云杉属的分子系统学与生物地理学研究

云杉属植物是非常重要的森林树种，广泛分布于北半球的寒温带、温带高山和亚高山地带。该属为松科中仅次于松属和冷杉属的第三大属，约有 28-56 种。自云杉属建立以来，其属于松科没有任何疑议。然而，由于云杉属物种间频繁杂交、形态趋同和取样困难，尽管已经有基于形态学、细胞学、化学成份、叶绿体 DNA RFLP 等方面的研究，该属的属下分类仍然存在诸多争议。本文利用父系遗传的叶绿体基因和母系遗传的线粒体基因序列重建了云杉属的系统发育关系，探讨了云杉属生物地理格局的形成过程。在此基础上，我们研究了低拷贝核 CAD 基因在云杉属的进化式样。另外，我们还对裸子植物线粒体基因 rps3 的内含子分布和进化进行了初步研究。 1． 云杉属的系统发育和生物地理学研究 我们选择了 Farjon (1990) 确定的 34 个种中的 33 种 (另一个种在 Flora of China 未得到承认)，共 103 个个体，对这些个体的叶绿体 DNA 片段 trnC-trnD 和 trnT-trnF 以及线粒体基因 nad5 的第一个内含子进行了序列测定。在两个叶绿体基因片段联合分析构建的系统发育树上，北美西部的 P. breweriana 和 P. sitchensis 位于最基部。其余的物种分为三支：第一支由北美的两个物种组成;第二支包括分布于喜马拉雅-横断山区及其周围地区的八个种、台湾的 P. morrisonicola、西亚的 P. orientalis、日本的两个种及北美的 P. chihuahuana;第三支中，北美的 P. pungens 位于基部，亚洲东北部的种 (除 P. maximowiczii 和 P. torano 外)、P. retroflexa 和欧洲的 P. abies 构成一个单系群，并与北美的 P. mariana 和 P. rubens 及来自巴尔干半岛的 P. omorika 形成姐妹支。所有样品的 nad5 第一个内含子序列可分为 A、B、C、D 和 E 5 种单倍型，北美的物种拥有前 4 种，而且 A、B 和 C 单倍型为北美所特有;欧亚的物种仅含 D 和 E 两种单倍型。 上述结果结合 MacClade 和 DIVA 分析及化石证据，我们推断云杉属起源于北美，至少两次经白令陆桥扩散至亚洲，然后从亚洲扩散至欧洲。亚洲东北部的绝大多数物种和欧洲云杉 P. abies 的种间遗传变异非常低，而且线粒体单倍型均为 D，可能来源于一次近期的辐射分化。云杉属的现代分布中心之一喜马拉雅-横断山区的物种可能不是一次起源，日本的物种同样如此，这可能与第三纪气候变冷和第四纪冰川导致的物种迁移有关。此外，我们发现目前用于云杉属分类的一些形态性状（如叶扁平、菱形等）在系统发育树上位于不同的位置，说明这些性状可能不是一次起源或是祖征在不同支系中的保留，用于云杉属的系统划分须慎重。 2． 云杉属 CAD 基因的进化研究 裸子植物的多倍体特别少，且以基因组庞大而著称。被子植物中的很多单拷贝基因在裸子植物中以低拷贝或多拷贝基因家族的方式存在。CAD 基因在木质素单体合成的最后一步起作用，在松属中只发现了一种 CAD 基因拷贝，在欧洲云杉中却发现了三种拷贝，而且 Southern 杂交和子代分离鉴定结果表明这三种拷贝至少位于两个位点上。然而，对云杉属三个物种 (包括欧洲云杉) 构建的遗传图谱却都只发现了一个 CAD 基因位点。由于云杉属 CAD 基因的数目和分布存在很大争议，我们根据构建的叶绿体基因树，选择了不同支上的 20 个物种、29 个样品研究该基因的进化式样。结果表明：云杉属不同物种中 CAD 基因的拷贝数为 1-4 种，多数为 2-3 种。系统发育分析发现有些物种的所有 CAD 基因拷贝聚成一支，另有一些物种的 CAD 基因拷贝位于不同位置。此外，我们对 GenBank 中云杉属三个物种 CAD 基因的 EST 序列分析后发现：EST 序列的差异主要发生在 3’-UTR 区，表现为序列长短的不同，这有可能是进行体外反转录时引物结合于不同的位置所致。因此，结合前人研究（包括遗传图谱分析），我们推测 CAD 基因在云杉属内发生了多次重复，重复拷贝很可能呈串联排列。 3. 裸子植物线粒体基因 rps3 的进化研究 线粒体基因内含子的获得/丢失已经被广泛应用于系统发育研究。rps3 为分布最广的线粒体核糖体蛋白基因，一般含一个内含子，前人研究显示其在裸子植物中多了一个第二类内含子 rps3i2，并将这个内含子作为区分裸子植物和其它植物类群的标志之一。然而，该研究只选择了苏铁和银杏作为裸子植物的代表，取样代表性不足。在本研究中，我们对裸子植物每个科至少选择一个物种作为代表，通过 DNA 序列和部分物种的 RT-PCR 分析，探讨 rps3 基因在裸子植物中的进化。结果表明 rps3 基因内含子的分布与裸子植物系统发育关系相吻合：Conifer II、松科的落叶松属和黄杉属及百岁兰科不仅不含 rps3i2，而且丢失了第一个内含子;金钱松属缺失第二个内含子。我们推断在 Conifer II 的祖先和百岁兰科中分别一次性丢失了两个内含子;在松科中则发生了两次单独的丢失事件，一次是在落叶松属和黄杉属的祖先中丢失了两个内含子，一次是在金钱松属中丢失了第二个内含子。另外，在 Ephedra 中没有扩增出 rps3 基因，Gnetum 中具有第二个内含子，倪藤科的 rps3i2 似乎支持松科与倪藤纲的关系更近。对 rps3i2 的进一步分析发现，其序列结构与松科的系统发育关系非常吻合。根据上述结果和 mRNA 编辑位点分析，我们认为 Conifer II等类群中的两个rps3内含子丢失可能是反转录酶介导的 cDNA 反转录造成的。Psuedolarix 的内含子丢失也可能为相同机制，但因缺乏材料而未能进一步研究。

