稻属Oryza rufipogon和Oryza nivara的遗传多样性和居群分化研究

普通野生稻(Oryza rufipogon Griff.)和尼瓦拉野生稻(O. nivara Sharma et Shastry)是亚洲栽培稻的最近缘野生种，是亚洲栽培稻育种和遗传改良的重要基因库。由于人类的破坏、生境片段化及亚洲栽培稻的遗传渐渗等因素，这两种野生稻处于濒危状态而急需保护。本文用微卫星标记研究中国普通野生稻居群的遗传多样性和居群分化，用核基因序列研究了全分布区的普通野生稻和尼瓦拉野生稻的遗传变异及模式，同时发现了巴布亚新几内亚普通野生稻的特殊分子变异。主要结果如下： 取自中国普通野生稻四个主要分布区的12个天然居群，共237份个体材料，利用10对微卫星引物对遗传多样性进行比较研究。结果表明这些居群的遗传多样性处于中高水平，其中每个位点的等位基因数之在2至18之间不等，平均10.6个，多态位点比率P从最低40.0%最高100%，平均为83.3%。观察杂合度在 (HO) 0.163-0.550变化，平均为0.332, 期望杂合度(HE) 在0.164- 0.648，平均 0.413，从地区来看，广西居群的遗传多样性水平是最高的，其次是广东、海南居群，江西的最低。这些结果与以前用其他分子标记得到的结果基本一致。但是本研究得到的居群间遗传分化却相对较高，分化系数RST为 0.5199，θ为 0.491，这表明一半左右的遗传变异存在于居群之间。两两居群之间的分化系数(pairwise θ)与地理距离呈正相关(r = 0.464)，这表明中国普通野生稻居群之间的遗传分化是由于地理的隔离造成的。造成目前这种遗传结构和分化模式的主要原因在于普通野生稻生境的破坏和生境的片段化。 选择6个普通野生稻居群，5个尼瓦拉野生稻居群共11个居群105个个体材料为研究对象，取样覆盖两个野生稻的主要分布区，用核基因片段Lhs1研究了这两种野生稻的序列水平的变异，探讨了它们的遗传结构和基因流方向。结果表明，普通野生稻的核苷酸多样性，无论在居群还是物种水平上，均显著高于尼瓦拉野生稻的。在居群水平上，普通野生稻的核苷酸多样性(Hd = 0.712; θsil = 0.0017)是尼瓦拉野生稻的2-3倍(Hd = 0.306; θsil = 0.0005)。AMOVA的结果表明，尼瓦拉野生稻居群之间的遗传分化(78.2%)显著高于普通野生稻居群间的分化(52.3%)。造成这种不同层次的遗传多样性和完全不同的遗传分化模式的原因在于这两种野生稻差异显著的生活史和交配系统。普通野生稻是多年生、异交的野生种，营养与有性繁殖混合，尼瓦拉野生稻为一年生的自交种，靠种子繁殖。模拟分析表明，二者之间的基因流方向是单向的，明显是从自交的尼瓦拉野生稻到异交的普通野生稻，基因流在这两个野生 稻遗传多样性模式的形成上，扮演至关重要的角色。 对于稻属A基因组物种的进化和多样性来说, 巴布亚新几内亚(PNG)是个很重要的地方。我们用两个核基因和一个叶绿体基因，对巴布亚新几内亚的普通野生稻样品进行了序列分析，结果发现来自巴布亚新几内亚北部Sepik河谷的普通野生稻样品在核基因Os0053位点和叶绿体基因序列上与其他地区的样品有很大的差异。巴布亚新几内亚北部的普通野生稻在Os0053位点上杂合的，其中一条等位基因与普通野生稻基本一致，另一条等位基因则与A基因组的另一个物种O. meridionalis基本一致，证明巴布亚新几内亚北部的普通野生稻实际上是亚洲典型普通野生稻与澳洲野生稻O. meridionalis种间进行天然渐渗杂交的后代。这个结果从分子序列上验证了前人有关巴布亚新几内亚北部的普通野生稻是比较特殊的观点。

