疣粒野生稻居群遗传结构及其形成与维持机制的研究

结合野外生态调查与分子标记检测，本文探讨了显性遗传标记应用于居群遗传学研究时实验与数据分析需要注意的问题，并在此基础上对中国分布的疣粒野生稻（Oryza granulata Nees et Am. ex Watt.）居群遗传多样性与居群遗传结构进行了研究。然后从metapopulation结构动态、无性系生长和物种形成等角度研究了遗传结构的空间格局与生态学、系统学因素之间的相互作用，并将研究的空间尺度从聚群内（colony）、居群内、地区内推广到地区间和整个物种水平，反映了在不同空间等级上疣粒野生稻相异的进化模式。最后，综合上述结果，提出了保护疣粒野生稻的原则和策略。结果如下： 1．根据对分布于中国云南和海南33个分布点疣粒野生稻居群所做的野外生态学调查，该物种目前在中国的30个县（市）有分布，比1978-1982年全国野生稻普查时增加了3个县市（海南通什、云南思茅和勐腊）。疣粒野生稻具有较强的耐荫和抗旱能力，在群落总盖度为90-210%范围内生长良好。它是一种典型的适应中度干扰的物种，生长于有一定干扰的斑块状生境中。疣粒野生稻在群落内的分布格局为聚集型，其居群密度较小（1.13-2.95株/m2），依靠重力下落和动物传播种子。由于对热区资源的掠夺性开发，总计有12.9%的居群已因人为干扰而灭绝，83.9%的居群处于严重的危胁之下，处于濒危状态。对疣粒野生稻的破坏在不同地区间程度不同，生境恶化和放牧是造成其居群灭绝的最主要原因，对其进行保护已经迫在眉睫。在调查的基础上，本研究建立了含该物种34个居群共1109份个体样品的总DNA库，作为易位保护的一种措施，主要用于居群遗传学和保护生物学研究。 2．利用上述总DNA库中的材料，首先采用随机扩增多态（RAPD）对几类显性标记的居群遗传结构参数进行了比较。在衡量遗传多样性水平时，多态位点比率（PPB）会低估变异的程度，其价值不如Shannon多样性指数和Nei多样性指数。在计算个体之间的遗传关系时，Mantel检测表明17种相似性系数之间存在极显著的相关性。同时，基于Φst。遗传距离的分子方差分析（AMOVA）和基于Hardy-Weinberg平衡假设的Nei氏遗传距离分析的结果间具有显著的相关性，它们都适用于对疣粒野生稻居群遗传结构进行研究，且在使用后者时应对数据进行Lynch-Milligan矫正，剔除隐性基因型（0）频率小于3/N（N为样本总数）的条带数据，以矫正显性遗传方式对变异估计偏低的影响。此外，各类遗传结构分析参数之间的高度相关性也与疣粒野生稻居群内遗传多样性低，杂合体比率较低有密切关系。 利用RAPD和inter-简单重复序列（ISSR）对来自中国20个居群疣粒野生稻混合样品，以及海南（M5）和云南（M27）两个居群各20个植株的遗传多样性进行了检测。ISSR的实验稳定性优于RAPD，且总的来说它能检测到更多的遗传变异。前者与它在PCR反应时退火温度较高，引物．模板复合物较稳定有关;而后者则与其引物靶序列容易在细胞分裂中产生突变有关。Mantel检测结果表明，衡量样品间的遗传关系时，这两种标记的分析结果在物种水平存在极显著的相关性（r = 0.917, t = 12789），而在居群水平不相关（r < 0.200）。这不但与它们所扩增的相应基因组片断的变异方式及在居群内分辩率下降有关，同时也反映了疣粒野生稻居群内和居群间存在着不同的进化模式。 3．利用RAPD和ISSR标记，对中国20个居群疣粒野生稻混合样品的遗传多样性进行了研究。RAPD和ISSR分别扩增出209和122条PCR条带，其中各有64.1l％（134条带）和72.95％（89条带）为多态条带。基于Jaccard系数的UPGMA分析表明，同一地区内居群的遗传变异比较小。20个居群按来源聚为云南与海南两类，其间产生了一定程度的遗传分化。这种遗传多样性分布的特点可能与其起源、分布格局、交配系统和种子散布方式有关。