毛茛目的系统发育分析：分子和形态证据

本研究选取毛茛目99属，利用四个叶绿体和核基因或DNA片段，并结合形态性状，在属的水平上构建毛茛目的系统发育关系。分子数据用简约法和似然法分析，分子和形态性状联合数据用简约法分析。具体结果如下： 1) 毛茛目的单系性 毛茛目的单系性在所有的分析中都得到强支持。这也被形态性状所支持，包括大的S-型筛管分子、表皮层具蜡质的管、离生并折合状发生的心皮、两层珠被形成的珠孔、无托叶、轮状花被(花被在领春木科可能是次生性丢失)和2-3层细胞组成的内珠被等。 2) 科间系统发育关系 毛茛目由三个主要分支构成：领春木科、罂粟科和核心毛茛目。罂粟科是核心毛茛目的姊妹群，二者通常具复叶、单叶分裂或单叶掌状脉，雄蕊轮状排列以及胚珠无丹宁酸组织。核心毛茛目的单系性得到强支持，花3基数、雄蕊和花被片对生以及外部花被片具三或更多的微管束迹等是其共有衍征。木通科和星叶草科形成一支，细胞型胚乳是它们的共有衍征。防己科、小檗科和毛茛科形成一支，核型胚乳和具小檗碱支持该支的单系性。小檗科和毛茛科的姊妹群关系得到草本习性、具根状茎、V-型木质部和外珠被至少四层细胞等性状的支持。 3) 科下系统发育关系 a. 罂粟科 罂粟科分为两个单系支：狭义罂粟科形成一支，Pteridophyllm、角茴香属和狭义荷包牡丹科形成另一支。是否具乳汁、小苞片状的萼片是否包着其他花部器官、雄蕊数目和花粉外壁纹饰等性状支持这种划分。这两支分别被给予亚科的分类等级。Pteridophyllm是角茴香属的姊妹群也得到分辨，叶和雄蕊的性状支持这两属近缘。 b. 星叶草科 独叶草属和星叶草属形成一支得到强支持，二者组成星叶草科。二叉状分支的叶脉、条纹状的花粉纹饰、单珠被、薄珠心和无外种皮等性状是该科的共有衍征。 c. 木通科 木通科的单系性得到强支持。大血藤属是其他木通科的姊妹群，因其在心皮数目、心皮排列、胚珠数目、胚珠方向、染色体数目和植物化学等方面不同于其他类群，建议给予亚科的分类等级。此外，猫儿屎属和串果藤属均具有一些独特的性状，分别给予族的等级。 d. 防己科 古山龙属和Anamirta形成一支，意味着族Anamirteae sensu Diels应该被承认;广义的青牛胆族应包括天仙藤族;无胚乳的粉绿藤族嵌合在蝙蝠葛族之内。子叶和花柱残基对科内的划分是非常重要的。虽然传统上认为胚乳是科下划分最重要的性状，但它在防己科内应该是次生性丢失。 e. 小檗科 六个间断分布的属或属对被证实。单心皮瓶状发生是小檗科的共有衍征。小檗科分为三个主要分支：南天竹属(x = 10)和染色体基数为8的类群形成强支持的一支，这也得到胚珠数目(2-4)和圆锥花序等性状的支持;x = 7的类群形成一支，花瓣基部内侧具2枚腺体，花粉具平滑的外壁和未分化的外表层等是其共有衍征;x = 6的类群形成一支，被条纹状的花粉外壁和不连续的花粉外壁内层所支持。这三支分别被给予亚科的分类等级。 f. 毛茛科的单系性得到强支持。雄蕊多数和胚珠多数是毛茛科的共有衍征。毛茛科由五个分支组成：Glaucidium、Hydrastis、染色体基数为9的类群形成一支、染色体基数为7的类群形成一支、染色体基数为8的类群形成一支，分别给予亚科的分类等级。Glaucidium是所有其他毛茛科的姊妹群。染色体基数为8的类群的单系性得到极弱的支持，不含有或者含微量的苄基异喹啉生物碱及具R-型染色体似乎也支持该支为单系。星果草属应隶属于毛茛亚科而与黄连属和(/或)人字果属关系遥远。在唐松草亚科，具瘦果的唐松草属嵌合在具蓇葖果的类群之内，意味着依据果实类型划分该亚科是不合适的。美花草属和毛茛族及银莲花族形成一支，而与侧金盏花属关系遥远。美花草属在胚珠着生位置、珠被数目和植物化学等方面不同与毛茛族和银莲花族，因此我们建议给予美花草属族的分类等级。 根据分析结果，我们提出了毛茛目一个新的分类系统

