Rapid quantitative detection of Yersinia pestis by lateral-flow immunoassay and up-converting phosphor technology-based biosensor

Up-converting phosphor technology (UPT)-based lateral-flow immunoassay has been developed for quantitative detection of Yersinia pestis rapidly and specifically. In this assay, 400 nm up-converting phosphor particles were used as the reporter. A sandwich immumoassay was employed by using a polyclonal antibody against F1 antigen of Y. pestis immobilized on the nitrocellulose membrane and the same antibody conjugated to the UPT particles. The signal detection of the strips was performed by the UPT-based biosensor that could provide a 980 nm IR laser to excite the phosphor particles, then collect the visible luminescence emitted by the UPT particles and finally convert it to the voltage as a signal. V-T and V-c stand for the multiplied voltage units for the test and the control line, respectively, and the ratio V-T/V-C is directly proportional to the number of Y pestis in a sample. We observed a good linearity between the ratio and log CFU/ml of Y pestis above the detection limit, which was approximately 10(4) CFU/mI. The precision of the intra- and inter-assay was below 15% (coefficient of variation, CV). Cross-reactivity with related Gram-negative enteric bacteria was not found. The UPT-LF immunoassay system presented here takes less than 30 min to perform from the sample treatment to the data analysis. The current paper includes only preliminary data concerning the biomedical aspects of the assay, but is more concentrated on the technical details of establishing a rapid manual assay using a state-of-the-art label chemistry. (c) 2006 Elsevier B.V. All rights reserved.

用光纤生物传感器检测炭疽杆菌、鼠疫杆菌及葡萄球菌肠毒素B

目的：用新研制的光纤生物传感器FOB-3检测多种病原微生物及细菌毒素.方法：利用双抗体夹心法,优化免疫反应的时间和浓度后,用FOB-3分别检测炭疽芽孢及繁殖体、鼠疫F1抗原和葡萄球菌肠毒素B.为便于结果判定,确定截断（cutoff）值,并以Ssignal与NNnoise差值的形式消除荧光信号中的噪声.结果：使用光纤生物传感器FOB-3,在20 min内可分别检测到50～1000 ng/mL的鼠疫F1抗原、0.1～100μg/mL的葡萄球菌肠毒素B、3×10^1～3×10^6 CFU/mL的炭疽杆菌繁殖体和

狭叶沙参复合体（桔梗科沙参属）的物种生物学研究

此复合体原先方7个种，1983年被处理为3个种。本文在黑龙江、吉林、辽宁、河北、山西、山东、江苏、内蒙古对本复合体进行了居群取样，共46个居群。其内进行了引种、栽培实验。生物学特性观察、杂交、染色体观察，同工酶比较，以及用生物统计学进行了性状分析、数量分类学分析、茎解剖和芯粉的观察。 此复合体主要进行异花授粉（因为雄蕊先熟)、没发现无融合生殖。实生苗当年只长基生叶，第二年才抽茎开花。 2、此复合体酯酶酶谱的变异范围相当宽，有时。同一居群内的变异反而比居群间的还要大。因此酶谱在本复合体内的分类价值不大。 3、通过对32个居群进行染色体记数，友现辽东、辽西(绝大部分地区)、山西霍县的居群为二倍体（2n=34），另外还在锦州发现有几个个体2n = 36。其它地方的居群都力四倍体，2n=68、居群间的染色体形态相当一致。 4、通过对移栽自黑龙江口(A•gmelinii的二个居群)、北京(A•polyantha)，山西东部(A•gmelinii和A•polyantha)，锦州的二倍体共9个居群进了杂交试验，发现四倍体间能得到一些F1种子、而辽西二倍体与其它类群间却得不到F1种子。 5、性状分析，茎解剖和数量分类研究发现花的大小和形状、果实的大小和齿的有无、叶的大小和形状（长/宽），往头与花冠相对长度和种子形状等都有一定的分化，尤其是髓锥管束的有无等。通过分析可以分辨出3个二倍体和5个四倍体宗。在 3个二倍体宗中，辽西西部宗(A•polyantha var•ootra ta)与其它两个在形态上已经分化得相当分明，无疑可以作种处理，A•contracta(Kitag) Qu et Hang，另二个（分别在辽东和山西霍县）在形态上也已分化得相当明显，达到了种水平，A•polyantha和A•gme1ireii在5个四倍体宗中，山西东北部和河北的西北部高海拔分布的一个宗，由于它的花萼裂片具齿且狭长，花冠狭长而大、果实大，茎常中空等特征，仍然保留种的地位（A•elata)。另外分布于山西高海拔(包括四倍和二倍体）以及内蒙、吉林、黑龙江…三个宗，虽然有分化，但不明显，尤其是它们都无髓锥管束或仅少数个体有的特征，本文把它们处理为同一种(A•gmelinii)的3个不同三种。最后一个是分布于辽宁最西部、河北、山东、江苏北部、安徽、河南、陕西和甘肃的四倍体宗、它在形态上与辽东的二倍体相似、故作为A•polyantha的两个亚种处理，前者为A•polyantna sspscabricalyx后者为A•P•ssp polyantha： 可以推测过去此复合体的分布范围相当宽，后来逐渐分化成三个二倍宗体，由辽东的A•polyantha ssplyantha(2x)衍生的四倍体，逐渐向西迁移，山西霍县的二倍体产生的四倍体逐渐向北迁移直至东西伯利亚东南部和远东，最后分化成三个亚种。 本文采用杂交指数法，对山西东部和河北西部的A•gme1inii和A•polyantha居群间的杂交性近行了研究，认为两个种在四倍体水平的杂交可能是这两个种间性状在该地区彼此过渡的主要原因。