此外，尽管混合取样会低估一定的遗传变异能力，也不能得到关于居群内的遗传结构情况，但它仍然是一种获取遗传多样性信息的高效方法，适用于对研究材料进行日常管理和评价。 4．按照居群取样的方法，利用RAPD对来自中国云南和海南的20个疣粒野生稻居群共396个植株进行了遗传结构分析。联合ISSR，对其中5个居群初步的分析表明该物种在居群内的遗传多样性水平很低，RAPD的多态位点比率（PPB）在居群内从4.52％到13.06％;而ISSR的PPB值在居群内从7.08％-26.55％。AMOVA分析表明，对于RAPD来说，云南与海南两地区之间遗传变异的量占总变异量的73.85％，地区之内占19.45％，而居群内仅占6.70％。对于ISSR，疣粒野生稻地区间，地区内和居群内遗传变异的分布比率分别为49.26％、38.070A和12.66％。UPGMA聚类将同一居群内的个体聚为一支，并将居群按来源分为云南和海南两类。由于疣粒野生稻在群落内的分布为典型的metapopulation格局，伴随各聚群（colony）在群落次生演替过程中周转（灭绝与定植）时发生的遗传漂变、建立者效应和居群内强烈的近交是造成其居群内遗传多样性极低的主要原因。 5．利用10个ISSR标记对中国4个疣粒野生稻居群内的无性系生长与基因型遗传多样性进行了分析。在小尺度取样（个体间隔1.0-1.5m）的情况下，所有居群中均检测到明显的无性系生长现象。参与无性系生长的个体百分比在各居群中从25％-60％不等，Simpson多样性指数表明疣粒野生稻居群内的基因型多样性保持在较高水平（0.837-0.958）。尽管如此，AMOVA对居群内遗传变异进行方差剖分的结果表明参与无性生长的个体所含有的变异量平均只占总变异量的16.7%。因此，疣粒野生稻居群内遗传变异的来源主要依靠有性生殖来维持。同时，处于人为中度干扰之下的疣粒野生稻居群不但个体密度较高，其居群遗传多样性也未因此而降低。 6．在假设RAPD在同一种及其近缘种内PCR产物同源性较高的前提下，利用该技术对来自世界的23份O. granulata和O. meyeriana样品进行了遗传多样性分析和系统学研究。在物种水平，O. granulata具有非常高的遗传多样性（多态位点比率达83.54％），表明该物种进化历史中存在大规模居群瓶颈效应的可能性较小。O.gramulata与O. meyeriana各居群的遗传分化与岛屿形成导致的地理隔离之间有密切的关系。基于Nei & Li遗传相似性系数，利用Neighbor-Joining和UPGMA聚类法构建的两个系统树并不完全一致。主坐标分析（PCoA）支持NJ法的结果：来自O.meyeriana的两个样品倾向于聚为一类，并获得bootstrap分析的支持，但它们的遗传变异范围并未超出O. granulata。因此，我们的结果支持将这两个种进行归并。 7．由于疣粒野生稻在物种水平的遗传多样性非常高，变异主要存在于各地区之间，因此要最大程度地维持该物种遗传多样性，使之不发生遗传侵蚀意味着保护应该针对整个物种的分布区进行。对于分布于中国的居群来说，一方面由于变异主要存在于云南和海南两地区之间，另一方面由于地区内和居群内的遗传多样性相对较低，因此，云南和海南应做为中国保护该物种的两个中心。此外，由于一定程度的人为干扰有利于为该物种创造适宜生境，增加其居群密度，且不会致使遗传变异能力下降，因此在实施就地保护时应充分考虑将其与当地的经济开发项目相结合，达到自然保护与地方经济可持续发展的目的。

银杉的分子谱系地理学研究