金粟兰花发育相关基因的结构、功能和进化研究

花是被子植物区别于其它植物大类群的最重要的特征，其形态多种多样。花的发育取决于一个复杂的涉及到多个基因和过程的调控体系，因此花的起源和多样化过程实际上可以理解为这个调控体系的进化过程。在被子植物的不同物种中，花发育相关基因的组成并不相同，且经历了不同的进化历史，这意味着这些基因可能以不同的方式调控花的发育。相对于核心真双子叶植物相对稳定的花形态结构而言，基部被子植物的花具有丰富的多样性。因此，对基部被子植物花发育相关基因的研究对于我们理解被子植物花的进化非常重要。 金粟兰科（Chloranthaceae）是基部被子植物的代表类群之一。与研究得比较深入的模式植物相比，花被、雄蕊或雌蕊的缺失，使得该科植物的花比较简单。因此对该科植物中花发育基因的研究不仅有助于揭示花的起源以及花多样性分化的分子机制，还将为认识花部构造简单化的机制提供资料。本文以金粟兰（Chloranthus spicatus）为实验材料，取得了以下研究结果： 1.花发育相关基因的克隆 应用5’/3’RACE的方法，我们从金粟兰不同发育阶段的混合花芽中克隆到了与花发育相关的MADS-box基因：CsPI、CsAG1和CsAG2。 2. 两个A类MADS-box基因表达式样的对比分析 在营养分生组织向生殖分生组织的转变中，花原基的形成，以及随后雄蕊、心皮、花粉、胚珠和胚囊的发育中，CsAP1-1和 CsAP1-2基因均表达。唯一不同之处在于，在花发育成熟期，CsAP1-1在外珠被也有表达，而CsAP1-2在外珠被处没有表达，而只在内珠被处表达。这一结果反映了基因重复事件发生后，两个基因在功能上也有了一些分化。 3. B类基因功能的保守性和多样性 通过转基因实验和蛋白质相互作用研究对B类基因的功能和作用方式进行了研究，得到以下结果：1）金粟兰CsAP3基因的C末端的点突变所造成的paleoAP3基元的部分缺失对该基因的功能没有决定性的影响;2）金粟兰paleoAP3型基因CsAP3所编码蛋白的C末端以及paleoAP3基元，与拟南芥euAP3型基因AtAP3所编码蛋白的C末端以及euAP3基元没有功能上的不同;3）金粟兰paleoAP3型基因CsAP3与拟南芥euAP3型基因AtAP3 的主要功能存在一定差异，前者主要参与雄蕊形成，而后者既参与雄蕊的形成也参与花瓣的形成; 4）CsPI基因所编码的蛋白可以与AP3类蛋白相互作用进而影响花瓣的形成，因此该基因在功能上是保守的。 4. 金粟兰CsAG1基因的序列结构和功能分析 通过序列结构分析发现，CsAG1属于C类基因，具有保守的AG I基元和AG II基元。过量表达实验分析表明CsAG1的功能与A类基因的功能是相拮抗的。 5. 各类MADS-domain蛋白间的相互作用 在前面工作的基础上，我们首次对金粟兰中各类MADS-domain蛋白间的作用方式进行了研究。酵母双杂交结果表明：1）C末端的完整性对于MADS-domain蛋白二聚体的形成没有影响; 2）去掉M区的CsAP3蛋白与CsPI蛋白都能够形成异源二聚体，同时它们又可以各自形成同源二聚体; 3）E类蛋白既可以和A类或C类基因产物相互作用，也可以同AP3和PI型蛋白相互作用，充分体现了E类基因产物作用式样的保守性; 4）金粟兰中，FUL-like型基因所编码的蛋白CsAP1-1与CsSEP3和CsAG1也能形成异源二聚体，这与核心真双子叶植物的euFUL型蛋白在作用式样上是非常相似的。然而，金粟兰CsAP1-1蛋白不能形成同源二聚体。 综合以上结果发现，在无花被的金粟兰中，仍然存在着A、B、C/D、E类花发育相关的基因。这些基因的功能与核心真双子叶植物中同类基因的相比，有些是保守的，比如CsPI基因可以参与花被的形成;但也有一些是不同的，比如CsAP3基因主要参与雄蕊形成而非花被形成过程。由此可以看出被子植物花器官的发育是一个非常复杂的调控过程，不同植物中的调控机理及进化历程可能是不同的。

