扇贝大防御素和G型溶菌酶的基因克隆与重组表达

扇贝养殖是我国传统的海水养殖产业，但自1997 年以来，养殖扇贝陆续爆发的大规模死亡，不但造成了巨大的经济损失，而且严重影响了该产业的健康发展。扇贝病害的不断爆发以及病因的多样性迫切要求制定新的疾病防治措施和开发新型的抗菌物质。 从扇贝自身的免疫防御因子入手，筛选和克隆参与免疫防御的功能基因，一方面可以研究抗病功能基因在病原感染或环境胁迫条件下的表达规律，深入探讨扇贝的免疫防御机制，并可作为抗病良种选育的分子标记，指导扇贝的遗传改良和抗病品系的培育；另一方面，可对抗菌效应物实现重组表达，开发新型的病害预防治疗制剂，取代目前普遍使用的抗生素和化学药物。抗菌效应物是机体在免疫应答过程中产生的多肽类物质，对侵入生物体内的细菌、病毒具有很强的免疫杀灭作用，对抗菌效应物的研究有助于深入了解机体先天性免疫防御的机制。 本研究采用大规模EST测序方法，结合cDNA末端快速扩增（RACE）技术，从海湾扇贝血淋巴中克隆到了大防御素基因（big defensin, AiBD）的全长cDNA序列，该cDNA全长为531 bp，其中5' 非编码区（UTR）为24 bp，开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）含有369 bp，编码122 个氨基酸残基；随后为138-bp 的3' UTR，包括一个多聚腺苷酸信号序列（AATAAA）和ploy A尾巴。分析表明，海湾扇贝大防御素是以前体的形式合成，前体分子包括信号肽、前域和成熟肽三部分。采用Northern blot方法，以DIG标记的DNA探针检测了 AiBD mRNA在不同组织中的表达。结果发现，AiBD 基因的转录本主要在血淋巴中表达，在鳃中也有微量的表达，而在外套膜、闭壳肌、性腺及肝胰腺中检测不到杂交信号。采用QRT-PCR（quantitative real time PCR）对鳗弧菌感染后海湾扇贝血淋巴中AiBD mRNA 的表达量进行了检测，结果发现在感染后8 h 内， AiBD mRNA 的相对表达量平缓升高；随着刺激时间的增长，AiBD基因的mRNA表达量急剧增加，在刺激后16 h 和32 h 分别达到了空白组的72.3 倍和131.1 倍。为了研究海湾扇贝大防御素的抗菌活性，将其成熟肽编码区克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K并实现了重组表达。抑菌实验表明，重组AiBD具有广谱的抗菌活性，其对供试的三株革兰氏阳性菌（藤黄微球菌、溶壁微球菌、金黄色葡萄球菌）都表现出显著的抗菌活性，而对革兰氏阴性菌（鳗弧菌、亮弧菌）的抑菌活性则相对较弱；此外，重组AiBD对表达宿主也表现出杀菌活性，证明其具有抗真菌活性。 根据栉孔扇贝G 型溶菌酶基因的cDNA序列，利用构建的Genome Walking 文库获得了栉孔扇贝G 型溶菌酶基因的全长序列，该基因序列全长为8131 bp，由六个外显子和五个内含子组成。六个外显子长度分别为55 bp，60 bp，90 bp，113 bp，145 bp 和140 bp；五个内含子的长度分别为1126 bp，2161 bp，2744 bp，750 bp和592 bp；内含子的两侧都具有RNA正确剪接所必需的识别位点（GT/AG）。利用TRANSFAC 软件对栉孔扇贝G 型溶菌酶基因的5' 侧翼序列分析发现，该基因的5' 侧翼具有 TATA box 和 CAAT box 的共有序列；此外，在该基因的5' 侧翼发现了C/EBP、NF-κB、OCT-1 和 NF-IL6 等参与免疫基因激活的转录因子潜在结合位点。采用Northern blot方法，以生物素标记的RNA 探针检测了栉孔扇贝G 型溶菌酶基因在不同组织中的表达。结果发现，该基因的转录本主要在鳃、性腺及肝胰腺中表达，在血细胞和外套膜中也有微量的的表达，而在闭壳肌中检测不到杂交信号，这表明栉孔扇贝G 型溶菌酶可能兼备参与机体免疫防御和消化的功能。为了研究栉孔扇贝G 型溶菌酶的抗菌活性，将其成熟肽编码区克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K并实现了重组表达。抑菌实验表明，重组产物具有显著的抗阳性菌活性，其对供试的藤黄微球菌、溶壁微球菌表现出明显的抑制作用，对金黄色葡萄球菌未检测到抑制活性；而对革兰氏阴性菌仅表现出微弱的抑菌活性（亮弧菌和鳗弧菌），对大肠杆菌则基本无抑制活性。

