疣粒野生稻居群遗传结构及其形成与维持机制的研究

结合野外生态调查与分子标记检测，本文探讨了显性遗传标记应用于居群遗传学研究时实验与数据分析需要注意的问题，并在此基础上对中国分布的疣粒野生稻（Oryza granulata Nees et Am. ex Watt.）居群遗传多样性与居群遗传结构进行了研究。然后从metapopulation结构动态、无性系生长和物种形成等角度研究了遗传结构的空间格局与生态学、系统学因素之间的相互作用，并将研究的空间尺度从聚群内（colony）、居群内、地区内推广到地区间和整个物种水平，反映了在不同空间等级上疣粒野生稻相异的进化模式。最后，综合上述结果，提出了保护疣粒野生稻的原则和策略。结果如下： 1．根据对分布于中国云南和海南33个分布点疣粒野生稻居群所做的野外生态学调查，该物种目前在中国的30个县（市）有分布，比1978-1982年全国野生稻普查时增加了3个县市（海南通什、云南思茅和勐腊）。疣粒野生稻具有较强的耐荫和抗旱能力，在群落总盖度为90-210%范围内生长良好。它是一种典型的适应中度干扰的物种，生长于有一定干扰的斑块状生境中。疣粒野生稻在群落内的分布格局为聚集型，其居群密度较小（1.13-2.95株/m2），依靠重力下落和动物传播种子。由于对热区资源的掠夺性开发，总计有12.9%的居群已因人为干扰而灭绝，83.9%的居群处于严重的危胁之下，处于濒危状态。对疣粒野生稻的破坏在不同地区间程度不同，生境恶化和放牧是造成其居群灭绝的最主要原因，对其进行保护已经迫在眉睫。在调查的基础上，本研究建立了含该物种34个居群共1109份个体样品的总DNA库，作为易位保护的一种措施，主要用于居群遗传学和保护生物学研究。 2．利用上述总DNA库中的材料，首先采用随机扩增多态（RAPD）对几类显性标记的居群遗传结构参数进行了比较。在衡量遗传多样性水平时，多态位点比率（PPB）会低估变异的程度，其价值不如Shannon多样性指数和Nei多样性指数。在计算个体之间的遗传关系时，Mantel检测表明17种相似性系数之间存在极显著的相关性。同时，基于Φst。遗传距离的分子方差分析（AMOVA）和基于Hardy-Weinberg平衡假设的Nei氏遗传距离分析的结果间具有显著的相关性，它们都适用于对疣粒野生稻居群遗传结构进行研究，且在使用后者时应对数据进行Lynch-Milligan矫正，剔除隐性基因型（0）频率小于3/N（N为样本总数）的条带数据，以矫正显性遗传方式对变异估计偏低的影响。此外，各类遗传结构分析参数之间的高度相关性也与疣粒野生稻居群内遗传多样性低，杂合体比率较低有密切关系。 利用RAPD和inter-简单重复序列（ISSR）对来自中国20个居群疣粒野生稻混合样品，以及海南（M5）和云南（M27）两个居群各20个植株的遗传多样性进行了检测。ISSR的实验稳定性优于RAPD，且总的来说它能检测到更多的遗传变异。前者与它在PCR反应时退火温度较高，引物．模板复合物较稳定有关;而后者则与其引物靶序列容易在细胞分裂中产生突变有关。Mantel检测结果表明，衡量样品间的遗传关系时，这两种标记的分析结果在物种水平存在极显著的相关性（r = 0.917, t = 12789），而在居群水平不相关（r < 0.200）。这不但与它们所扩增的相应基因组片断的变异方式及在居群内分辩率下降有关，同时也反映了疣粒野生稻居群内和居群间存在着不同的进化模式。 3．利用RAPD和ISSR标记，对中国20个居群疣粒野生稻混合样品的遗传多样性进行了研究。RAPD和ISSR分别扩增出209和122条PCR条带，其中各有64.1l％（134条带）和72.95％（89条带）为多态条带。