稻属的系统发育基因组学研究

稻属（OrvzaL．）是禾本科(Poaceae)中的重要植物类群，包含20多个野生种和两个栽培种，共有十个基因组类型，即A，B，C，E，F，G，BC，CD，HJ和HK，蕴藏了极为丰富的遗传资源，是水稻遗传改良的重要基因库。考虑到该属现存物种中的多倍体都是由二倍体杂交起源的，因此，弄清二倍体基因组之间的进化关系对于正确理解整个稻属的进化历史至关重要，同时也为稻属及其近缘类群的进化生物学、比较基因组学和功能基因学研究等提供了一个重要的工作基础。迄今，对稻属各基因组之间的系统发育关系还没有一致的结论，特别是对A、B和C基因组三者之间的关系，以及稻属基部类群的归属问题还存在争议。本研究选取来自不同二倍体基因组的6个稻属物种为研究对象，以近缘属Leersia中的L，tisserantti作外类群，通过对基因组水平的多基因序列数据的详尽分析，探讨了稻属二倍体基因组之间的亲缘关系问题，基因树与基因树之间冲突的机理，以及利用基因组水平的多基因序列做系统发育分析的方法，主要研究结果如下。 利用已完成的水稻两亚种（O．sativaL．ssp. indica和O．sativaL．ssp.japonica）的全基因组序列，筛选并扩增出遍布核基因组12条染色体的142个单拷贝核基因片段。通过对全部基因位点的合并分析，我们得到了一棵有完全分辨并得到显著统计支持的系统树。分别提取各基因的外显子区、内含子区和第三密码子进行合并建树时发现，除了合并外显子区的MP分析以外，所得系统树的树形均不变，说明这棵树基本上不会因为选取基因组不同区域或碱基位点而改变，尽管不同区域或碱基位点受到不同的选择约束力。以基因为单位进行放回式抽样也强烈支持合并建树的分析结果，表明多基因合并序列的系统发育估计并没有受到少数特殊基因的支配。为了考察基因组内物种取样对建树的影响，我们增加了2个A基因组物种以及C基因组的另外两个物种，随机选取其中的62个基因位点进行扩增和测序（增加的O．sativa的序列来自BGI-RIS数据库）。将全部II个物种62个基因位点的序列合并建树分析，得到基因组之间的进化关系均未改变。我们进一步评估了合并数据的系统误差，结果发现，合并数据的系统发育重建也未受到系统误差的影响。综上所述，本研究通过系统发育基因组学方法所得到的系统树反映了类群真实的进化关系。 为了深入探讨以往研究中出现相互矛盾的系统发育关系的原因，我们对142个基因位点分别做了单独的建树分析，并用系统发育网络方法分析了数据中基因之间系统发育信息矛盾的集中位置及其矛盾程度。基于单基因的建树分析及系统误差分析，我们排除了随机误差和系统误差直接造成基因之间信息冲突的可能性。基于溯祖理论( Coalescence theory)的进一步分析表明，稻属进化过程中发生了两次世代间隔较短的连续分化事件，由于祖先居群较大引起基因的谱系分选，进而使得在利用现有物种基因序列来重建这些分化事件时基因树不能正确反映物种树，且呈现出基因组水平的基因树冲突现象。这两次间隔较短的连续分化事件分别对应了稻属中两次物种快速分化过程，整个稻属基因组的多样性几乎都是在这两次物种快速分化过程中形成的。随机抽样分析表明，需要大量的分子序列数据才能正确分辨稻属二倍体基因组的系统发育关系（若取95%的概率，则至少需要120个基因或50kb的随机碱基位点）。本研究用基因组水平的多基因合并数据克服了谱系分选对构建系统树所带来的“噪音”，在存在广泛单基因系统发育信息矛盾的前提下获得了对物种树的正确估计，这充分证明系统发育基因组学方法在解决快速分化类群的进化关系问题中有着巨大潜力和广阔的应用前景。 基于本文所采用的142个核基因，我们初步探讨了利用多基因序列数据构建系统树时如何进行模型选择和插入缺失编码等问题，并评估了数据缺失对基因组水平系统发育重建的影响。结果表明，对合并数据而言，混合模型比单一模型能更好的拟合数据的进化模式;找到合并数据中异质性的根源并做出适当的数据分割是成功运用混合模型的关键;某些模型成分在提高模型对数据的适合度上发挥着重要作用，尤其要考虑位点之间以及谱系之间的突变速率异质性。我们认为，在设置模型时，最复杂的不一定是最好的，把握数据中最重要的进化特征远比简单的增加模型的复杂度重要。插入缺失的编码分析表明，编码后显著增加了对A基因组和B基因组聚为一枝的支持，但对稻属基部类群的分辨状况改善不明显。另外，我们通过去除数据缺失比例较大的类群来降低数据缺 失对系统发育推断的影响，结果所得的系统发育关系不变，支持率也仅有极微小的变化，说明基因组水平的多基因数据由于具有丰富的系统发育信息，因而对数据缺失具有很好的缓冲能力。

藻胆体的光谱特性和光能传递的研究

藻胆体在低浓度磷酸缓冲溶液中发生解离，我们通过藻胆体在解离过程中荧光发射光谱的变化研究藻胆体中藻胆蛋白之间的光能传递． 1．发菜(Nostoc flagelliforme)藻胆体在0.9M磷酸缓冲溶液中较稳定，其77K荧光发射光谱中只有一个荧光峰F686，属于别藻蓝蛋白-B的荧光峰。当藻胆体在低浓度缓冲溶液中时，荧光峰除了686nm，还出现F648和F666肩，而且F648先于F666肩出现．这说明C-藻蓝蛋白(F'648)所捕获的光能已不能全部传给别藻蓝蛋白-B，并说明藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白之间的断裂先于别藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白-B之间的断裂。当进一步解离时，主峰仍位于648nm，次峰位于686nm．而666nm荧光肩消失，说明C-藻蓝蛋白所捕获的光能已不能传给别藻蓝蛋白，但能传给别藻蓝蛋白-B．我们因此提出在该藻胆体中藻胆蛋白之间的光能传递途径如下： C一藻红蛋白一C-藻蓝蛋白一别藻蓝蛋白_-别藻蓝蛋白-B 在藻胆体的结构方面，我们提出一部分C-藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白相连接，另一部分与别藻蓝蛋白-B相连接． 2．聚球藻( synechococcus leopoliensis 625)藻胆体在0.6M，0.3M和0.1M磷酸缓冲液中解离时，其77K荧光光谱中只出现别藻蓝蛋白-B(F'684)和C-藻蓝蛋白(F655)的荧光峰消长变化，没有出现别藻蓝蛋白(F666)的荧光，我们为此提出在该藻胆体中光能从C-藻蓝蛋白传给别藻蓝蛋白-B有两条途径：一是直接传给别藻蓝蛋白-B，另一是传递给别藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白-B的复合物，此复合物在0.lM到0,6M磷酸缓冲液中比较稳定．即： c-藻红蛋白→c—藻蓝蛋白—①别藻蓝蛋白-别藻蓝蛋白-B复合物、②别藻蓝蛋白-B