光对裙带菜排卵的干扰及单克隆扩增、育苗条件优化

为了进一步完善裙带菜单倍体克隆（简称单克隆，以下同）育苗技术，实现该技术的产业化，本文对单克隆的快速扩增以及育苗条件进行了优化研究。获得如下结果：一、光对裙带菜排卵的干扰现象：一般附苗后4-5天雌雄配子即已形成。接近成熟的卵囊细胞翘起，长度达到50-55μm，直径为19-20μm，一到两天后即可排卵。精子囊略透明，颜色微绿。在11：13（L：D）的光周期下，排卵一般在黑暗开始后5分钟即已开始，5-15分钟后达到高峰。排卵的过程只有几秒钟。卵排出后停留在卵囊开口处，仍与卵囊牢固相连。虽然排卵过程只有几秒钟，一旦这个过程受到光的干扰，就会诱导卵脱离卵囊。实验证实，5-6μmol m~(-2)s~(-1)的微弱光强（显微镜下镜检的光强）即能引起95%的卵从卵囊脱落。根据我们的观察，一旦卵已排出并与卵囊相连，将不再受光的干扰而脱落。脱落的卵很快死亡分解。将配子已经形成但尚未释放的培养转移至连续光下以后，卵仍能排放，但排出的卵大部分脱落（75%），进一步说明了光对排卵的干扰作用。在育苗实践中，为了方便工作，育苗车间内在天黑后的2-3小时内仍有照明，而在第二天早晨取样观察，就会发现许多空的卵囊。我们的实验证实了这是由于排卵过程受到光的干扰引起的。因此，在育苗实践中，为了提高出苗率，在出苗期间，天黑后2-3小时内育苗车间内应避免照明，以降低光导卵的脱落。二、单克隆快速扩增以及育苗条件的优化：（一）、单克隆快速扩增的优化。实验结果表明：1、单克隆快速生长的适宜光照强度为80-120μmol m~(-2)s~(-1)。单克隆的培养密度宜控制在1-10g/L。接种密度以1g/L为宜。2、单克隆藻体内能贮藏氮，因此在单克隆快速扩增过程中，可采用间歇施肥法补充氮源。实验证明，培养液中氨态氮的适宜浓度为20μmol/L，可维持单克隆6天的生长之用（单克隆培养密度1-10g/L）。3、实验证明，在65天内，“老水”对单克隆的生长没有明显的抑制作用。而且，PES培养基除氮的其它成分也可满足单克隆65天的生长需求。4、单克隆快速生长的适宜温度为22 ℃。另外，单克隆密度与消光值之间存在着线形关系，可以通过测量消光值来计算单克隆的培养密度和鲜重，以代替称量法测鲜重。综上，可提出如下单克隆快速扩增的模式：温度为22 ℃；初始光强控制在80-120 μmol m~(-2)s~(-1)；单克隆的接种密度为1g/L；PES培养基（除去氮的成分）可供单克隆65天的培养之用，在这65天内，每隔六天左右将初始氨态氮补充至20 μmol/L；单克隆的培养密度控制在1-10g/L；单克隆培养密度和鲜重可通过测量消光值计算得到。依以上模式，并及时进行扩养，单克隆的鲜重平均日增长率可达25%，以此增长率计算，10g单克隆经一个月培养后鲜重可达8070克，可培育苗帘2000多个，实现海面养殖1000多亩，达到了生产性育苗的要求。（二）、单克隆育苗条件的优化 根据实验结果，可采取如下的育苗优化措施：1、光对排卵有干扰作用。因此，在出苗期间，在天黑后2-3小时内，育苗车间内应避免照明，以降低光导的卵子脱落。2、1μmol/L磷（PO_4~(3-) -P）和70 μmolm/L氮（NH_4~+-N）有利于加速出苗。3、铁对配子体的发育有明显的促进作用。2.5μmolm/L的Fe（III）能使出苗时间提前1-2天，出苗率增加15%左右。4、单克隆育苗较适宜的温度为17 ℃。依以上条件，4-5天左右即可出苗，比一般出苗时间提前1-2天。出苗率也有所增加，例如在实验室条件下，出苗率由原来的50-60%增至80-90%，增加了30%左右。本项研究进一步完善了裙带菜单克隆育苗技术，将大大有利于该技术的进一步推广。

