OsRMC基因调控水稻根生长发育的机理研究

实验室前期工作证明OsRAA1在玉米泛素启动子驱动下组成型表达，可以抑制水稻初生根的生长，促进不定根的形成，形成不同程度螺旋状的初生根，根的向地性反应减缓，这些表型和野生型水稻用生长素处理的表型类似，而且OsRAA1基因的转录受生长素诱导，这些结果表明OsRAA1可能参与了生长素的信号转导途径。但这些表型产生的机理还不是很清楚。在水稻中，茉莉酸在根发育过程中的作用多为生理实验的报道;拟南芥中的研究表明生长素信号转导和茉莉酸信号转导可能都受26S蛋白酶体的调控。由此我们推测茉莉酸在根的发育过程中可能也起着同样的促进作用。本论文在超表达OsRAA1水稻基础上旨在克隆新基因，并对新基因功能进行研究，以探讨茉莉酸在水稻根发育过程中的分子机理，并对生长素和茉莉酸信号转导的关系进行探讨。 　　首先运用双向电泳技术结合质谱分析技术，在超表达OsRAA1水稻背景下发现了受体激酶家族DUF26的一个成员明显下调，我们命名为OsRMC（Oryza sativa Root Meander and Curling，AAL87185），Western杂交进一步证明了这个结果。 　　OsRMC位于4号染色体，信息学分析表明只有一个拷贝，没有内含子，ORF阅读框为777bp，编码的蛋白分子量为27.9 kDa，等电点（pI）为5.01。对该蛋白进行同源性比较发现，其含有2个C-X8-C-X2-C基序（Cys-rich repeat, CRR）即半胱氨酸富集区，其中第四个半胱氨酸残基不保守，该基序会形成二硫键，编码两个未知功能的DUF26（Domain Unknown Function 26）结构域。OsRMC由一个信号肽和两个CRR区组成，但没有跨膜区和激酶区。RT-PCR显示OsRMC可能是组成型表达的基因;亚细胞实验表明OsRMC是膜定位的蛋白。Western blot显示OsRMC受茉莉酸诱导表达，受生长素的抑制。 　　RNAiOsRMC转基因水稻在暗处培养时，抑制了初生根的生长，使侧根数目减少，但促进了不定根的生长和数目的增加;第二叶鞘变短，这些表型和前人报道的外源茉莉酸处理野生型的表型一致。转基因对生长素信号转导和合成没有影响，但初生根和第二叶鞘对外源茉莉酸更加敏感，说明RNAiOsRMC转基因水稻可能增强了茉莉酸信号转导途径。分析转基因水稻的茉莉酸信号转导途径部分相关基因的表达变化，根中受茉莉酸信号转导特异诱导的病原相关基因RSOsPR10的表达明显增多，而JAmyb和OsNDPK1的表达没有变化，证实转基因增强了茉莉酸信号转导其中的一个路径;进一步分析茉莉酸合成途径12-OXO-PDA（12-氧代-顺，顺-10，15-植物二烯酸）还原酶基因OsOPR的表达发现与野生型没有明显差别，说明转基因可能没有影响体内的茉莉酸合成途径。RNAiOsRMC转基因水稻的初生根比野生型的更容易发生弯曲，实验表明培养过程中茉莉酸和背触反应（negative thigmotropism）共同作用使转基因的初生根更容易发生卷曲，而光信号会增强卷曲程度。但RNAiOsRMC转基因水稻并没有影响根的向地性，暗示RNAiOsRMC转基因可能增强了根的回旋运动或（和）背触反应，从而促进了根的弯曲和卷曲。这些结果证明OsRMC参与的茉莉酸信号转导过程在水稻根的发育、弯曲和卷曲过程中起着重要的促进作用。通过对超表达OsRAA1和RNAiOsRMC转基因水稻的分析，说明水稻中存在着生长素信号转导促进茉莉酸信号转导的途径。 　　综合以上实验结果认为，OsRAA1调控了受体激酶家族DUF26的一个成员OsRMC，使其表达量降低，该过程增强了茉莉酸信号转导途径;确认了受体激酶家族DUF26的基因具有重要的生物学功能，证实了OsRMC调控的茉莉酸信号转导在水稻根系发育、根弯曲和卷曲过程中具有重要的促进作用;证明水稻中存在着生长素信号转导促进茉莉酸信号转导的途径，为完善各种植物激素调控水稻根系发育的网络提供了新的实验证据。 　　 　　