棕榈藤茎结构的研究

本文通过棕榈藤茎13属50余种的比较解剖观察，系统地比较了棕榈藤茎的解剖特征，评价其在各种棕榈藤茎鉴别中的作用，并在此基础上，解决了棕榈藤茎属一级的鉴定问题。除此之外，还讨论了棕榈藤茎的解剖特征与地理分布、系统分类和演化的关系。主要研究结果如下： （1）应用棕榈藤茎的解剖特征，可以区分到属（见分属检索表），但鉴定到种仍较困难。对棕榈藤茎的鉴定有重要价值的特征有：后生木质部导管和韧皮部的数目，基本薄壁组织细胞的类型，表皮细胞表面观的形状及排列样式，表皮细胞表面有无反射体等，对棕榈藤茎的鉴定有辅助意义的特征有：韧皮部中筛管和伴胞的排列方式，针晶囊的多少和大小等。 （2）依据表皮细胞的形状、排列样式和反射体的有无，可将棕榈藤茎的表皮细胞分为以下5种类型和3种亚型：1.针叶藤型：表皮细胞为长方形，细胞交错排列成砖墙状（如Plectocomia, Laccosperma, Retispatha, Plectocomiopsis）.2.黄藤型：表皮细胞为不规则的四边形，细胞排列成斜向网状（如Daemonorops）。3.省藤型：A亚型：表皮细胞六边形，细胞排列成网状，表皮表面有反射体，气孔平列型或四轮列型。B亚型：表皮细胞四边型，细胞交错排列如砖墙状，细胞长轴平行于茎轴，孔梭形四轮列型。C亚型：表皮细胞四边形，细胸垂周壁呈波浪形，细胞交错排列如砖墙状，细胞长轴平行于茎轴。4.Eremospatha型：表皮细胞六边形，细胞排列成网状，表皮表面无反射体，气孔平列型或四轮列型。5.Calsopatha型：表皮细胞近四边形，细胞排列成不规则网状，细胞长轴几乎垂直于茎轴。表皮表面无反射体。 （3）对白藤（Calamus tetradactylus Hance）茎纤维的成熟模式研究表明，纤维细胞壁的加厚可持续3年以上时间，但在细胞壁加厚的早期和末基匀较缓慢，细胞壁加厚的顺序通常由藤茎的基部向基本向顶部，藤茎的外部向内部以及纤维鞘的内部向外部。 （4）产于西部非洲棕榈藤的种类，其茎的结构特征明显地不同于分布在东南亚的种类，如前者的表皮层表面一般覆盖着膜质，而后者表面常覆盖一层硅质。另外，典型的双后生木质部导管仅见于西部非洲的种类。 （5）棕榈藤茎的后生木质部导管分子为单的平直穿孔板，管间纹孔式为对列式，直径大等于，故属进化类型。而棕榈藤茎韧皮部的演化趋势为：单韧皮部较原始，双韧皮部较进化。 （6）从棕榈藤的生长性看，直立棕榈藤的导管直径较爬行棕榈藤的大小，这可能与自立棕榈藤茎需要更大的机械支持力有关。 （7）通过对棕榈藤茎的结构研究，支持Uhl和Dansfield（1987）对棕榈藤的分类处理，即：将Calamus, Calospatha Ceratolobus, Daemonorops, Pogonotium, Retispatha放在Calamnieae亚族中;另将Korthalsia与Myrialepis, Plectocomia, Plectocomiopsis分别置于Metroxylinae和Plectocomiinae亚族中。

小麦春化相关基因的克隆及其功能分析

一． 小麦相关基因ver203F cDNA全序列克隆与功能分析 　　根据本实验室通过差异筛选技术克隆到的与春化相关的基因cDNA verc203的序列，设计PCR 5’端PCR引物，利用RACE（rapid amplification of cDNA ends）克隆策略，得到春化相关基因ver203基因的同源基因ver203F cDNA的3’端序列，长度为1,197bp。Northern分析表明ver203F全长约为1.5 kb，且其表达具有春化处理的特异性。根据3’RACE克隆的ver203F 3 ’端核苷酸序列设计了3’端PCR引物，利用5’RACE克隆到该基因的5’端片段，经DNASIS核酸分析软件分析将5’45RACE和3’RACE DNA序列拼接合并，得到ver203F全长cDNA，从TdT加尾5’末端到poly A全长为1,561 bp，5’端起始密码子ATG上游非编码区－1～－192共了192bp，终止密码子TGA到poly A的非编码区有253bp，cDNA编码区全长1,119 bp，推测编码373氨基酸残基。国际基因序列数据库检索表明该基因序列（GenBank/EMBL/DDBJ：AB012013）与大麦茉莉酸诱导基因有部分同源性。因上推测该基因在调控开花过程中可能参与茉莉酸介导的信号传导途径，ver203F作用的发挥可能需要其它蛋白的参与，或ver203F本身就是一个受体蛋白。 　　为了研究ver203F基因的功能，将通过3’RACE克隆到的ver203F 3’端序到分别构建正义和反义植物表达载体，通过花粉管通道法、农杆菌介导的叶圆片法以及农杆菌介导的真空转化法分别转化小麦、烟草和拟南芥菜。获得转基因植株后，PCR、DNA Dob Blot、Southern Blot分析以及GUS活性检测证明外源基因已整合到转基因植株中，并得到表达。在获得的小麦、烟草和拟南芥菜转基因植株中，它们开花时间都相应地推迟，表明正常植物体内该基因在控制营养生长向生殖生长的转变中起作用。ver203F可以影响小麦和拟南茶菜花序的发育，首先无论正义还是反义都使得花序的发育受到抑制，在小麦中表现为顶部小穗退化，在拟南芥菜中表现为顶花。其次在转化正义基因的转基因拟南芥菜中，观察到产生的顶花为对称的两朵或以对称的两朵顶花基部为生长点长出丛生花，这种对称花的麦型小麦小穗中小花的表型相类似，说明ver203F基因可能在小麦小花的发育过程中也起着重要作用。 二． 春化相关基因ver17在开花过程中功能的分析 以春化处理冬小麦（京冬1号）幼苗cDNA为材料，通过减法杂交与差异筛选得到春化相关cDNA克隆verc17。为了研究该基因的功能，以包含CaMV 35S启动子的pBI221为载体，将ver17cDNA片段分别从两个方向插入pBI221的BamH I－Sma I, Xba I－BamH I间，构建正义和反义表达质粒：p17S和p17X，通过花粉管通道法转化小麦。对T0和T1两代转基因小麦的观察发现，在转化反义基因p17X的转基因小麦首先表现为抽穗推迟，其次穗的顶部和基部小穗严重退化，另外还发现转化反义基因的小麦败育现象严重（主要是花粉败育），因此推测ver17基困能可具有以下几方面的特点：a．春化诱导型表达;b．促进植物开花;c．促进穗顶端和基部花的发育，减少其退化;d．影响雄蕊的发育。