雨生红球藻诱变育种及突变株的筛选

虾青素是良好的着色剂，具有超强的抗氧化、捕获自由基、抗癌变，抗紫外线辐射、增强免疫等功能，在医疗、水产、食品和化妆品等生产领域有着广泛的市场。雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）是一种单细胞的绿藻，在逆境条件下可积累高达4%干重的虾青素，是目前已知的天然虾青素含量最高的生物资源，规模化培养雨生红球藻是获取天然虾青素的最佳途径。 目前实验室研究和规模化培养使用的藻株多为出发株，存在一些缺陷：养殖过程中易被其它微藻、变形虫、原生动物、细菌等污染；只适合低温培养，28℃以上生长受抑制；生长相对较慢，培养周期长；尽管雨生红球藻是已知的天然虾青素含量最高的生物资源，但其含量仍然需要提高以适合规模化生产。因此筛选出温度适应范围广、生长速率快、虾青素含量高的雨生红球藻株一直是努力的方向。 本研究选用化学诱变剂甲基磺酸乙酯（EMS）和叠氮钠(NaN3)以及物理诱变剂紫外线（UV)分别处理雨生红球藻，测定各种诱变剂的致死率，及对红球藻生长和虾青素积累的影响，根据实验结果确定合适的诱变剂量和诱变时间，通过初筛、复筛、再次诱变等分离、筛选出生长速度快、虾青素含量高的单一藻株并进一步利用高压液相色谱等方法进行鉴定。 实验结果表明：浓度为0.2％-1.0％EMS处理4h，雨生红球藻H2的死亡率7%-35%；紫外线照射2min-10min，雨生红球藻H0的死亡率10%-98％；叠氮钠30mg/L－270 mg/L处理24h，雨生红球藻H0的死亡率为20％-100％。各种诱变剂诱变结束后立即观察发现死亡细胞的形态相似但存活细胞相态有所不同，死亡细胞呈浅绿色，轮廓模糊，形状不规则，质壁间隙消失，胞内有白色空泡；EMS处理后存活细胞，呈圆球状，部分失去鞭毛和前端突起，游动缓慢，处理后第二天，细胞即恢复游动和分裂，分裂方式与正常细胞相似。紫外线和叠氮钠处理后存活细胞壁加厚，呈深绿色，圆球状，部分失去鞭毛和突起，严重抑制细胞的游动和分裂，出现不动细胞，培养一段时间后才出现分裂细胞，游动的和不动的存活细胞主要是采用不对称无性繁殖，这与正常细胞的不对称无性繁殖有所不同，正常细胞中不对称无性繁殖的母细胞多为不动细胞。紫外线和叠氮钠处理后部分细胞还产生大量的小孢子（配子？），直径较小1-4m，在母细胞内不停摆动，四、五天后逐渐脱离母细胞。这和以前描述的有性繁殖很相似，但由于没观察到后期孢子配对过程和缺乏小孢子的DNA含量和倍性的有关数据，不能确定观察到的小孢子现象为雨生红球藻的有性繁殖。 各种诱变剂处理后，各组存活藻株的生长和虾青素积累情况同对照组相比发生了变化：EMS实验中0.4％EMS组生长速率提高24％，其它组的细胞生长速率有所降低。各组单细胞虾青素含量和积累速率均高于对照组，其中0.4％和0.8％处理组单细胞内虾青素含量分别提高了76％和90％，积累速率分别提高了69％和115％；紫外线实验中4min、6min和10min组生长速率分别提高20％、17％和35%，各组藻细胞虾青素积累速率有不同程度的提高，其中2min组和10min组虾青素积累速率提高幅度最大分别为32%和31%，单细胞内虾青素含量除10min处理组提高48%，其它各组均有不同幅度的降低；叠氮钠实验中60mg/L、120mg/L和180mg/L组细胞生长速率分别提高了13％、20％和9％，各组藻细胞内虾青素含量和虾青素积累速率得到明显的提高。其中60 mg/L和180 mg/L组单细胞内虾青素含量提高幅度最大，分别提高75%和140%。180mg/L和240mg/L组虾青素积累速率提高幅度最大，分别为280％和250％。 诱变后通过固体平板分离，得到一系列单一藻株，其中0.4%浓度EMS处理雨生红球藻H2 4h后分离到H2-419在生物量上比H2高出20％,但虾青素含量提高幅度不大。用UV对突变株H2-419再次诱变得到较稳定的藻株H2-419-4，培养五个月后与H2相比生物总量提高68%，单细胞内虾青素含量提高28％，经高压液相色谱分析证明H2-419-4类胡萝卜素提取物中主要成分仍然为虾青素，和出发株H2相比色素成分没有发生变化，只是各成分比例有所不同。 还分析研究了其它单一藻株，但或是稳定性较差，或虾青素含量高而生长慢。如雨生红球藻H2经0.02％EMS诱变十天，分离得到的E-L-22和出发株相比虾青素产量提高40％，但生物总量上降低了27％；5min紫外线照射雨生红球藻H0后，分离得到的UV-5-16和UV-5-14在生物总量分别提高7％和36％。叠氮钠200mg/L处理24h分离得到的藻株N-2-42生物总量提高43％，但藻株N-2-43生物总量比出发株降低8％。

南海上层海洋变异分析及海表温度统计学可预报性试验

气候变化和异常是当今地球科学研究的重大课题之一，与人类的生存、发展密切相关。南海作为我国最大的边缘海, 位于夏季风气流上游, 同时，作为热带太平洋的边缘海，具有显著的年际变异特征。近年来，随着卫星资料的积累和产品化使得我们有机会对南海的上层海洋要素进行全面的直接的观察，并进行南海气候异常变异及其可预报性的研究。 本文的研究内容就是利用近年来卫星资料产品，对南海主要海面要素，包括海面风场（SW）、表层温度场（SST）、海面高度场（SSH）的气候变化趋势以及南海表层温度变异的可预测性进行细致的探讨，并且利用较新的分析方法对南海上层海洋要素在近年来的非线性变异特点进行了分析。主要工作包括： 1. 采用南海卫星高度计及具有高精度模式输出结果通过联合经验正交函数分解（EOF）得到空间分辨率为1/3°×1/3°的南海绝对动力地形及地转流的季节变化（1－12个月）。从地转流场可以看到南海内部的表层流场主要有3种流系：西边界流、离岸流及南海多涡涡旋结构。 2. 通过南海海表大气和海洋要素（SW、风应力、SST、SSH）的气候变化趋势分析计算得到南海SST平均增暖0.5K/decade，海面高度升高6.7cm/decade，表层风场东分量和北分量的变化趋势分别为0.5m/s/decade、-0.04m/s/decade。其中南海SST增暖趋势和海面抬升速率远大于全球增暖和海面抬升速率。 3. 对南海SW、SSH和SST的异常场的EOF分析揭示南海SW、SSH及SST的年际尺度变化均表现出与ENSO变异现象一定的相关性：其中南海SW的第一模态特征表现为海盆尺度的反气旋，是西太平洋反气旋的最西南的一部分。对应的时间系数函数（TCF）滞后Nino3.4指数3个月，相关系数较高为0.90。南海SW的第二模态特征表现为均一化的西南风，TCF与印度洋偶极子（IOD）指数有一定相关性：TCF超前IOD指数4个月，相关系数达到0.58,表明南海SW第二模态似乎可以用来作印度洋偶极子现象的一个前兆。南海SSH的EOF第一模态特征为沿着南海东边界低水位，对应的TCF滞后Nino3.4指数2个月时间，二者相关系数为0.94；南海SST的EOF第一模态特征表现为整个海盆的增暖，对应的TCF与滞后Nino3.4指数8个月，相关系数等于0.62。 4. 基于典型相关分析（CCA），利用南海SSTA滞后热带太平洋Nino指数及印度洋IOD指数的关系建立南海SSTA的统计预报模式。通过对南海SSTA后报试验（1993/1994-2004年10月）与持续性预报值的预报效果进行比较分析，表明基于CCA统计方法对南海SSTA后期预报在预报时效超过3个月以上时具有更好的稳定性，提前1～12个月的后期预报水平平均值为0.60左右，误差均方根大约0.2个标准差。综合热带太平洋Nino指数为预报因子作南海SSTA统计预报的平均水平为0.55左右，亦具有较好的稳定性。 5. 基于前馈型神经网络，对南海近年的表层要素场（SW、SSH、SST）作非线性EOF分析。其中非线性EOF第一模态方差贡献与线性EOF相比均相应提高：海面风场、海面高度场的非线性作用较强，非线性EOF第一模态对变量场的方差贡献与线性EOF方法相比分别从54.75%提高到67.26%和50.43%提高至60.24%，非线性曲率强的空间范围占据绝大部分南海海域；相比较而言，南海SSTA场的非线性EOF第一模态的方差贡献提高不明显,非线性特征明显的区域仅在南海北部和南部靠近大陆的海区。对南海SSTA场1982-2003年时间长度的数据进行非线性与线性EOF分析比较，发现南海SSTA在近20年的非线性EOF分析中得到的非线性特征更不明显，表明与前10年相比，南海近10年的南海SSTA场的非线性成分有所增强。