基于Jaccard系数的UPGMA分析表明，同一地区内居群的遗传变异比较小。20个居群按来源聚为云南与海南两类，其间产生了一定程度的遗传分化。这种遗传多样性分布的特点可能与其起源、分布格局、交配系统和种子散布方式有关。此外，尽管混合取样会低估一定的遗传变异能力，也不能得到关于居群内的遗传结构情况，但它仍然是一种获取遗传多样性信息的高效方法，适用于对研究材料进行日常管理和评价。 4．按照居群取样的方法，利用RAPD对来自中国云南和海南的20个疣粒野生稻居群共396个植株进行了遗传结构分析。联合ISSR，对其中5个居群初步的分析表明该物种在居群内的遗传多样性水平很低，RAPD的多态位点比率（PPB）在居群内从4.52％到13.06％;而ISSR的PPB值在居群内从7.08％-26.55％。AMOVA分析表明，对于RAPD来说，云南与海南两地区之间遗传变异的量占总变异量的73.85％，地区之内占19.45％，而居群内仅占6.70％。对于ISSR，疣粒野生稻地区间，地区内和居群内遗传变异的分布比率分别为49.26％、38.070A和12.66％。UPGMA聚类将同一居群内的个体聚为一支，并将居群按来源分为云南和海南两类。由于疣粒野生稻在群落内的分布为典型的metapopulation格局，伴随各聚群（colony）在群落次生演替过程中周转（灭绝与定植）时发生的遗传漂变、建立者效应和居群内强烈的近交是造成其居群内遗传多样性极低的主要原因。 5．利用10个ISSR标记对中国4个疣粒野生稻居群内的无性系生长与基因型遗传多样性进行了分析。在小尺度取样（个体间隔1.0-1.5m）的情况下，所有居群中均检测到明显的无性系生长现象。参与无性系生长的个体百分比在各居群中从25％-60％不等，Simpson多样性指数表明疣粒野生稻居群内的基因型多样性保持在较高水平（0.837-0.958）。尽管如此，AMOVA对居群内遗传变异进行方差剖分的结果表明参与无性生长的个体所含有的变异量平均只占总变异量的16.7%。因此，疣粒野生稻居群内遗传变异的来源主要依靠有性生殖来维持。同时，处于人为中度干扰之下的疣粒野生稻居群不但个体密度较高，其居群遗传多样性也未因此而降低。 6．在假设RAPD在同一种及其近缘种内PCR产物同源性较高的前提下，利用该技术对来自世界的23份O. granulata和O. meyeriana样品进行了遗传多样性分析和系统学研究。在物种水平，O. granulata具有非常高的遗传多样性（多态位点比率达83.54％），表明该物种进化历史中存在大规模居群瓶颈效应的可能性较小。O.gramulata与O. meyeriana各居群的遗传分化与岛屿形成导致的地理隔离之间有密切的关系。基于Nei & Li遗传相似性系数，利用Neighbor-Joining和UPGMA聚类法构建的两个系统树并不完全一致。主坐标分析（PCoA）支持NJ法的结果：来自O.meyeriana的两个样品倾向于聚为一类，并获得bootstrap分析的支持，但它们的遗传变异范围并未超出O. granulata。因此，我们的结果支持将这两个种进行归并。 7．由于疣粒野生稻在物种水平的遗传多样性非常高，变异主要存在于各地区之间，因此要最大程度地维持该物种遗传多样性，使之不发生遗传侵蚀意味着保护应该针对整个物种的分布区进行。对于分布于中国的居群来说，一方面由于变异主要存在于云南和海南两地区之间，另一方面由于地区内和居群内的遗传多样性相对较低，因此，云南和海南应做为中国保护该物种的两个中心。此外，由于一定程度的人为干扰有利于为该物种创造适宜生境，增加其居群密度，且不会致使遗传变异能力下降，因此在实施就地保护时应充分考虑将其与当地的经济开发项目相结合，达到自然保护与地方经济可持续发展的目的。