青蒿素含量影响因子分析及青蒿生殖结构的研究

由于青蒿中青蒿素含量很低，造成生产上成本过高，限制了青蒿素的应用。因此找到青蒿素含量的影响因子，并利用这些因子提高青蒿素含量是十分必要的。 研究青蒿有性生殖过程和生殖结构能够为青蒿遗传育种方面的研究提供理论依据。 利用青蒿高产株系001的茎段作为外植体，通过诱导丛生芽的方法得到无性克隆系s．，利用s．进行了青蒿素含量影响因子的研究。发现在Hoagland培养液中添加0. 44mg/L浓度的ZriS04.7H20,5.72 mg/L的HB03,0.32 mg/L的CuS04.5H20或者5uLmol／L的茉莉酸甲酯时能够明显提高青蒿素含量。 一些试验结果表明青蒿素含量不但受到培养条件的影响，而且和青蒿自身的生长发育有很大的关系。青蒿素含量在营养生长阶段随着青蒿的生长而逐步提高，当每天日照长度短于临界日长一16.5小时，青蒿进入生殖生长阶段，青蒿素含量短日照处理的第9-18天最高，而这一阶段也恰好是青蒿花蕾出现和发育的时期，此后青蒿素含量持续变低。青蒿素在青蒿植株不同器官中含量不同，其中叶片青蒿素含量最高，花蕾中也较高，但茎中含量极低。在不同部位的叶片中含量由高到低的顺序为中部叶片》下部叶片》上部叶片。青蒿植株不同部位器官中青蒿素含量的差异可能和这些部位腺毛数量的差异有关。 遗传差异是导致青蒿各个植株间青蒿素含量差异的主要原因。对青蒿素低产（02卜1，021-5）高产02卜18, 02卜19, 021-20）的五个青蒿株系进行了RAPD研究，以中间型产量02卜g和02卜d两个株系作对照。用OPRON公司的A，B，c，D，K五组100条随机引物进行PCR扩增。发现OPA15 (5' TTCCGAACCC 3')能在所有高产株系中扩增到一条lOOObp的条带，而在低产株系中则扩增不到这条带。这个条带很可能是高产青蒿株系特有的条带( OPA151000)，并有可能作为高产株系的分子标记。 利用整体透明和石蜡切片技术对青蒿的生殖结构进行了研究，研究表明青蒿的头状花序球形，直径大约2—3mm。两性花10-30朵，单层花冠合生，开放时顶端5裂，内有5枚聚合雄蕊。一枚雌蕊，柱头两裂。单性雌花10-18朵，花冠舌状，雄蕊退化。两种花都是子房下位，单室倒生型胚珠。 雌配子体的的发育过程，大孢子母细胞经过减数分裂形成二分体和四分体，四分体中合点端的一个发育成具功能的大孢子，其它三个分解掉，胚囊发育成单核胚囊。然后通过三次有丝分裂经过二核胚囊、四核胚囊阶段发育到八核胚囊，最后形成七细胞、八核胚囊。卵细胞和两个助细胞组成卵器分布在珠孔端，而三个反足细胞分布在合点端。 小孢子母细胞经过两次减数分裂形成二分体和四分体，四分体中的小孢子释放出来后发育成单核花粉，单核花粉经过有丝分裂发育成二核花粉和三核花粉。