烟叶唇柱苣苔（Chirita heterotricha）两侧对称花的进化发育途径

被子植物菊亚纲原始类群的花为辐射对称花，伴随着适应性进化和传粉者的专性化，两侧对称花随之出现并快速进化和多样化。与花对称性相关的基因首先在模式植物金鱼草中被分离出来，它们包括TCP 基因家族的两个基因Cycloidea（CYC）和Dichotama（DICH），MYB 基因家族的两个基因Radialis（RAD）和Divaricata（DIV）。模式植物金鱼草的分子发育与遗传学研究初步揭示出在花对称性形成过程中相关调控基因的功能、表达模式及其相互作用机制。研究表明，金鱼草花中CYC 和DICH 基因只在背部表达，控制背部属性。DIV基因早期在所有部位表达，但只影响腹部属性。CYC 和DICH 通过激活与DIV具有颉抗作用的RAD 基因在背部的表达来抑制DIV 基因在背部的作用从而构建了金鱼草的两侧对称花。但是，被子植物繁杂多样的花对称性远非一种模式植物所能概括。此外，被子植物花对称性的演化也是一个悬而未决的问题。要全面了解被子植物花对称性的起源、多样化及其背后的决定机制，有必要进一步研究不同类群中花对称性相关基因的功能变化和进化式样。 苦苣苔科（Gesneriaceae）与金鱼草所属的车前科（Plantaginaceae）同属于菊亚纲的广义唇形目。研究表明广义唇形目的祖先已经具有了两侧对称花，苦苣苔科是广义唇形目的基部类群，具有与唇形目两侧对称花早期分化相关的各种两侧对称花类型。因此，在苦苣苔科选择两侧对称花代表类群开展花对称性的进化发育生物学研究十分有助于探讨苦苣苔科花对称性基因在两侧对称花类群的调控进化，从而揭示广义唇形目基部类群花对称性的进化发育模式。我们选择苦苣苔科两侧对称花类群烟叶唇柱苣苔（Chirita heterotricha）为主要研究材料。烟叶唇柱苣苔是苦苣苔科两侧对称性比较强烈的类群，主要体现在其只有腹部两枚雄蕊能育，背部和侧部雄蕊均败育，与金鱼草的近亲沙漠幽灵花（Mohaveae confertiflora）的形态类似。在沙漠幽灵花中CYC 类基因的表达从背部延伸到了侧部，但是在烟叶唇柱苣苔中是否遵循同一模式还是存在其他途径这是我们的主要研究目的。此外，我们发现在烟叶唇柱苣苔花序的顶花中偶尔会发生腹部化的辐射对称突变花。在金鱼草和柳穿鱼中，CYC 类基因的失活导致了辐射对称突变花的产生，而在豆科植物Cadia purpurea 中，CYC 类基因的活性从背部延伸到了侧部和腹部，导致了辐射对称花的形成。烟叶唇柱苣苔中的情形则值得我们关注。再者，革叶粗筒苣苔（Briggisia mihieri）是烟叶唇柱苣苔的近缘类群，但它具有四枚能育雄蕊（侧部和腹部各两枚）。苦苣苔科两能育雄蕊类群被认为起源于四能育雄蕊类群。我们在烟叶唇柱苣苔野生型两侧对称花和辐射对称突变花中开展花对称性基因的表达模式研究，结合在革叶粗筒苣苔中的研究，试图揭示烟叶唇柱苣苔两雄蕊类两侧对称花形成的分子机制和进化发育途径。 本研究从烟叶唇柱苣苔中分离到4 个CYC 类基因（ChCYC1C，ChCYC1D，ChCYC2A，ChCYC2B），2 个DIV 类基因（ChDIV1，ChDIV2）和2 个RAD 类基因（ChRAD1，ChRAD2）。从革叶粗筒苣苔中分离到4 个CYC 类基因（BmCYC1C，BmCYC1D，BmCYC2A，BmCYC2B），2 个DIV 类基因（BmDIV1，BmDIV2）和1 个RAD 类基因（BmRAD1）。序列和系统发育分析结果显示它们均为花对称性基因。进一步的表达分析显示结果表明：（1）不同拷贝CYC 类基因的表达存在着分化，与其氨基酸序列的分化一致；烟叶唇柱苣苔的CYC 类基因表达从背部延伸到了侧部而革叶粗筒苣苔的CYC 类基因仅在背部表达，与它们的形态分化密切相关。（2）DIV 类基因在种内两个拷贝以及种间的表达无明显的分化，在花的各个部位都有表达。（3）烟叶唇柱苣苔两个拷贝的RAD 类基因的表达存在分化；两个种的同类RAD 类基因的表达也存在分化。这些花对称性基因的表达模式分析揭示了它们在烟叶唇柱苣苔和革叶粗筒苣苔两侧对称花形态建成以及二者花形态的演化中具有重要作用。 同时，我们对烟叶唇柱苣苔的辐射对称突变花进行了自交和F1 代培育，但是F1 代没有出现稳定的辐射对称突变株。我们从辐射对称突变花中分离到的CYC 类、DIV 类和RAD 类基因的核苷酸序列与野生型的完全一致。说明突变体的产生与序列变异无关。RT-PCR 分析表明突变花中CYC 类基因全部失活，而DIV 类基因和在腹部表达的RAD 类基因的表达信号有所增强，这与其腹部化辐射对称的形态相一致。这进一步证实了花对称性基因在烟叶唇柱苣苔花形态建成中的作用。