双刺纺锤水蚤（Acartia bifilosa）基础生物学与生态学研究

20世纪90年代以来，为了确保日益增长的人口对蛋白质的需求，海洋鱼类养殖在全球范围内日趋发展。然而，许多养殖鱼类的品质如抗病力、口味等与野生种类相比大为降低。饵料对于鱼类品质的好坏起着至关重要的作用。在海洋的自然环境中，浮游动物，特别是数量庞大、种类繁多的桡足类是野生鱼类的天然活饵料。哪些桡足类适于作养殖饵料，如何获得、从何处获得桡足类，人工培养是否可行，能否通过加入桡足类来改善养殖鱼类的品质是长期以来业内人士一直关注的问题，需要大量的基础性探索研究工作。 开展有潜在开发价值种的生物学特性及室内培养的基础研究，进而开展大量生产技术的研究与应用，不仅是开发利用桡足类的一个重要途径，而且可以获得一些重要的生态学参数。 本论文自2003年10月－2004年9月之间，在胶州湾采集不同的桡足类种类，通过室内比较培养实验，选定双刺纺锤水蚤作为具有开发潜力的研究培养对象，对其展开一系列培养条件及生物学特性研究，在此基础上进行了小水体增殖培养，结合现场调查资料对与其生活策略相关的生态学问题进行了初步研究探索。结果如下： 筛选：2003年10月－2004年9月全年不同季节共采集11 种桡足类，在室内自然温度、自然海水（盐度30－32）下长时间培养，粗略筛选出能够经受实验室人工养殖水体生活的种类有：强额拟哲水蚤（Paracalanus. crassirostris）、汤氏长足水蚤（Calanopia thompson）、太平洋真宽水蚤（Eurytemora pacifica）、双刺纺锤水蚤（Acartia bifilosa）。对上述种类的成体和子代幼体分别测定其对不同盐度、温度的耐受能力。培养结果表明：18℃室温下，强额拟哲水蚤幼体在盐度20以上的环境中，存活时间不超过11天；汤氏长足水蚤雌体在培养温度低于20℃时，只能存活10天；25℃室温下，当盐度低于20时，汤氏长足水蚤雌体存活时间不超过9天，子代的存活时间不超过7天；太平洋真宽水蚤不适宜在温度较高的夏秋季培养，幼体在不同盐度的实验条件下存活时间不超过5天，不适宜长期培养；双刺纺锤水蚤在全年8－24℃的室内培养温度范围内保持了24－85％的存活率，雌体和子代在盐度10－35的范围内都能存活，最终结果表明双刺纺锤水蚤是其中最适宜进行人工培养的种类。 繁殖：对双刺纺锤水蚤雌体的培养条件和繁殖生物学的研究结果表明：在本实验所使用的6种微藻饵料：微绿球藻（Nannochloropsis oculata）、小球藻（Chlorella.sp）、等鞭金藻（Isochrysis galbana）、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、亚心型扁藻(Platymonas subordiformis)、中肋骨条藻(Skeletonema costatum)中，亚心型扁藻和中肋骨条藻适宜成体培养，亚心型扁藻对雌体存活有利，排粪率也要比中肋骨条藻低得多，亚心型扁藻在高温条件下的饵料利用效率要高于中肋骨条藻，中肋骨条藻对产卵有利，二者混合优势互补；预饥饿处理的双刺纺锤水蚤恢复到最高产卵率需要较长的时间，并且一直保持较低的产卵率；该种繁殖的最适温度范围15－20℃；在10－25℃温度范围内的平均产卵率差异并不显著。 生长及发育：对双刺纺锤水蚤幼体培养条件及发育生物学研究结果表明：在本实验所使用的6种微藻饵料中，微绿球藻是比较理想的开口饵料；粒径小（ 4 m）的微藻——微绿球藻和小球藻不能保证双刺纺锤水蚤后期无节幼体发育至桡足阶段，22℃以下采用微绿球藻 + 亚心型扁藻 + 中肋骨条藻的食物搭配，22℃以上需加入粒径在4m左右的等鞭金藻。 世代时间：通过一系列的温度梯度实验，证明在相同饵料的情况下，温度对双刺纺锤水蚤的发育具有显著的影响，在15－25℃的范围内，随着温度的升高，生长速度加快、世代周期缩短；在温度条件为15、18、20、22、25℃下的世代时间分别为25.5, 18.5, 13, 11.5, 9.5天。 群体培养：研究了适宜的微藻饵料种类搭配比例以及总饵料浓度对种群日均增值率的影响。结果表明：20℃下培养宜采用亚心型扁藻：中肋骨条藻：微绿球藻按含碳量2:1:1的比例组成混合饵料，达到最高增殖率的混合饵料浓度范围在1.0－4.0 μg C ml-1之间；25℃下培养宜采用亚心型扁藻：中肋骨条藻：微绿球藻：等鞭金藻按含碳量2:1:1:2的比例组成混合饵料，日均增殖率在混合饵料总浓度为1.0 μg C ml-1 时最高，低于和高于此浓度都会降低日增值率。 度夏机制：针对野外大面调查发现双刺纺锤水蚤在高温季节的胶州湾内仍然存在的事实（传统观点认为该种在夏季从水体中消失，通过休眠卵度夏），本论文从基础生态学研究出发，根据胶州湾夏季的温度和叶绿素浓度资料，设计实验研究了高温和饵料浓度对成体繁殖和幼体生长发育的影响。实验发现，饵料浓度对高温下雌体的繁殖有着明显的影响，15g Chla l-1浓度下的雌体在28℃都可以保持产卵状态，而且卵的孵化率也在50％以上；各处理中的卵都很快孵化，并保持了60％以上的孵化率；高浓度组15 g Chla l-1和10 g Chla l-1，无节幼体都能发育至成体，低浓度5 g Chla l-1处理组中，28℃下，不能发育至桡足阶段，而25℃下也只能发育至C4期。在本实验中没有发现双刺纺锤水蚤产生休眠卵。在胶州湾自然环境中发现该种全年存在。胶州湾中的双刺纺锤水蚤在夏季能够在不产生休眠卵的情况下安全度夏。