MADS-box基因在单子叶植物花发育中的功能研究

第一部分 水稻E类MADS-box 基因在花发育中的功能分析 MADS-box 基因是一个大的转录因子家族，在花发育过程中起重要作用。根据对双子叶模式植物拟南芥、金鱼草和矮牵牛遗传突变体的研究，提出了花发育的ABCDE模型。该模型认为：A、B、C、D、E代表了5类功能不同的花器官特征基因，单独或联合控制花器官的发育。A类基因控制萼片的发育;A、B和E类基因控制花瓣的发育;B、C和E类基因控制雄蕊的发育;C和E类基因控制心皮的发育;D类基因控制胚珠的发育;A和C类基因相互抑制。在这5类基因中，E类基因的功能较为复杂，它不仅是花器官特征基因，而且具有花分生组织决定性（Floral meristem determinency）。在单子叶植物中，E类基因的功能发生了很大的分化。水稻是单子叶植物的模式植物，水稻中至少有5个E类基因，分别是OsMADS1、OsMADS5、OsMADS7、OsMADS8和OsMADS34，在这5个E类基因中，除了对OsMADS1基因有较深入的研究外，对其它几个E类基因的功能了解甚少。我们在现有的研究基础上，根据对双子叶植物中E类基因的研究结果，以OsMADS8基因为出发点，利用组织原位杂交，RNAi技术对水稻中的E类基因进行了深入的研究。结果表明：OsMADS8/7基因早在花序枝梗分生组织原基就有转录，随着小穗的生长发育，逐渐集中在小穗分生组织原基，小花分生组织原基，浆片、雄蕊和心皮中表达;在胚珠形成时，内外珠被有很强的杂交信号，而且在幼胚和胚乳中也有表达。OsMADS5在幼花时期，四轮花器官均有表达，在小穗发育后期及受精后的表达方式与OsMADS8/7基因相同。OsMADS8基因被抑制后，转基因植株没有任何表型变化，说明很可能有其它E类基因弥补了OsMADS8基因的功能缺失;当同时抑制其它E类基因的表达时，转基因植株抽穗期明显延长，四轮花器官的发育均受到影响：稃片类似叶片状;浆片转变为稃片类的结构;雄蕊没有花粉;心皮具有了稃片的特点;没有胚珠结构的形成，同时失去了花分生组织决定性，在心皮的部位产生了新的花器官或花分生组织逆转为花序分生组织。说明水稻四轮花器官及胚珠的正常发育需要E类基因的参与，但其功能与双子叶植物如拟南芥，西红柿、矮牵牛等直系同源基因相比已经发生变化;水稻中的E类基因在维持花分生组织特征性方面起重要作用;另外对抽穗期有影响。 第二部分 玉米MADS-box基因ZAG2转录调控区的研究 基因的时空表达受基因中的顺式作用元件及其反式作用因子调控。顺式作用元件由位于基因编码区上游的启动子区域和位置不确定的增强子区域组成。顺式作用元件对基因表达的开启至关重要。MADS-box 基因编码一类控制花器官发育的转录因子，在花的发育过程中顺序表达。MADS-box 基因突变，花器官发生同源异型转换。研究MADS-box 基因的调控序列可以进一步揭示影响基因时空表达的内外因素。ZAG2是玉米MADS-box 基因中的D类基因，控制胚珠的发育，在胚珠和心皮的内表面特异表达。ZAG2基因有7个外显子和6个内含子。我们从玉米基因组分离到了ZAG2基因翻译起始点上游3040bp的序列，并利用5’-RACE方法鉴定出了转录起始点的位置。序列比较发现，在 5’-UTR内有一个1299bp的内含子，这个内含子可能对基因的表达有调控作用，因此构建了两个与GUS基因融合的表达载体：一个是pZAG2-1::GUS，包括翻译起始点以上所有的调控序列;另一个是pZAG2-2::GUS，去掉了5’-UTR中的内含子序列，转化水稻。结果这两个构建都没有使GUS基因在正确的位置表达。pZAG2-1::GUS构建在心皮基部类似花托的部位及稃片顶端着色，pZAG2-2::GUS构建在内外稃片沿稃脉的部位有很强的着色，说明翻译起始点上游的调控序列不足以使基因正常表达。两个构建着色方式不同，可能pZAG2-1::GUS构建在5’-UTR部分含有抑制ZAG2基因在稃片表达的顺式元件，或者启用了在5’-UTR中的转录起始点，因为在5’-UTR的内含子中也有一个很典型的TATA-box。我们推测，在ZAG2基因编码区的第一内含子可能存在另外一些使基因正常表达的增强元件，需要进一步的序列缺失实验加以验证。

观赏向日葵（Helianthus annuus L.）花色及其花青素的研究

观赏向日葵作为一种新型花卉，具有巨大的市场开发潜力。而花色作为向日葵的重要观赏性状之一，对其的研究却比较少。本文从向日葵花色多样性、花色遗传规律、花色与虫媒传粉的关系及其对向日葵花色遗传的影响做了分析和讨论，利用英国皇家园艺学会比色卡和分光色差仪对向日葵的花色做了归类总结，并且利用高效液相色谱法对向日葵的花青苷成分做了分析研究。 本研究结果表明，彩色向日葵色系可以分为两大类，即黄色系和红色系，其中红色系向日葵的花色变异较小;而黄色系向日葵的花色变异较大，可以再细分为橙黄色和柠檬黄色两个亚类。利用高效液相色谱法测定了39份向日葵舌状花瓣中的花青苷大概有9种(A、B、C、D、E、F、G、H、I)，这9种花青苷并不是在所有39份样品中都出现，且红色系向日葵中花青苷的种类较多。花青苷G在红色系和黄色系向日葵中均被检出。对红色向日葵花瓣的花青苷提取液进行多级质谱分析发现，花青苷元类型主要是矢车菊苷元，其糖苷类型主要是和葡萄糖、鼠李糖和/或阿拉伯糖结合;而在纯黄色的向日葵中通过多级质谱分析未检测到这些花青苷，说明矢车菊类花青苷是红色向日葵舌状花红色形成的化学基础。

光系统II大量捕光色素蛋白复合体（LHCIIb）结构和功能关系 的定点突变研究

定点突变技术可以对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，从而改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，因而成为研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具。对突变基因的表达产物进行研究有助于我们了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。 植物体光系统II的大量捕光色素蛋白复合体（LHCIIb）具有多种功能，在自然界不同日光光强下分别执行捕获、传递光能或将过度激发能非光化学耗散的功能。最新的近原子分辨率LHCIIb晶体结构揭示出在LHCIIb穿膜螺旋B/C���间的环区具有复杂的超二级结构，其中一个新发现就是在此环区靠近穿膜螺旋C的区域中存在一个反平行股的结构，其功能不明。为了研究此反平行链对于LHCIIb复合体在结构和功能上的意义，我们将了这一区域的3个氨基酸（Val119、His120、Ser123）分别定点突变成Phe、Leu和Gly，并研究了这三个定点突变对LHCIIb结构和功能上的影响。结果如下：1，CD光谱揭示出该反平行链对于调节新黄质及其附近色素群的构象十分重要。虽然这三个突变只造成很少的新黄质丢失（V119F, 0.09; S123G, 0.17; and H120L, 0.26），但是却使色素构象发生了巨大变化。2，将S123突变成G导致复合物对光破坏更加敏感并且更易于聚集，在介质酸化后复合物的荧光淬灭更加显著。这些结果说明这段反平行链对于调节LHCIIb色素构象以及控制LHCIIb聚集体形成和叶绿素荧光产量具有重要作用。 以结构为基础的计算设计方法与定向进化相结合是蛋白质工程的一个发展方向。最近，通过计算设计已成功地向蛋白质引入了新的催化活性、提高了蛋白质的稳定性、设计了酶的催化活性位点、改变了酶的底物特异性等. 目前还没有见到有研究定向地，以理性方式对LHCIIb进行蛋白质设计。我们使用蛋白质的计算机辅助设计工具——RosettaDesign鉴定出一个可以显著提高LHCIIb光、热稳定性的定点突变I124L，并且突变体的的结构和功能与野生型无异。这是首次将计算机辅助设计应用于提高LHCIIb稳定性的研究。