雪莲细胞培养物中黄酮类物质代谢调控及其生物活性成份分析

水母雪莲（Saussurea medusa Maxim.）和新疆雪莲（Saussurea involucrata Karel. et Kir.）是我国珍稀的药用植物资源，具有清热解毒、止痉镇痛、敛伤、消肿及治疗热病、风湿等多种功效。雪莲的主要药用成份为紫丁香甙（Syringin）、芦丁(Rutin)、高车前素（Hispidulin）和Jaceosidin等苯基丙酸类（phenylpropanoid）和黄酮类（flavonoids）物质。最新的药理研究表明，上述物质还具有抗菌消炎、保肝降压、延缓衰老和抑制癌细胞增殖等重要的研发价值。 雪莲生境恶劣，生长缓慢，人工引种困难，加上长期掠夺性采挖，已使雪莲处于灭绝的边缘。为了保存国家珍稀植物品种，保护生态环境，满足临床上对雪莲药物的需求，本研究在雪莲组织培养的基础上，应用诱导子添加技术和毛状根培养技术对雪莲中具有重要药用价值的次生代谢物质进行调控，并对雪莲MYB类转录因子的功能进行了初步探索，为保护珍稀植物资源、维护生态环境、开发野生雪莲替代产品、缩短雪莲药用成份的生产周期奠定了基础。另外，分析了野生雪莲和雪莲培养物中主要生物活性成份的种类及含量，为今后雪莲药理药效研究及品质评价奠定了基础。 为了提高雪莲黄酮的产量，满足工业化生产的需要，在细胞培养水平上，通过添加茉莉酸甲酯（MJ），对雪莲黄酮类物质的代谢进行调控。研究了诱导子的添加时间、添加浓度对水母雪莲红色系悬浮细胞的生物量和总黄酮产量的影响。发现在细胞培养的指数期（第9天）添加5.0 µmol/L的MJ，可以使总黄酮产量提高2.4倍（1134.5 ± 63.86 mg/L），而雪莲细胞干重（dw）仅比对照提高23.8 %（20.4 ±0.27 g/L）。另外，细胞中苯丙氨酸裂解酶（PAL）的活性分析表明，MJ添加后PAL活性的增加与雪莲总黄酮含量增长之间存在相关性。 在器官培养水平上，对雪莲毛状根的诱导频率及其培养条件进行了研究。结果表明，选择发根农杆菌R1601侵染预培养2天的新疆雪莲根段外植体，毛状根的诱导效率可达到83 %。毛状根的冠瘿碱检测、PCR和Southern分析表明，Ri质粒中的T-DNA已整合到植物基因组中并稳定表达。以新疆雪莲毛状根为外植体，能够容易地获得再生芽。在含有1.0 mg/L 6-BA的MS固体培养基上，其再生频率高达91 ± 5.9 %，是其正常根的2.4倍。而水母雪莲在该培养条件下，仅有少量的畸形芽出现。进而对毛状根的培养条件进行初步研究，结果表明在无激素附加的MS液体培养基中，新疆雪莲的HR1601根系在一个培养周期内（32 天），其生物量能够达到接种量的16倍，而紫丁香甙含量（43.5 ± 1.13 mg/g dw）能够达到野生雪莲的83倍。从而显示了雪莲毛状根培养体系的优良特性。 在基因水平上，对雪莲黄酮类物质代谢调控的研究已经展开。玉米P基因编码的Myb类转录因子能够调节黄酮类物质代谢途径关键酶基因的表达。根据P基因的保守序列设计引物，从雪莲细胞培养物中获得了SmP基因。核酸序列分析表明，SmP基因与烟草中涉及苯丙素类物质代谢途径的LBM 1、LBM 3和MybAS 1基因具有较高的一致性，分别为66 %、60 %和61 %。因此为了研究雪莲SmP基因的功能，构建了正义表达载体，并与先前构建好的反义表达载体分别导入烟草，分析了转基因植株的形态特征及黄酮类物质的含量变化。其中，约有30 %转反义SmP基因的株系表现叶片皱缩、叶脉紊乱、主侧脉角度缩小、叶片、花瓣失去对称性以及花粉败育等性状。 另外，通过正交试验设计优化了雪莲提取工艺的条件，并对雪莲细胞提取物进行了分离纯化。正交试验设计结果表明，温度对雪莲黄酮提取效率的影响极为显著，而分批多次提取比一次性浸提，能够收到较好的提取效果。考虑到工业生产中的实际问题，推荐在60 ℃水浴条件下，采用50 %乙醇对雪莲样品连续浸提2次的方案。对雪莲提取物的纯化研究表明，雪莲成份复杂，仅依靠单一的分离手段，往往难以奏效。另外，野生雪莲及雪莲培养物中生物活性成份的比色法、HPLC（High Performance Liquid Chromatography）、LC-ESI-MS（Liquid Chromotagraphy Electrospray Ionization Mass Spectrometry）分析表明，传统的NaNO2-AlCl3 法测定雪莲总黄酮的含量，结果偏高，不利于雪莲黄酮的实验室研究分析与今后工业化生产的质量监控。而AlCl3 法的显色反应较为特异，今后有望取代NaNO2-AlCl3 法，作为雪莲类药材品质评价的标准。而HPLC-DAD结合LC-ESI-MS可以对雪莲中的主要生物活性成份进行较为准确的定性分析，从而解决了由于缺乏相应的雪莲化合物标准品而难以对雪莲中的成份进行定性定量分析及比较的难题。最后综合利用上述分析方法，对雪莲细胞培养物中的花素类物质进行了分析。结果表明，雪莲细胞中至少含有7种花色素类物质，分别为矢车菊素-3-O-葡萄糖甙及其衍生物、天竺葵素糖甙衍生物和芍药色素糖甙衍生物。