牙鲆性腺分化发育及类固醇激素T和E2对性腺分化的影响

本文采用组织学手段研究了牙鲆性腺在分化、发育和成熟过程中的变化。然后，通过放射性免疫方法（RIA）测定了牙鲆仔稚幼鱼全组织匀浆液中的性类固醇激素—睾酮（T）和雌二醇（E2）的含量，并结合牙鲆血清中T和E2含量的年周期测定，从内分泌学水平探讨了T和E2在其性腺分化、发育和成熟过程中水平的变化规律。同时，采用高温和雌性激素对性腺未分化的普通和雌核发育牙鲆仔稚鱼进行诱导处理，获得了较高比例的雄性鱼/假雄鱼或100%雌性鱼；并研究了这些外界环境因子对牙鲆性腺分化、性别比率及体内T和E2水平的影响，藉此探讨了牙鲆性别决定与性腺分化的细胞学和内分泌学机制。 对牙鲆仔稚幼鱼性腺的组织切片观察发现，培育水温18~20℃下，孵化后第45天、平均全长<22.0±2.8 mm的牙鲆，其性腺分化尚未开始，属于原始性腺；在孵化后70日龄、平均全长为38.0±1.7 mm左右，部分个体中观察到卵巢的雏形，其余个体的性腺在此阶段以及之后的一段时间内变化并不明显；到了第110天、平均全长达到86.5±5.9 mm时，雌性个体卵巢出现了卵原细胞向卵母细胞的转变，标志着卵巢分化的结束。在90日龄、平均全长为63.5±3.4 mm的雄性牙鲆中，精原细胞快速增殖，并观察到了输精管结构；进一步的细胞学分化则出现在100日龄、平均全长为76.0±8.6 mm的个体中，此时可以看到精小叶的形成；在平均全长为140.0±15.2 mm时，精巢中出现初级精母细胞，标志着性腺分化的基本完成。 对牙鲆仔稚幼鱼全组织匀浆和成鱼血清中的T和E2水平的比较发现，在全长为6 mm左右的仔鱼中T和E2含量均较高。随后，在性腺分化过程中T含量大大降低，E2的含量急剧增高，而性腺分化后期E2含量又降到较低的水平。在雄性牙鲆成鱼中， 从精巢第Ⅲ期开始，T含量随着精巢的发育而增加，到了精巢第Ⅴ期性腺发育成熟并排精后，又降低到较低的水平；E2含量在从精巢第Ⅲ期发育至精巢第Ⅴ期过程中略呈降低的趋势，但是总体上来说没有明显的差异。在雌性牙鲆成鱼中，卵巢从第Ⅱ期到第Ⅳ期的过程中，T水平逐渐升高，在第Ⅴ期时则明显降低；而E2含量在卵巢第Ⅱ期时保持较低的水平，随着卵巢的发育，E2含量逐渐增高，在卵巢第Ⅳ期时达到最高水平，在第Ⅴ期产卵后又有所降低。在雌雄个体中T和E2均呈现周期性的变化。5月份随着水温的升高，雄性个体T和E2含量显著上升；到了9月份又逐渐下降至最低值。雌性个体E2含量自3月份开始增高，在5月份急剧升高，并在6月份达到最高值；在7月份的时候，E2突然降低，而到了8月份又有所回升；9月份之后E2逐渐降低并在1月份左右降到最低；而T的含量分别在2月份和6月份出现两次高峰。 温度诱导牙鲆幼鱼性腺分化的结果表明，牙鲆中存在明显的TSD机制，即其性腺分化因饲育水温的不同而变化：在一定温度范围内，随着饲育温度的增加，牙鲆的雄性比例逐渐增高，常温对照组和21℃组中的雄性比例分别为51.62%、60.00%，而在24℃和28℃高温组中，雄性比例显著高于对照组，分别达到73.33%和87.27%。T和E2含量测定显示，在性腺分化时期，高温和对照组中T含量没有明显的变化，而温度处理组中的E2水平则低于对照组，特别是在28℃高温组，其E2水平显著低于对照组（P<0.05）。外源E2处理性腺未分化的牙鲆幼鱼的结果也表明，牙鲆的死亡率与雌性化比率均为雌性激素剂量依赖型的。随着外源E2剂量的增加，雌性比率增加，但同时死亡率也增高。此期间T和E2水平比较发现，在性腺分化时期，对照组中的T含量稍高于雌激素处理组；而对照组中的E2含量高于0.2 ppm和2 ppm两个低剂量组，却低于20 ppm和100 ppm两个高剂量组。 同时，还对人工诱导培育的雌核发育牙鲆和性反转牙鲆进行了性腺发育观察，在所观察的雌核发育牙鲆个体中，其雌性比例为83.33%，而高温28℃饲育群体中的雄性比例（即假雄鱼比例）为91.67%；在雌性个体中，也有一定比例的个体性腺发育不正常，有的性腺发育较小，有的则缺少部分性腺。进一步对雌核发育成体的血清中T和E2含量进行测量，发现在普通牙鲆个体中T含量显著低于雌核发育个体，而E2含量则高于雌核发育牙鲆；在雌核发育牙鲆中，性腺发育不正常的个体比性腺发育正常的个体中的T含量稍高，而E2含量则显著低于正常雌核发育牙鲆个体和普通牙鲆个体（P< 0.05）。

