，红松种子萌发与光照无关。 本文还就种子脂肪酸的组成及生态环境因子等其它可能导致红松种子休眠的原因进行探讨。 根据系列实验研究结果确认，红松种子休眠的实质在于种子后熟及其生理，生化过程，尤其是种子贮藏物质的分解、转化和利用。

牡丹花芽分化类型与促成连续二次开花

牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.），芍药科芍药属植物，是我国的传统名花，因花朵硕大、花色丰富、花型齐全而显雍容华贵、富丽端庄，“惟有牡丹真国色，花开时节动京城”，深受人民的喜爱。人们在欣赏牡丹的过程中，一方面为其艳丽多姿而赞叹，同时又为其自然花期较短且集中而遗憾，“弄花一年，看花十日”，因此，如何通过栽培等技术措施使牡丹连续开花，一直是牡丹研究者探索的重要课题。近年，在对牡丹栽培的系统研究中，发现不同牡丹品种的花芽分化类型（数量、梯度）直接影响其开花数量和开花次数。为了有效地利用不同类型的牡丹，选育出更多的丰花、同株可连续开花的品种，服务于牡丹的产业化生产，本试验对4个牡丹品种群的135个品种进行了同枝条芽数的统计分析及花芽分化梯度的划分，阐明了花芽分化类型与促成连续二次开花的关系。初步测定了具有促成连续二次开花习性的牡丹品种‘High Noon’不同芽位腋芽内源激素的含量，揭示了牡丹同株连续二次开花过程中不同芽位腋芽内源激素的生理变化规律，为解决牡丹同株花期短、不能同株连续开花的难题奠定了理论基础。本研究主要结果如下： 1、牡丹花芽分化类型与自然开花的关系 通过对135个牡丹品种花芽分化数量和梯度类型的调查，将同枝条的芽数聚类为少（3-4）、中等（5-7）、多（8-10）三类;将花芽分化梯度划分为小、中、大三种类型。芽数类型和花芽分化梯度类型均与品种群有一定的关系。中原品种群中90%的品种属于芽数少的类型，47%的品种属于分化梯度大的类型;日本品种群中73%的品种属于芽数中等的类型，52%的品种属于分化梯度中的类型;法国品种群和美国品种群品种调查数量较少，但大多数品种属于芽数中等的类型，分别占80%和44%，分化梯度小的品种分别占调查总数的40%和67%。绝大部分品种的腋花芽因在枝条上着生的位置不同而有明显的异质性，上部芽顶端优势强，萌动率和开花率均高，芽数多的品种中、下部芽在春天自然开花季节常处于休眠状态。 2、牡丹花芽分化类型与促成连续二次开花的关系 花芽分化数量的多少与梯度的大小直接影响着开花次数。花芽分化数量少、梯度大的品种不建议直接用于同株促成连续二次开花栽培;花芽分化数量中等或多、梯度小的品种可以实现同株促成连续二次开花，10个试验牡丹品种中的中原牡丹品种‘如花似玉（Ru Hua Si Yu）’和美国牡丹品种‘High Noon’具有同株连续二次开花能力，且二次开花率达75%以上，两次开花品质均优良。 3、‘High Noon’不同芽位腋芽内源激素与促成连续开花的关系 通过测定美国牡丹品种‘High Noon’同枝条不同芽位腋芽萌动前期、后期内源激素含量，结果表明：萌动后期不同芽位腋芽的GA3、IAA、ZRs含量增加，尤其1位芽、2位芽含量增加显著;萌动后期ABA含量则随着芽位自上而下增加显著，可能是导致下部芽继续保持休眠状态的主要原因;萌动后期下部芽的ABA/ZRs配比增幅较高，说明ABA/ZRs配比与芽的生长与休眠关系密切。