外源草酸对采后果实的保鲜效应及其生理机理研究

本文以桃(Prunus persica L. cv. Bayuecui.)栽培种‘八月脆’和芒果（Mangifera indica L.）栽培种‘圣心’为材料，研究外源草酸对采后果实的生理生化效应及其作用机理，为果实贮藏保鲜提供新方法。采后桃果实用1、5 mM的草酸溶液浸果10 min，以浸水10 min为对照，然后在常温下贮藏，测定果实在贮藏期间对草酸处理的一些生理生化反应。芒果经采后杀菌剂（post- P）、采后草酸（post-OA）、采前＋采后草酸（pre-OA + post-OA）、采前Ca ＋ 采后草酸处理（pre-Ca + post-OA）处理，以采后浸水为对照，然后分别将果实在常温(25 C)、低温（14 C）和控制性气调（3% CO2 + 2% O2 ，14 ± 1 C）下贮藏，测定草酸处理对芒果的成熟进程、病情发展及其相关生理指标的影响。研究结果表明如下： 1．与对照相比，草酸处理的桃果实在贮藏期间果实的电解质渗漏量和呼吸速率降低、果实硬度高、果实的抗氧化酶（超氧化物岐化酶、SOD;过氧化物酶，POD;过氧化氢酶、CAT;抗坏血酸过氧化物酶、APX）和多酚氧化酶（PPO）活性提高、脂氧合酶（LOX）活性降低。同时，在贮藏后期，果实的活性氧自由基（ROS）产量（超氧阴离子、O2.;过氧化氢、H2O2)和丙二醛（MDA）含量降低。草酸的这些生理效应有利于保持膜的完整性和延缓桃果实的成熟;草酸诱导POD、SOD、PPO活性可能有助于提高采后果实的抗病性。 2．外源5、10 mM浓度的草酸（pH值中和或不中和）对芒果炭疽病原菌（Colletotrichum gloeosporioides）孢子萌发和菌丝生长均表现出显著的抑制作用。这种作用不仅与草酸降低培养基（PDA）的pH值相关，而且与草酸独特的化学特性相关。 3．在常温、低温和控制性气调贮藏下，采后草酸、采前 + 采后草酸、采前Ca + 采后草酸处理均能有效减缓芒果果实的软化速率，延缓芒果的成熟进程，降低芒果的病情指数，同时改善芒果成熟时的表皮着色，对果实完全后熟时的可溶性固形物（SSC）、可滴定酸（TA）含量、果肉口感均没有产生负面的影响。 4．草酸处理增强芒果细胞膜的稳定性，诱导提高芒果抗氧化酶活性，特别是提高果皮SOD、APX活性，降低LOX活性，以及降低果皮O2.、H2O2 和果肉H2O2含量，抑制采后果实的乙烯生物合成。这些生理生化效应与延缓芒果的成熟衰老和提高果实的抗病性相关。 5． 采后草酸、采前 + 采后草酸和采前Ca + 采后草酸处理表现出高效低廉、无毒无副作用、易操作等优点，是芒果采后贮藏保鲜的可供选、具有实际应用前景的新方法。