利用两种大型海藻制备生物能源的探索研究

生物质燃料乙醇和沼气都属于发展潜力巨大的生物质能源，大力发展生物质燃料乙醇和沼气对解决当今能源危机、环境污染问题和促进我国经济发展具有重要意义。 本文就海带化工废弃物——海带渣糖化技术、浒苔糖化技术及初步酒精发酵技术、海带沼气发酵技术、浒苔沼气发酵技术进行了可行性研究。 1、海带渣总糖含量为52.6%，海带渣总糖中葡萄糖含量占90.9%，另外还有少量的半乳糖、甘露糖和木糖，这说明海带渣是非常优良的能源生物质。 2、海带渣糖化工艺采取稀硫酸预处理后纤维素酶酶解产糖工艺。海带渣最佳稀硫酸预处理条件为预处理温度121℃、硫酸浓度0.6%、预处理时间60 min，此时海带渣纤维素酶解产糖可达187.8 mg/g干藻。 3、优化了预处理海带渣纤维素酶酶解产糖工艺。各因素对海带渣酶解产糖的影响依次为：pH>温度>时间>酶用量，海带渣纤维素酶解产糖的最佳条件为温度45℃、pH5.2、时间48小时、酶用量16 mg/g干藻，此时糖产量为238.9 mg/g干藻。 4、浒苔总糖含量为67.2%，浒苔总糖主要有葡萄糖、木糖、葡萄糖醛酸和鼠李糖组成，其中葡萄糖和木糖可以做为酒精发酵的原料，这两种糖占总糖含量的51%。 5、以鲜浒苔为原料研究了浒苔稀硫酸水解工艺和纤维素酶酶解工艺。发现浒苔酸水解产糖效果明显优于纤维素酶酶解。 6、以干浒苔为原料研究了浒苔酸解工艺。硫酸水解干浒苔产糖能力优于盐酸、磷酸和马来酸，水解时间为60 min、硫酸浓度为1.8%的时候可用于酒精发酵的糖（葡萄糖和木糖）总产量达到最大值为230.5 mg/g干浒苔，占此条件下总还原糖产量的48.6%。同时发现干浒苔比鲜浒苔更易被硫酸水解产糖。 7、初步研究了浒苔酒精发酵工艺。初步工艺中酒精产量较低、测得酒精在发酵液中浓度为0.23%（v/v），后续工作中需要对酒精发酵工艺进行优化。 8、海带与牛粪比例为4:1（w/w）是海带与牛粪联合厌氧消化的最佳比例，此时产气时间最长，达到37天，总产气量最高，达到13600 mL。 9、在海带与牛粪联合厌氧消化中，增加接种量到15 g（干重）时发酵周期为39天，总产气量为14630 mL，TS产气量为152.4 mL/gTS，接种量为21 g（干重）时发酵周期为36天，总产气量为14090 mL，TS产气量为138.1 mL/gTS，可见适当增加接种量可促进产气量的增加。 10、浒苔与牛粪比例为4:2（w/w）是浒苔与牛粪联合厌氧消化的最佳比例，此时产气时间为33天，总产气量最高达到6785 mL。 11、在浒苔与牛粪联合厌氧消化中，增加接种量到7.5 g（干重）时发酵周期为38天，总产气量为7470 mL，TS产气量为155.6 mL/gTS，接种量为10.5 g（干重）时发酵周期也为38天，总产气量为7020 mL，TS产气量为137.6 mL/gTS，可见增加接种量可促进产气量的增加。