银杉（Cathaya argyrophylla）是中国特有的濒危裸子植物，孤立分布于我国亚热带山地。虽然以往等位酶和RAPD标记的研究表明，银杉群体的遗传多样性水平很低而群体间的遗传分化很高，但迄今对该种群体的动态变化以及物种的进化历史仍缺乏了解，包括影响群体遗传结构的因素以及物种可能的避难所等，对如何有效地保护和恢复银杉群体仍缺乏科学依据。本文根据8个核基因片段和2个线粒体片段的序列数据，运用群体遗传学和谱系地理学方法，探讨了银杉在DNA水平上的多样性和群体的动态历史，探讨了影响银杉特殊的群体遗传结构的各种因素，并推测了银杉第四纪冰期的避难所，对银杉花粉活力及其变异进行检测。在此基础上，提出了保护和恢复银杉群体的具体策略和措施。主要研究结果如下： 　　1. 核甘酸多态性和群体遗传结构 　　从101个核基因片段中筛选了8个适用于银杉的片段，对来自四个地区15个群体共86个个体的胚乳总DNA进行了扩增和测序。8个核基因座位的平均核苷酸多态性（θs＝0.0022，πs＝0.0027）显著低于其它松杉植物遗传多态性的多座位估计值。四个地区中，大瑶山（DY）的多态性最高（θs＝0.0026，πs＝0.0027），八面山（BM）最低（θs＝0.0014，πs＝0.0018），大娄山（DL）和越城岭（YC）介于二者之间。大多数座位内的多态位点间紧密连锁，座位间的连锁只在八面山地区检测到。AMOVA分析表明显著性的多态性比例存在于地区间（20.05％）和地区内群体间（9.37％）。FST分析也显示群体间（FST＝0.294）和地区间（FST =0.131-0.319）存在显著的遗传分化。推测伴随着瓶颈效应而出现的遗传漂变及其有限的基因流（Nm=1.2）是导致银杉群体低水平多态性和群体间强烈分化的主要原因。 　　2．谱系地理学分析 　　利用2个线粒体片段（nad1和nad4）序列以及高变异量的核2009片段序列对银杉的谱系地理进行了探讨。2个线粒体片段的多态位点组合成3种单倍型，将银杉分成大娄山（DL）、八面山（BM）以及越城岭（YC）和大瑶山（DY）3个地区，地区间的单倍型完全不同（GST=1.0），结合核基因呈现的群体遗传结构，推测现存银杉群体至少来源于4个冰期避难所，相当于银杉现存的4个相互隔离的地区。2009座位上12个变异位点组合成8种单倍型，位于单倍型谱系内部节点的4种祖先单倍型分布广泛、出现频率最高，其它7个核基因座位具有类似谱系结构。遗传距离和地理距离没有相关性，NST (0.138)与GST (0.134)没有显著性差异，说明现存的银杉群体是相对较近的时间内片断化的产物。2009片段分离位点的失配分布（mismatch distribution）呈双峰和多峰，表明银杉群体没有经历近期的扩张，与古生物学研究证据相吻合。 　　3. 银杉的基因杂合性和花粉生命力 　　利用2009和cad两个核基因片段，采用多胚乳序列法得到总的杂合体比率为64％（2009）和60％（cad），说明银杉群体中存在高比例的杂合体。大娄山地区的杂合体比率是八面山地区的2倍。银杉杂合体比率的高低可能与其遗传多态性有关，也可能是自然选择的结果。采用TTC染色法对银杉的花粉生命力进行了测定，在干燥低温条件下银杉花粉的活力很稳定，保存一年后有活力的花粉数仍高达80％以上。通过对来自两个地区（DY和YC）7个群体共16个银杉个体花粉活力的测定发现，银杉有活力花粉比例高达93.3％，与其它裸子植物相当。花粉活力在地区间和群体间存在显著差异，花坪地区（95.2%）的花粉活力高于大瑶山（91.3%）。花粉活力在群体内个体间差异不显著。 　　4．银杉的进化历史及其保护 　　银杉的低水平的遗传多样性和独特的群体遗传结构对我们推测其冰川期避难所提供了重要依据。本研究在银杉4个孤立分布区发现了彼此不重叠的线粒体单倍型，同时核基因表现出了4个地理群，说明随着第四纪冰期气候的波动和银杉分布范围的片段化，原来广布的群体逐步萎缩，最后被保留在位于西部大娄山（DL），东部八面山(BM)，中南部越城岭(YC)和南部大瑶山(DY) 4个相互隔离的避难所。银杉独特的群体结构和动态历史对进一步制定相应的保护措施具有重要参考价值。由于遗传多态性很低，群体又小，几乎所有现存的银杉群体都面临由于随机事件导致的物种灭绝。更严重的是，当前该物种的适生环境不断恶化和片段化，以及异常低的生殖和存活率导致银杉与其它物种竞争能力很低。因此，除目前采取的原地保护策略外，迁地保护应给予优先考虑。此外，采用传统的控制授粉策略（在遗传上有显著差异的群体间开展人工杂交）是丰富其遗传多态性、恢复衰退群体的可行措施之一。