水稻胚囊发育畸变的细胞学和遗传学研究

1．水稻多卵卵器的起源：被子植物的卵器中通常只有一个卵细胞。我们在水稻多胚品系胚囊中观察到二卵卵器和三卵卵器，本研究对其大孢子发生和胚囊发育进行了细胞胚胎学观察，揭示了水稻多卵卵器的起源．观察结果表明，该品系能进行正常的大孢子发生。大孢子母细胞进行正常的减数分裂形成四个大孢子靠近合点端的大孢子发育，其它三个退化。功能大孢子第一次有丝分裂后两个子核被一中央大液泡分隔在胚囊珠孔端和合点端，与此同时胚囊出现不均衡生长，珠孔端迅速膨大，合点端几乎不增大，致使二核末期的胚囊呈倒梨形．紧接着发生第二次有丝分裂，合点端核分裂时纺锤丝与胚囊纵轴平行，而珠孔端核分裂时纺锤丝与胚囊纵轴成4 5度夹角．由此产生的四核胚囊中，合点端一核向胚囊中部或中上部（胚囊珠孔端）迁移，四核胚囊再经一次有丝分裂形成两种类型的核分布偏离蓼型的八核胚囊。一种类型是珠孔端四个核，中部与合点各二个核，在胚囊细胞化过程中，珠孔端四核 分化成四细胞卵器，其中卵细胞和助细胞各二个，中部的二核分化成二极核中央细胞，合点 端的二核形成反足细胞。另一种类型是珠孔端六个核，合点端二个核，在胚囊细胞化过程中， 两端各一核向中部迁移分化成二极核中央细胞，珠孔端剩余的五核分化成五细胞卵器，其 中卵细胞三个，助细胞二个，合点端的一核迅速分裂形成反足细胞． 2．水稻同源三倍体TAR的生殖特性：TAR的单穗结实率平均可达10%，核型分析表明此三倍体产生的后代个体仍为具有36条染色体的三倍体．细胞胚胎学初步观察显示TAR为一具兼性无融合生殖特性的水稻新种质，其胚珠几乎都能进行胚囊的分化，但其中仅有33%的胚囊有较正常的结构，9%的胚囊在散粉前进行胚胎发生，58%的胚囊发育显著异常，表现为极性紊乱、多极核或缺失雌性生殖单位等。 3．水稻亚种间杂种败育的细胞学基础：对普通栽培稻不同品种类型间杂种颖花败育的细胞学基础及雌性败育的过程进行的细胞学研究表明：1）引起杂种颖花败育的原因有胚囊败育，花粉败育、开花时花药不开裂和雌雄异熟．其中胚囊败育而丧失受精能力是引起低结实率的最重要的因素，开花时花药不开裂和雌雄异熟在一定程度上形成了雌雄性细胞时间和空间的隔离屏障。2）杂种植株的所有大孢子母细胞都能进行正常的减数分裂形成四个大孢子，败育主要发生在靠近合点端的功能大孢子分化形成胚囊的早期，有的胚囊母细胞在进行第一次有丝分裂前便萎缩解体，多数能完成一次或二次有丝分裂形成二核或四核败育胚囊．败育的共同特征是无液泡的分化，细胞质少或退化，在败育胚囊残迹部位，解体的珠心细胞和萎缩的胚囊残溃混杂垛叠．已受精的杂种子房没有观察到胚及胚乳发育的异常．籼粳杂种胚囊败育频率较高． 4．籼粳杂种生殖障碍的基因定位：应用具有1 37个标记位点的籼粳杂交窄叶青8号/京系17)F1花药培养获得的127个双单倍体OH）群体构建的R FLP图谱，对控制籼粳杂种颖花败育的基因座位进行了定位研究。结果在第1、3、4、5、6、7、8、1 2染色体上检测到1 0个基因座位，其中第3、12染色体上的2个不育基因位点str3和str12与同一杂交组合F2分离群体中发现的异常分离热点处于相同的染色体区段．stj-6的基因加性效应为负值，有增加籼粳亲和性的作用;其余的不育基因座位皆有增加籼梗杂种不育性的作用． 5．籼粳杂种胚囊败育的遗传分析和基因定位：利用DH系构建的分子图谱及DH系衍生的2个回交群体定位了引起籼梗杂种胚囊败育的2个互补的主效基因esa-l（E1或e1位点）和esa-2（E2或e2位点），它们分别位于第6和第1 2染色体．在不育基因位点，籼稻基因型为EIEle2e2，粳稻基因型为elelE 2E 2，杂交后代中基因型为EIE2，Ele2、elE 2的雌配子体正常发育，携带ele2基因型的雌配子体表现败育．胚囊育性受配子体基因型控制，孢予体遗传背景影响胚囊败育基因的表达.