胶州湾生态系统主要生态因子的长期变化

该文首先针对胶州湾生态系统观测站(JERS)积累的大量历史资料中存在的问题,根据生态学规律,对这些数据文件和其中的生态项目予以编码编排,对不同时间、航次调查的站位进行逻辑处理,根据胶州湾生态数据所具有的空间属性,运用MapBasic语言对地理信息系统软件Mapinfo进行二次开发,研制出了"胶州湾生态系统数据库".运用统计学方法对胶州湾生态系统主要生态因子进行时间序列分析和系统研究,发现胶州湾海域海水化学耗氧量自20世纪90年代以来呈现持续上升状态,尤其进入98年以后迅速上升,表层化学耗氧量1998年比1991年增加44.7%.研究还发现胶州湾海域亚硝酸氮、硝酸氮和氨氮自20世纪60年代以来都有了大幅度的上升,磷的含量则在80年代达到最高,90年代以来略有下降;而胶州湾海域硅酸盐的含量自80年代以来呈现持续下降状态,90年代比80年代降低了63.6%.胶州湾的浮游植物多样性指数虽然自90年代以来处于上升趋势,但作为食物链中重要环节的浮游动物的多样性指数却处于持续下降状态.

海洋经济动物精子超低温保存的研究

从1949年以来经过近五十年的发展，超低温保存种质细胞技术已经趋于成熟，特别是在家畜推广良种化的过程中发挥重要作用。对海洋动物种质细胞保存研究的范围主要集中在鲑鳟鱼类和牡蛎等少数几种海洋生物上。本研究结合“国家自然科学基金”研究项目，进行了三种贝类和两种鱼类精子的超低温保存实验，得到了它们在液氮（－196 ℃）条件下的适宜保存条件。栉孔扇贝（Chlamys farreri）冻精解冻后复苏比例、受精率和孵化率最高可达到49.39％、42.06％和12.15睦栉孔扇贝精子超低温保存时发生冷冻伤害的温度范围在－30 ℃～－60 ℃；其低温保存的最适降温速率为20 ℃／min；使用抗冻剂二甲基亚砜（DMSO）的最适浓度为5 ℃，其保存效果优于甘油；样品保存的最佳体积为0.6ml～1ml；解冻精子的最适水温为35 ℃，50 ℃次之，20 ℃最差；用自然海水激活解冻后精子的效果好于低盐度溶液；在0 ℃进行预处理平衡时间不宜太长；在抗冻液中加入蛋黄对保存效果没有改善，并且会对冻精的孵化率有抑制作用；用20 ℃／min和5％DMSO冷冻精子，液氮中保存栉孔扇贝精子55天后其复苏比例达到42.17％。超低温保存紫贻贝（Mytilus galloprovincialis Lamarck）精子，解冻后其复苏比例、受精率和孵化率最高可达到41.63％、69.52％和54.74％。保存紫贻贝精子最适降温速率为5 ℃／min，发生冻伤的温度范围是－20 ℃～－60 ℃；使用抗冻剂DMSO的保存效果好于甘油，且使用抗冻剂DMSO的最适浓度为15％；利用自然海水激活冻精效果好于低盐度或高pH值的溶液；样品体积（在0.2～1ml之间）对保存效果没有影响；采用15％DMSO和5 ℃／min的降温速率处理精子，液氮中保存90天后复苏比例仍达到41.8％。保存菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum （Adams and Reeve））精子的最适降温速率为5 ℃／min，发生冻伤的温度范围是－30 ℃～－60 ℃；抗冻剂DMSO的保存效果好于甘油，也用DMSO与甘油混合使用，使用抗冻剂DMSO的最适浓度为10％；利用自然海水激活冻精效果好于低盐度或高pH的溶液；样品体积（在0.2％～1.6ml之间）对保存效果有显著影响。冷冻保存后精子复苏比例、受精率和孵化率最高达到40.84％、68.87％和47.17％；以最适降温速率和抗冻剂浓度处理精子，并在液氮中保存36天后冻精复苏比例仍可以达到38.54％。黑鲷（Sparus macrocephalus）精子经过超低温保存后复苏率、存活率最高可以达到61.37％和61.4。保存黑鲷精子时发生冷冻伤害的温度范围是－20 ℃～－60 ℃，适宜的降温速率为20 ℃／min；使用抗冻剂DMSO的适宜浓度为20％；样品体积对保存效果有相关性；利用自然海水激活冻精效果好于低盐度或高pH值的溶液；使用20％DMSO和20 ℃／min降温速率处理，在液氮中保存黑鲷精子66天后解冻，其复苏率和存活率分别为59.81％和58.45％。在液氮中保存真鲷（Pagrosomus major）精子时发生冷冻伤害的温域为－30 ℃～－60 ℃，适宜的降温速率为20 ℃／min；使用抗冻剂DMSO的适宜浓度为20％；采用低盐度或高pH值的溶液激活冻精的效果不如自然海水。真鲷冻精的复苏率和存活率最高可达到50.73％和62.5；以20 ℃／min和20％DMSO处理真鲷精子，保存在液氮中46天后冻精复苏率和存活率为50.63％和61.02％。通过对多种贝类和鱼类精子的超低温保存实验，不仅获得超低温保存基本条件，并且通过显微镜观察结合前人的研究，对产生冻伤的原因和保护的机理提出了一个模式。