麻疯树种子油体以及种子萌发的蛋白质组学研究

麻疯树（Jatropha curcas L.）属大戟科麻疯树属多年生亚乔木，耐干旱、高温和贫瘠等，具很强的抗逆性，在干热河谷等边际土地上生长良好。其种子富含油脂，是制备生物柴油的理想材料，为重要的能源植物之一。油体（oil body）是种子细胞中重要的细胞器, 脂肪酸以三脂酰甘油（triacylglyeerols，TAG）的形式储存其内，是种子萌发和幼苗生长时所需碳骨架和能量的主要来源。种子萌发为生命萌动并构建成自养个体的过程，是高等植物生长发育中的重要事件。 本论文运用高通量的蛋白质组学研究手段，结合电镜技术和生理学分析，对麻疯树种子油体以及种子萌发过程中蛋白质表达、生理学响应和细胞结构变化进行了研究。 从麻疯树种子胚乳中分离油体，再从油体中提取蛋白，经双向凝胶电泳后，得到油体蛋白质组的二维表达谱，这些蛋白质主要分布在等电点5 ~ 10、分子量12 ~ 66 kDa的范围内;图像分析表明，油体蛋白质组至少有141个蛋白点，其中酸性蛋白74个，碱性蛋白67个，表达丰度较高的多为低分子量碱性蛋白。对其中36个重要蛋白点进行LC-MS/MS质谱分析，得到鉴定的蛋白分别为30个基因的表达产物，主要包括油体重要的结构蛋白油质蛋白（oleosin）和caleosin，麻疯树种子毒蛋白curcin，以及新鉴定得到的另一种可能的麻疯树种子毒蛋白，人体过敏反应蛋白橡胶延伸因子（REF）。还有四个与脂肪酸代谢相关的酶，其中3-羟酰-酰基载体蛋白（ACP）脱水/催化酶和醇酰基转移酶与脂肪酸合成有关，而脂氧合酶和磷脂酶D在脂肪酸降解中发挥作用，显示部分脂肪酸代谢相关的酶在油体储存状态就已附着在油体上，为种子萌发时动员油脂做好了准备。 麻疯树种子胚乳发达，在32℃湿润土壤中很快就会萌动，胚轴伸长露出胚根，长出新根，约4天后形成出土子叶幼苗。种子萌发过程中胚乳主要成分含量测定表明，含水量在前24小时迅速上升，至48小时增加缓慢，此后开始较快上升，可分为三个阶段，呈现“S”型的变化;粗脂肪和粗蛋白在前两个阶段变化不大，进入第三阶段后其含量迅速下降，前者先于后者，分别在萌发后72小时和96小时后开始明显减少，说明被大量降解、转化，供萌发生长利用，其中主要组分亚油酸最为明显。细胞超微结构观察发现，排列整齐充满整个胚乳细胞的油体和嵌合在油体中的蛋白储存泡在种子萌发过程中，随着线粒体、乙醛酸循环体和液泡的出现增多或增大而被逐渐解体、减少或消失;同时，发现脂肪酸主要在乙醛酸循环体、蛋白颗粒主要在液泡中被降解或转化。 蛋白质组学分析表明，麻疯树种子在萌发72小时过程中变化量在两倍以上的差异蛋白点共有141个，所有的差异蛋白均通过LC-MS/MS分析和NCBI蛋白数据库搜索得到鉴定。其中包括多个参与降解储藏油脂的酶，如乙醛酸循环途径中的顺乌头酸酶，异柠檬酸裂解酶和苹果酸脱氢酶等，均从种子萌发48小时开始表达量明显上升;葡糖异生途径中的酶在种子萌发中的积累略晚于乙醛酸循环途径，如烯醇酶，磷酸甘油酸变位酶，磷酸甘油酸激酶，磷酸丙糖异构酶和醛缩酶大多在萌发约60小时后表达量开始上调。分析结果表明，乙醛酸循环途径在种子萌发48小时后被激活，与电镜观察胚乳细胞发现油脂在萌发48小时时开始被动员相一致，因而大规模的油脂动员开始于种子萌发的第三阶段。 同时，蛋白质组学的分析结果也得到了种子胚乳组分变化分析及电镜观察结果的印证。超微细胞结构观察显示种子储藏蛋白降解在萌发第二阶段启动，主要在液泡中进行降解。粗脂肪的含量在72小时时显著降低，而电镜观察显示此时胚乳细胞中出现中央大液泡，出现大量的线粒体和乙醛酸循环体，细胞结构发生重大变化，萌发96小时后仅有少量油体残留于胚乳细胞中，这些都为储藏油脂在麻疯树种子萌发过程中的降解方式提供了重要证据。许多其他的功能蛋白在种子萌发过程中也发生了变化，表明种子萌发过程中不仅发生储藏物质的动员，也发生抗逆反应以及植物形态的构建等众多其他生理生化反应。 本研究首次对麻疯树种子油体进行了蛋白组成分析，并结合电镜技术及生理分析深入探讨了种子储藏物质在萌发中的降解方式，为更好的理解油体结构、木本油料种子的萌发机制和对麻疯树进行品种的改良提供了参考。