新生代孢粉分析与古气候定量重建的研究

定量重建地球生态系统的气候参数是当前国际古气候研究的目标之一. 自20世纪70年代以来, 尤其是在海洋学研究领域, 新技术的不断应用使得定量的古气候研究蓬勃发展. 相比之下陆地古气候参数的重建要困难得多, 陆地植物作为对环境的良好记录，一直备受重视. 近数十年来, 国际上广泛开展了利用植物材料定量研究气候的探索, 大量新的方法层出不穷. 德国科学家Mosbrugger和Utescher在1997年倡导的共存分析法(The Coexistence Approach)就是其中之一, 它依据现存最近亲缘类群原理以及植物分布与气候的关系原理, 找到化石植物群中各类群的现存最近亲缘类群对各气候参数的耐受范围; 并将各亲缘类群对同一气候参数的耐受范围叠加一起, 获得对该气候参数的共存区间, 用该区间作为对古气候参数的精确估测. 本文首先阐述在原文位于展开讨论的共存分析的理论基础——探讨植物分布与气候之间关系的耐受性理论. 并以此为指导, 对在该方法中气候台站的选用方法作了改进, 气象台站的选择应以植物的标本记录点为基础: 即使在某一特定的植物分布区内部也应该查看气象台站所在县级行政区域是否有该植物的标本采集信息, 并以此为依据来决定是否选用该气象台站的记录; 选用的气象台站的数量多寡应该以植物分布点的多少来决定. 以此为基础, 我们采用中国的植物分布与气象记录数据, 利用孢粉学的研究结果，定量重建了我国新生代三个地点的古气候参数, 结果如下: 1.内蒙古呼伦湖地区全新世初期气候 MAT: 4.4~10.2℃; MWMT: 22.9~24.1℃; MCMT: -18~-9.1℃; DT: 33.5~40.9℃; MAP: 354.3~686.7mm; MMaP: 103.8~191.9mm; MMiP: 2.7~7.3mm. 我们以扎赉诺尔地区的孢粉学研究为基础, 依据孢粉和盘星藻(Pediastrum Meyen)提供的环境信息并结合前人工作, 恢复了全新世初升温期的植被变化; 定量重建了10.4~10.2kaB.P.时的气候, 为全面理解呼伦湖地区的气候变化以及东亚的夏季风变化提供新的依据. 2.云南洱源上新世气候 MAT: 13.3~18.6℃; MWMT: 24.6~27.5℃; MCMT: 1.9~12.1℃; DT: 14.2~16.6℃; MAP: 619.9~1484.3mm; MMaP: 143.8~245.6mm; MMiP: 12.7~16.4mm. 该结果与羊邑、龙陵上新世古气候及三地的现代气候分析对比表明, 在上新世, 三地年均温符合纬向变化, 而降水量则基本一致. 在现代，洱源与羊邑在气候与植被上很相近, 且与上新世相差不大; 而龙陵地区则发生了显著的变化, 年均温比上新世低, 而降水量则大幅增加. 该变化指示了上新世以来作为青藏高原东部边缘的龙陵地区可能出现了地形的抬升. 3.吉林珲春始新世和中新世气候 始新世: MAT: 14.3~14.9℃; MWMT: 25~26.3℃; MCMT: 1.9~3.7℃; DT: 21.7~23℃; MAP: 797.5~1344mm; MMaP: 185.3~209.8mm; MMiP: 14.2~16.4mm. 中新世: MAT: 14.3~14.9℃; MWMT: 24.3~25.4℃; MCMT: 2.1~3.7℃; DT: 21.7~22.7℃; MAP: 658.7~817.7mm; MMaP: 158.9~174.6mm; MMiP: 7.4~7.6mm. 通过对两个时段的气候参数对比, 始新世时, 吉林珲春地区的气候属于北亚热带气候; 中新世时气候发生了改变, 归属于暖温带南部的气候, 改变了前人关于中新世也归属于被亚热带的认识, 这反映了我国东北部地区与全球新生代降温总趋势具有一定的同步性.

水飞蓟原生质体培养形成愈伤组织及组织培养再生植株

本论文对药用植物水飞蓟Silybum marianum Gaertn 进行了原生质体培养和组织培养的研究，获得如下结果： 1、以水飞蓟叶片愈伤组织为材料，系统地研究了植物材料生理状态，酶液配比及酶的浓度、酶解时间长短等对原生质体产率的影响。探讨了原生质体培养过程中材料的生理状态、激素、附加物及培养方法对于原生质体分裂频率的影响，还比较分析了培养后期不加液及加各种细胞培养液对原生质体来源的细胞团的影响，最后进行了愈伤组织分化的诱导。选取继代一年的水飞蓟叶愈伤组织转代十天后挑选愈伤组织表面生长旺盛的细胞层置于Onozuka R-103% Macerozyme R-10 0.8%的CPW混合酶液（PH 5.6～5.3）中，30℃下酶解5小时后所得原生质体产率最高。适合于水飞蓟原生质体培养的基本培养基为TCCW烟草原生质体培养基~[18]。用低融点琼脂糖（0.3%）平板培养法培养得到的分裂频率显著高于液体浅层法。在培养基中加入羟脯氨酸（100mg/l）和谷氨酰胺（200mg/l）可促进原生质体分裂。在飞蓟原生质体培养中能获得最高分裂频率（35.4%）的激素组合为2.4-D、1mg/l Kn0.5mg/l。在培养过程中每隔二周必须加液，否则细胞团褐化并全部死亡，同时要求降低细胞培养液的Kn浓度（由0.5mg/l、降到0.1mg/l）才能使细胞团继续长大。从水飞蓟原生质体培养得到的愈伤组织色浅黄，结构疏松，转至MS附加NAA0.8mg/l、6－BA 2mg/l、水解酪蛋白200mg/l的固体培养基上愈伤组织表面出现许多绿色芽点，但尚未得到再生植株。 2、以萌发两周后的水飞蓟种子无菌苗为材料，切取下胚轴于MS附加NAA0.8mg/l、6－BA0.5mg/l、水解酪蛋白200mg/l的固体培养基上诱导出愈伤组织，再转入MS附加NAA0.8mg/l、6－BA2mg/l、水解酪蛋白200mg/l的分化培养基后，愈伤组织表面分化出芽，再生苗的频率为75%，然后移至MS附加NAA0.5mg/l、IBA0.1mg/l、水解酪蛋白200mg/l的培养基上分化出大量的根，并得到了大量健壮的植株。