Screening of surfactants for harmful algal blooms mitigation

Screening experiments were conducted in order to find promising synthetic surfactants for harmful algal blooms (HABs) mitigation. The chemically synthesized surfactant cocamidopropyl betaine (CAPB) showed characteristics of relatively high inhibition efficiency, high biodegradability and low cost. The motility inhibition ratios of 10 mg/L CAPB on Cochlodinium polykrikoides and Alexandrium tamarense were about 60% after 5 min. The biodegradation test indicated that the half-life of CAPB in seawater was shorter than one day and 90% was biodegraded after five days under the initial concentration of 100 mg/L at 25degreesC. Further cell lysis experiments revealed the selective lysis effect of CAPB on different HAB organisms. More than 90% of C. polykrikoides lysed at the concentration of 10 mg/L CAPB after 24 h and at 15 mg/L CAPB after 4 h, whereas the lysis effect of CAPB on A. tamarense was slight, no more than 10% after 2 h interaction with 50 mg/L CAPB. This research provided preliminary data for CAPB as a candidate in harmful algal blooms mitigation and pointed out unresolved problems for its practical application in the meantime. (C) 2003 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Impact of microzooplankton and Calanus sinicus (Brodsky, 1962) on phytoplankton in the Yellow Sea during early summer

Dilution incubations and Calanus sinicus addition incubations were simultaneously conducted at five stations in the Yellow Sea in June of 2004 to evaluate the impact of microzooplankton and Calanus sinicus on phytoplankton based on the Chlorophyll a (Chl-a) levels. The Chl-a growth rates (k) ranged from 0.60-1.67 d(-1), while microzooplankton grazed the Chl-a at rates (g) of 0.29-0.62 d(t-1). The addition of C. sinicus enhanced the Chl-a growth rate (Z) by 0.004-0.037 d(-1) ind.(-1) L. C. sinicus abundance ranged from 84.1-160.9 ind. m(-3), which occupied 90.7%-99.1% of the copepod (> 500 mu m) population. The in-situ increase in phytoplankton by C. sinicus community was estimated to be 0.000 4-0.005 9 d(-1). These results showed that microzooplankton were the main grazers of phytoplankton, while C. sinicus induced a slight increase in the levels of phytoplankton.

可可西里地区藏羚的社群特征

藏羚(Pantholops hodgsoni)的集群类型有雌性群、雄性群、母仔群、雌雄混群和独羚5种形式。2002年7月～2003年12月，在可可西里地区沿青藏公路设立试验区，直接观察到936群次，计13795只次藏羚。藏羚的集群类型受到生育周期的影响，季节间差异显著。春季以雌性群(60．49％)和雄性群(30．86％)为主；夏季和秋季主要为雌性群(41．65％，49．66％)和母仔群(49．36％，33．67％)；雌雄混群(58．14％)主要出现在冬季。雄性群在1年中很少见，尤其是夏秋两季，冬季较为常见，多由亚成体雄性组成。独羚是一种特殊的集群类型，占11．32％。常见的集群大小为2～20只，占71．90％，其次是21～200只的群，占16．35％；>200只的集群极少，仅占0．43％，且仅出现于夏季产羔往返迁徙途中。藏羚的集群大小受竞争、捕食风险以及迁徙繁殖的共同影响。藏羚的集群极不稳定，交配期雌雄混合群受雄性亚成体的干扰经常改变，而在迁徙季节大群和小群之间的转换也很频繁。大型集群为雌性群或母仔群，其最适集群大小为2～20只。

高寒矮嵩草草甸不同退化演替阶段植物地上部氮磷元素比较

本研究旨在比较高寒草甸草地不同退化演替阶段下植物地上部氮磷元素含量、吸收速率以及单位面积累计重量.结果表明:植物生长季内(5～9月),3个样地植物地上部N、P含量都是在生长初期最高,随植物生长季节的推移以及地上生物量的增加,其含量逐渐稀释直到生长季节结束,全氮含量范围为36.90～14.90 g/kg,全磷的含量范围是2.22～1.06 g/kg.不同退化演替阶段由于植物组成的不同,其N、P含量有明显的差异,P的含量中度退化样地最高(1.91%),重度退化样地最低(1.51%);N的含量则恰恰相反,重度退化样地最高(26.40%),中度退化样地最低(18.60%);原生植被样地介于两者之间,其生长季P的平均含量为1.63%,N的平均含量为20.80%.植物N、P的吸收速率和单位面积累计重量都是随退化程度的加剧而降低,即原生植被样地>中度退化样地>重度退化样地,并且植物营养元素吸收速率与地上生物量生长速率呈正相关关系.

青藏茶藨子种子中的脂肪酸含量分析

用超临界萃取技术对青藏高原藏药特有植物青藏茶藨子种子中脂肪酸进行了萃取,其萃取率为12.0%.用毛细管气相色谱进行分离和分析,结果表明不饱和脂肪酸在90%以上.其中α-亚麻酸26.23%、γ-亚麻酸2.60%、亚油酸43.21%.

高寒小嵩草草甸种子库和种子雨动态分析

对小嵩草草甸种子库的大小和物种组成及与种子雨、地上植被的关系进行了初步研究。结果表明，返青期和枯黄期小嵩草草甸种子库单位体积（1.0m×1.0m×0.1m）分别有种子nf=10550粒和nk＝13815粒，分别由22种和24种植物组成，分属9个科，其中，莎草科，豆科和龙胆科占优势，禾本科所占比例较小，每平方米种子雨nr=8436.4粒，由25种植物组成，分属10个科，莎草科和禾本科所占比例较大，种子库和种子雨在物种组成上有一定的相似性（r=0.7600,P<0.01），二者共有19个种，分别占种子库和种子雨物种总数的82.61和90.48。地上植被与种子库的相似性较小，地上植被中有43.24和51.35的植物分别在返青期和枯黄期种子库中出现，60％的植物出现于种子雨中。在物种分布和优势度上，地上植被与种子雨间一致性较高，但它们与种子库间有一定的分歧。从地上植被到返青期时的种子库，物种多样性降低了1.61，从而说明种子库不仅是地上植被补充更新的源泉之一，而且是维持植物物种多样性的一种机制。图3参13。