羊草cDNA文库的构建及果聚糖水解酶的分离与鉴定

羊草(Leymus chinensis(Trin.) Tzvel.)又称碱草，隶属禾本科赖草属，是欧亚大陆草原区东部草甸草原及干旱草原上的重要建群种之一。作为一种兼具重要经济价值和生态价值的优良牧草，羊草受到了广泛的关注。但长期以来，对羊草的研究主要集中在生态学、生殖生物学方面，在分子生物学方面知之甚少。为了保存羊草基因资源，并在基因水平上研究羊草生物代谢的调控机理，本研究采用羊草根、叶片混合后做为材料，构建cDNA文库，并对文库中部分基因序列进行了分析。同时从中克隆获得羊草果聚糖水解酶全长基因并对这些基因进行了深入的生物信息学分析、转化毕赤酵母研究初步确定其功能，为深入了解羊草代谢的分子机制提供理论依据。主要结果如下： 1. 成功地构建了羊草根、叶混合cDNA文库，原始文库滴度达到4×106 pfu/ml，扩增文库滴度接近1011 pfu/ml ，重组率达97% 。PCR检测插入片段，均在0.5 kb到3 kb之间，l kb以上占68%。从文库中检测到了TC、γ-TMT、FEH基因，文库覆盖度达到要求且为PCR筛选文库提供了可能。 2. 随机挑取经检测过的597个单克隆进行测序，去除插入片段小于和污染序列后，获得了584条高质量的序列。所有584条EST序列与NCBI的核酸数据库比对时，有30.99%的EST序列与己知序列有很大的同源性：而与蛋白质数据库进行比对时，有61.27%的EST序列与已知序列有很大的同源性。核酸比对中，有32.87%的序列为未知功能新基因，而蛋白质比对结果只有11.27%的序列为未知功能新基因。其中获得5条全长基因。 3. 文库中测序得到果聚糖水解酶（FEH）片段，依据其核酸、蛋白序列，以羊草根茎为材料，结合果聚糖水解酶基因的保守序列设计引物，通过 RACE 方法，获得羊草果聚糖水解酶基因 Lc 1-FEH 的全长序列（2040bp），包含一个 1803bp 的开放阅读框，采用生物信息学方法对该基因编码蛋白质进行功能分析，该基因编码的氨基酸序列具有明显的果聚糖水解酶类蛋白特征(NDPNG，FRDP 和[WEC (V/P)D] 结构域)，其分子量为 66.8kD，等电点 pI 为 5.49，是一种酸性蛋白质。同源性分析结果表明Lc1-FEH与单子叶植物小麦、大麦和黑麦草细胞壁类酵素酶同源性最高，分别为89％、87％ 和72％。运用实时定量方法对Lc 1-FEH表达量在羊草发育各时期及不同逆境处理下进行测定，结果发现，幼苗中以叶中表达量最低，根茎中表达较高，成苗中花梗中的表达量最高；Lc1-FEH在转录水平明显受碱、ABA、SA及低温胁迫诱导，随着胁迫时间延长，表达量迅速增加，到达到最大值，之后表达水平逐渐降低，在盐、干旱的诱导下的表达量迅速降低。 4. 羊草果聚糖水解酶Lc1-FEH基因在毕赤酵母中的高效表达 将pMD-Lc1-FEH 质粒经双酶切后构建果聚糖酵母表达载体 pPICZα- Lc1-FEH 。将重组表达载体线性化后电击转化毕赤酵母Pichia pastoris X33，经抗生素 Zeocin 和酵母 PCR 筛选获得高效表达酵母工程菌。毕赤酵母表达的果聚糖水解酶蛋白经SDS-PAGE 分析表明Lc1-FEH表观分子量为 67 kD 左右。其最适反应 pH 值为 5.5，在 pH 值为 4.5~6.5 的范围内能保持较高的酶活力；表达Lc1-FEH的最适反应温度为 30 ℃；在温度在 20～30℃度范围内有较高的酶活。 Lc 1-FEH能够水解含有β-2，1糖苷键类型果聚糖：蔗果四糖、菊粉、6-蔗果三糖；而对β-2，6糖苷键类型果聚糖：6-蔗果三糖、新蔗果三糖、细菌类果聚糖及蔗糖基本不具水解活性。