大豆抗冷性的生理生化研究及其指标筛选

本文研究了10个大豆品种在吸胀期对冷害的敏感性的差异。结果表明： （1）依据对低温反应的差异，各品种可归为三种类型：a）冷敏感型，低温处理使其各种萌发指标大幅度下降;b）抗冷型，低温处理使其各种萌发指标下降很小;c）中抗型，介于两者之间。 （2）低温导致的冷敏感品种的ATP含量下降幅度大于抗冷型的。 （3）抗冷品种脱氢酶活性高，且低温导致的下降幅度小;而冷敏感品种则相反。 （4）抗冷性越强，SOD活性越高，MDA含量越低，且低温导致的MDA含量的升高也越小。 （5）除个别品种外，低温导致的敏感品种的电导率升高大于抗冷型的。 （6）低温处理下，抗性品种的胚根细胞仍具有较高的ATPase活性，含有大量液泡和内质网;而冷敏感品种不仅ATPase活性低，且只有蛋白体和拟脂体，未见到液泡和内质网。 依据以上结果，提出了大豆吸胀冷害的可能机制：低温下质膜修复与重建、ATP迅速产生及一些酶的活化的受阻可能是大豆吸胀冷害的原初反应，由此导致一系列生理、生化紊乱，以致于萌发缓慢，活力降低。 我们建议萌发生理测定、ATP含量测定及电导实验可用做大豆抗冷性的评价。

云南文山黄牛和迪庆黄牛的遗传多样性比较研究

本文通过细胞遗传学、mtDNARFLP（线粒体DNA、限制性片段长度多态性）和血液蛋白及同工酶3个方面的研究，分析了云南文山黄牛和迪庆黄牛的遗传多样性和遗传分化关系。结果：（1）细胞遗传学云南两个地方黄牛品种的Y染色体形态及其C一带具有显著多态性。文山黄牛和迪庆黄牛分别为一小的近端部和亚申部（或中部）着丝位Y染色体，并分别在Y染色体的臂端部和短臂的臂端部显示弱阳性C一带，说明文山黄牛的父系起源可能是瘤牛（Bosindicus），而迪庆黄牛是普遍牛（Bostaurus）。推测两种Y染色体可能是臂问倒位的结果。（2）mtD－NARFLP两个黄牛品种的111个个体的mtDNA经8种限制性内切酶酶切后，有个酶表现出多态，共检测到17种限制性态型。归结出的3种基因单倍型，分别是A－A－A－A－A－A－A型（瘤斗）、B－B－B－B－B—B－B型（普通型）和A－C－B－B－C－A－A型（耗半Bosgrunniens）。从基因单倍型在群体中的表现可看出，文山黄牛和迪庆黄牛都具有瘤牛和普通牛两种母系起源。但文山黄牛以瘤牛血统为主，迪庆黄牛以普通牛血统为主，而且还可能含有部价耗牛的血统。（3）血液蛋白及同工酶分析了两个黄牛品种的...

Some new bounds on eigenvalues of the Hadamard product and the Fan product of matrices

Let A and B be nonsingular M-matrices. A lower bound on the minimum eigenvalue q(B circle A(-1)) for the Hadamard product of A(-1) and B, and a lower bound on the minimum eigenvalue q(A star B) for the Fan product of A and B are given. In addition, an upper bound on the spectral radius rho(A circle B) of nonnegative matrices A and B is also obtained. These bounds improve several existing results in some cases and the estimating formulas are easier to calculate for they are only depending on the entries of matrices A and B. (C) 2009 Elsevier Inc. All rights reserved.

利用夏季自然发情的云南黄牛进行奶牛胚胎移植效果研究

利用夏季自然发情的云南黄牛为受体,开展了奶牛体内冷冻胚胎移植.留用的114头受体牛中,本地黄牛59头,年龄在3～10岁,均为经产牛,最终移植27头,西杂牛56头(其中2岁以下的青年牛26头),移植29头(青年牛11头),两个品种受体利用率分别为45.8%和51.8%;移植后妊娠率分别为59.3%和55.2%;解冻的63枚胚胎移植给了56头受体牛,A级胚胎单独移植和B、C级胚胎搭配移植最终妊娠结果分别是58.5%(24/41)和53.3%(8/15);发情后第6 d和第7 d移植妊娠率分别为56%和58.1%.结果表明,1～10岁的西杂牛和3～10岁体型较大的本地黄牛均可作为受体移植奶牛胚胎;利用自然发情的云南黄牛做受体移植效果较为理想,是一种经济、方便、适合云南广大农村推广的技术途径;A级胚胎单独移植和B、C级搭配移植可获得较为理想的妊娠结果;处于发情后第6 d和第7 d的云南黄牛都可以作为桑囊期奶牛胚胎的移植受体.