分子标记技术在甘兰型杂交油菜育种上的研究与应用

本文应用RAPD分标记技术对我国重要的油料作物“杂油59”杂种种子的Fl代杂种的纯度进了技术鉴定，并完善了这一技术，摸索出这一适合于目前生产应用的实用方法，填补了这一技术在油菜作物应用上的空白。用RFLP技术对我国重要的雄性不育材料“陕2A”细胞质进行了分子水平的鉴定，为证明“陕2A”是一类新型的雄性不育材料提供了重要的实验证据。 对甘蓝型油菜采用DNA快速提取法、酚仿法和CTAB法应用于不同的分子标记分析，实验结果显示： CTAB法适用于样品量大，纯度要术高的RFLP技术，酚仿法适用于引物筛选、DNA模板用量大的PCR反应，而快速提取法特别适合于生产上对种子纯度检测，是生产上推广前景很好的实用技术。 对甘蓝型油菜RAPD技术应用当中PCR体系的建立进行了探讨。实验结果显示：热启动对PCR结果的影响至关重要。而Mg++浓度、dNTP浓度、模板浓度、Tag酶用量对反应结果有不同程度的影响。经过反复实验：当PCR各组分按Mg++，2mM;dNTP，200uM;模板浓度，50ng - lOOng时，PCR的结果最好。PCR反应条件经反复实验后确定为：第一个循环：（热启动）94℃，Imin20sec．OoC 2min循环一次;第二个循环：（解链）94℃ 50sec，（退火）40℃ Imin30sec;（延伸）72℃lmin;循环40次。第三个循环：72℃lOmin，循环1次。反应总体积为20ul时最为适用。 用40个lOmer的RAPD随机引物对“杂油59”的2个亲本“垦C8”和“陕3A” 进行RAPD分析，共出现290条带，分布于3530-220bp之间。引物opA-06、opK-03、opK-13、opj-12出现阳性扩增。经重复实验后确定： opK-03的PCR结果重复性最好，该引物序列为：CCAGCTTAGG。用它对两个亲本进行RAPD分析，PCR结果共出现9条带，其中510bp、260bp为二条特征带。在Fl代中这两条特征带重现性很好。用50个商品用种萌发的F1单株进行验证，检测结果为3个个体没有出现510bp的特征带，4个个体没有出现260bp的特征带，有5个个体出现了其它带，纯度为78%，与生产用种的纯度相符。 通过对“杂优59”不同生育时期及不同取样部位作酯酶同工酶电泳方法与RAPD方法相比较，结果显示：RAPD方法可以弥补同工酶方法的缺限。由于它是基于基因水平的分析技术，可以不受环境条件、发育时期、取材部位等客观条件的限制，并具有取样量小、易操作、费用低、灵敏度高、可以检测出亲缘关系相当近的种闾或种内的材料，具有独到的优点。是值得今后在生产上推广的新技术。 