中国蕨类植物保护生物地理学研究

保护生物地理学（Conservation biogeography）就是运用生物地理学的原理、理论和分析方法，特别是那些有关物种分布格局的信息，去解决生物多样性保护的相关问题，是当前生物多样性及其保护生物学研究领域的热点。通过构建中国蕨类植物物种及分布数据库得知，中国现有蕨类植物63科，221属，2456种，其中有1218种属于中国特有（中国蕨类总数约50%），3种蕨类植物为外来种。科的统计表明：最大的科为鳞毛蕨科、蹄盖蕨科、金星蕨科和水龙骨科4个科所包含的种类占全国总种数的51.5%。鳞毛蕨科、蹄盖蕨科、金星蕨科、水龙骨科、铁角蕨科、凤尾蕨科、碗蕨科、中国蕨科、叉蕨科、观音座莲科等十个大科所含种数占了中国特有种总数的80%。云南、四川、贵州、广西、台湾、湖南、西藏等省区是中国蕨类植物种类数量及中国特有种数量较多的地区；全国有22个省区拥有地方特有种，地方特有蕨类植物数量由西向东、由南向北逐渐递减，云南、台湾、西藏、海南等四省区的地方特有蕨类植物种数占各省区蕨类植物总数10%以上，反映了青藏高原隆起及岛屿现象对中国特有蕨类植物分化的影响。 中国蕨类植物与各地理、环境及气候因子的相关性分析结果表明：（1）随着经度、纬度的增加， 蕨类植物物种总数及中国特有蕨类植物总数具有减少的趋势；（2）蕨类植物在海拔1000-1600米之间、特有蕨类植物在海拔700-2100米之间具有最大的多样性，此区间外随着海拔的降低及升高，物种丰富度依次降低；（3）气候因子特别是一月均温、年均温、相对湿度、年降雨量等因素对蕨类植物及中国特有蕨类植物均具有较大的影响，与最热月均温成低度线性相关或相关不显著；（4）地形因子是影响蕨类植物多样性的一个独立因素，地形条件越复杂，蕨类植物种类及中国特有蕨类植物种类越丰富。 运用SPSS统计分析软件分析了中国蕨类植物在各省之间种的相似性，以省区为单元对中国各省区蕨类植物物种组成进行了聚类分析，最后结果划分成：①南方蕨类植物区（包括横断山—青藏高原亚区、华中亚区、华东亚区、华南亚区）和北方蕨类植物区（包括东北—华北—西北亚区、秦岭亚区、江淮亚区）。 中国蕨类植物区系地理成分分析结果表明：（1）中国—喜马拉雅分布（40.86%）、热带亚洲分布（30.95%）、东亚分布（12.77%）和中国—日本分布（8.24%）构成中国蕨类植物区系成分的主体；在洲际关系方面，中国蕨类植物与大洋洲的蕨类植物关系最为紧密，共有种最多，达94种；与南美洲共有的蕨类植物种类最少，仅32种。（2）基于地理成分的聚类分析结果表明，可将我国蕨类植物区系地理区划为代表温带亚洲成分的（特别是中亚、西亚地中海分布成分）西北温带亚洲植物区、代表古热带成分的华南古热带植物区和代表广义东亚成分的东亚植物区，东亚植物区可继续下分为中国东北—俄罗斯远东亚区（该区分布有大量的东亚－北美间断分布类型）、中国—日本植物亚区、中国—喜马拉雅植物亚区。 运用IUCN濒危物种等级对中国蕨类植物及其国家重点保护蕨类植物进行了现状评估，结果表明：可能灭绝（EX）的2种，极危（CR）的蕨类植物有33种，属于濒危（EN）的蕨类植物51种，属于易危（VU）的蕨类植物有109种，接近受危（NT）的蕨类植物158种，需予关注（LC）的845种，数据不足（DD）的1255种。对国家重点保护蕨类植物的保护级别提出部分变更的建议，对部分没有列入保护名录珍稀蕨类提出保护的建议，并就建议保护级别变更和增加保护的种类进行了必要的说明。