大白菜自交不亲和性机制的研究

本文以结构与功能相结合为研究的指导原则，对大白菜的自交不亲和性的作用机制进行了研究探讨。 本研究建立了用双向电泳技术分析柱头和花粉蛋白质的方法，并用此方法对四个不同S基因的大白菜的柱头、花药和花粉壁蛋白进行了分析。在花药和花粉中找到三个S基因相关的特异糖蛋白，与柱头蛋白比较发现这三个特异糖蛋白有的存在于柱头中。对叶片蛋白的分析未能看到差异的蛋白。 用水溶性苯胺兰染色紫外荧光观察表明，在蕾期自交授粉和花期杂交亲和授粉中，柱头乳突无胼胝质反应。在花期和花前一天的蕾期自交授粉中柱头乳突有胼胝质沉积。对三个自交不亲和程度不同的自交系的比较发现，柱头乳突的胼胝质荧光反应与自交不亲和性的程度有相关性。本文认为胼胝质反应对自交不亲和性有重要意义。 扫描电镜观察了自交，杂交和蕾期自交授粉中花粉在柱头表面的行为。并注意到柱头乳突表面有分泌液滴存在，这些液滴与花粉的粘着有关。 用镣红染色的方法在透射电镜下观察到柱头表面的表膜。在超微结构水平证明表膜中糖聚物的存在。超微结构研究表明，自交不亲和授粉中，花粉管均卷曲或膨大，没有进入乳突细胞壁，在不亲和花粉管与乳突壁接触处细胞壁增厚，角质层消失，花粉管壁内层也变薄消失。蕾期自交和花期杂交授粉中的现象比较相似，有大量花粉管进入乳突壁。对柱头不同发育时期柱头乳突的超微结构进行了比较，并讨论了其与自交不亲和性的关系。 本文对孢子体型自交不亲和性的识别的分子作用方式及由此引起的一系列拒绝反应间的关系进行了讨论。

青蒿反义鲨烯合酶基因对烟草的转化

利用反义技术研究生物代谢途径以及对其生物合成进行调控成为植物次生代谢研究领域内一个重要手段之一，并与新兴的RNAi技术一起成为本领域内重要的研究热点。在植物类异戊二烯代谢途径中存在着羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)、法呢基焦磷酸合酶（FPS）和鲨烯合酶（SQS）等几种关键的分支酶，他们被认为在异戊二烯类的生物合成中发挥着关键的调节作用。其中，鲨烯合酶处于HMGR和FPS的下游，并与倍半萜合酶等利用共同的前体－法呢基二磷酸（FPP），以FPP起始合成一系列的下游产物。因此，FPP成为类异戊二烯途径中的关键调节点之一。本论文基于此目的，利用反义技术研究了FPP合成鲨烯这一途径受到抑制对其他以FPP为生物合成前体的代谢支路的影响。 利用植物双元转化载体pBI121，将青蒿中鲨烯合酶基因的cDNA（约1.5kb）序列插入到pBI121中，取代原有的GUS序列，构建成植物转化载体pBIASS。以根癌农杆菌为介导，将青蒿鲨烯合酶反义基因序列导入到烟草，整合到其基因组中 ，成功获得转基因植株。对转基因烟草进行分子检测表明，外源鲨烯合酶基因的序列已经稳定整合到烟草基因组中，并对内源的烟草鲨烯合酶基因表达产生影响。转基因烟草中检测到内源鲨烯合酶基因的mRNA的水平降低。对鲨烯合酶下游产物之一的胆固醇的含量分析显示，活性减低的鲨烯合酶使胆固醇的生物合成下降约40％左右。同时，另一条以FPP为共同前体的二萜代谢途径产物之一GA3的含量得到了提高，比对照提高约30％。