Pharmacokinetics of sifuvirtide, a novel anti-HIV-1 peptide, in monkeys and its inhibitory concentration in vitro

Aim: To study the pharmacokinetics of sifuvirtide, a novel anti-human immunodeficiency virus (HIV) peptide, in monkeys and to compare the inhibitory concentrations of sifuvirtide and enfuvirtide on HIV-1-infected-cell fusion. Methods: Monkeys received 1.2 mg/kg iv or sc of sifuvirtide. An on-line solid-phase extraction procedure combined with liquid chromatography tandem mass spectrometry (SPELC/MS/MS) was established and applied to determine the concentration of sifuvirtide in monkey plasma. A four-I-127 iodinated peptide was used as an internal standard. Fifty percent inhibitory concentration (IC50) of sifuvirtide on cell fusion was determined by co-cultivation assay. Results: The assay was validated with good precision and accuracy. The calibration curve for sifuvirtide in plasma was linear over a range of 4.88-5000 mu g/L, with correlation coefficients above 0.9923. After iv or sc administration, the observed peak concentrations of sifuvirtide were 10626 +/- 2886 mu g/L and 528 +/- 191 mu g/L, and the terminal elimination half-lives (T,12) were 6.3 +/- 0.9 h and 5.5 +/- 1.0 h, respectively. After sc, T-max was 0.25-2 h, and the absolute bioavailability was 49% +/- 13%. Sifuvirtide inhibited the syncytium formation between HIV-1 chronically infected cells and uninfected cells with an IC50 of 0.33 mu g/L. Conclusion: An on-line SPE-LC/MS/MS approach was established for peptide pharmacokinetic studies. Sifuvirtide was rapidly absorbed subcutaneously into the blood circulation. The T-1/2 of sifuvirtide was remarkably longer than that of its analog, enfuvirtide, reported in healthy monkeys and it conferred a long-term plasma concentration level which was higher than its IC50 in vitro.

Synthesis and anti-HIV-1 activity of S-dihydro(alkyloxy)benzyloxypyrimidine derivatives

Several 2-heteroaryl-, 2-heteroarylcarbonylmethyl-, 2-arylcarbonylmethyl, and 2-arylethyl derivatives of S-dihydro(alkyloxy)benzyloxypyrimidines have been synthesized and the anti-HIV activities of these compounds were tested in C8166 cell and against RT

恒河猴黄体中tPA,uPA和PAI-1的鉴别与其功能的研究

在大鼠和恒河猴卵巢颗粒细胞(GC)存在组织型(tPA)和尿激酶型(uPA)纤溶酶原激活因子(PA)和一种PA的抑制因子(PAI-1).在排卵、排精和子宫内膜的周期性变化中tPA和PAI-1基因在这些组织的同类细胞或不同类型细胞间的协调表达起重要作用.因为恒河猴GC和膜-间质细胞(TC)在促性腺激素作用下都能产生tPA,uPA和PAI-1,而排卵后GC和TC转化为黄体细胞(LC),后者分泌孕酮,维持妊娠.本研究目的:(1)探讨LC是

Determinations of MC-LR and [Dha(7)] MC-LR Concentrations and Physicochemical Properties by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

A liquid chromatography electrospray mass spectrometry (LC/ESI/MS) method working in multiple reactions monitoring mode for the determination of trace amounts of microcystin variants (MC-LR and [Dha(7)] MC-LR) in waters was developed. The limit of quantification was 0.05 mu g/L and the limit of detection was 0.015 mu g/L for MC-LR and [Dha(7)] MC-LR, respectively. Recoveries for MCs were in the range of 68%-81%. MC-LR and [Dha(7)] MC-LR were chemically stable with similar physiochemical behavior.

Determination of microcystin-LR and its metabolites in snail (Bellamya aeruginosa), shrimp (Macrobrachium nipponensis) and silver carp (Hypophthalmichthys molitrix) from Lake Taihu, China

This paper describes seasonal changes of microcystin-LR (MC-LR) and its glutathione (MC-LR-GSH) and cysteine conjugates (MC-LR-Cys) in three aquatic animals - snail (Bellamya aeruginosa), shrimp (fMacrobrachium nipponensis) and silver carp (Hypophthalmichthys molitrix) collected from Lake Taihu, China. MC-LR, MC-LR-GSH, and MC-LR-Cys were determined by liquid chromatography electrospray ionization mass spectrum (LC-ESI-MS). The mean MC-LR concentrations in the hepatopancreas of snail and shrimp and liver of silver carp were 6.61, 0.24, and 0.027 mu g g(-1) dry weight (DW), respectively: while the average MC-LR-Cys concentrations were 0.50, 0.97, and 5.72 mu g g(-1) DW, respectively. MC-LR-GSH was usually not detectable in these samples. The above results suggest that: (1) in aquatic animals, especially fish, the main excretion form of MC-LR could be MC-LR-Cys, but not MC-LR-GSH, whereas MC-LR-Cys might play an important role in detoxication of MC-LR and (2) that efficiency of MC-LR-Cys formation differs among species. The main detoxication pathway of MC-LR in aquatic animals is suggested as follows: when MC-LR enters into liver/hepatopancreas, it firstly conjugates with polypeptide or protein (including GSH, PP-1 and 2A) containing Cys residues, perhaps also some free cysteine; subsequently, MC-LR-Cys is degraded from these polypeptide or protein; and finally is excreted from animals by the compound of MC-LR-Cys. (C) 2009 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Transfer, distribution and bioaccumulation of microcystins in the aquatic food web in Lake Taihu, China, with potential risks to human health

In this paper, accumulation and distribution of microcystins (MCs) was examined monthly in six species of fish with different trophic levels in Meiliang Bay, Lake Taihu, China, from June to November 2005, Microcystins were analyzed by liquid chromatography electrospray ionization mass spectrometry (LC-ESI-MS). Average recoveries of spiked fish samples were 67.7% for MC-RR, 85.3% for MC-YR, and 88.6% for MC-LR. The MCs (MC-RR+MC-YR+MC-LR) concentration in liver and gut content was highest in phytoplanktivorous fish, followed by omnivorous fish, and was lowest in carnivorous fish; while MCs concentration in muscle was highest in omnivorous fish, followed by phytoplanktivorous fish, and was lowest in carnivorous fish. This is the first study reporting MCs accumulation in the gonad of fish in field. The main uptake of MC-YR in fish seems to be through the gills from the dissolved MCs. The WHO limit for tolerable daily intake was exceeded only in common carp muscle. (C) 2008 Elsevier B.V. All rights reserved.