用6个雄性不育材料线粒体的特异探针：ALXR 18（线粒体ATPaseα亚基）;COB 640(脱辅基细胞色素-b);COX -I（细胞色素氧化酶亚基-I）;COX -Ⅱ（细胞色素氧化酶亚基-II;PDC - 12（胡萝卜线粒体随机片断）;C2（玉米线粒随机片断），对“陕2A”，Hybrides Polima，Ogura NSL 94/96, Ogura MLCH036, Ogura NSL, Polima, Fu27,Fu38, Anand等9个材料进行RFLP分析，结果显示：用限制性内切酶EcoR I消化后的DNA与探针COB 640杂交，“陕2A”材料在4.5 kb处缺失，与ALXR 18探针杂交，在4.4 kb、4.2 kb处也明显缺失，证明“陕2A”显然不同与其它不育材料。用ALXR l8为探针，与用内切酶Nc01的酶切片断作Sourthern杂交，在RFLP谱带上6.1 kb、2.4 kb、2.5 kb处明显缺带，进一步为“陕2A”是一种新型的甘蓝型油莱雄性不育系提供了证据。

OsLIC1基因参与水稻株型调控的功能研究

CCCH型锌指蛋白是进化上比较保守的一类锌指蛋白家族，其典型的氨基酸的基序为C-X7-8-C-X5-C-X3-H，其中X为任意氨基酸，这类锌指基序一般以重复的双拷贝形式存在。本论文克隆并鉴定了一个全新的、只含有一个CCCH型锌指基序的基因，利用反义RNA策略研究该基因功能，结果发现该基因的反义转基因植株表现出叶夹角增大的表型，因此我们将该基因命名为OsLIC1（Oryza sativa Lamina Increased Leaf Angle Control 1）。生物信息学分析发现该基因定位于水稻6号染色体近端粒的一端，位于BAC克隆AP004324中。OsLIC1与通常的CCCH型锌指蛋白含有多个重复的CCCH锌指基序不同，它只含有一个CCCH型锌指基序。除了CCCH锌指结构域以外，该蛋白在靠近C-端的位置还有一段丝氨酸（Ser）富集的区域，在此区域之前，还有一个在真核生物中相对保守的，以EELR为核心基序的结构域。采用基因枪将含OsLIC1-GFP融合构建的瞬时表达载体轰击入洋葱内表皮细胞，激光共聚焦显微镜观察发现OsLIC1-GFP可以定位到细胞核中。利用酵母转录激活系统发现以EELR为核心基序的结构域具有转录激活的功能。体外核酸结合活性分析显示OsLIC1蛋白可以结合双链DNA，这些结果证明OsLIC1是一个转录因子，这也是在植物中首次发现CCCH型锌指蛋白可以作为转录因子的方式调节基因的表达。 用玉米泛素启动子（Maize Ubiquitin promoter）驱动OsLIC1基因的反义表达载体转化水稻，获得的内源OsLIC1基因表达量下降的转基因植株表现出三个明显的表型：转基因植株的叶夹角增大;转基因的株高低于对照以及转基因植株的穗粒数减少。扫描电镜观察发现转基因植株叶夹角增大是由于近轴面细胞排列发生了改变以及维管束发育受阻引起的。转基因植株的Southern Blot和RT-PCR分析，结合Western Blot分析证明了转基因植株的表型与转基因事件之间的直接联系，并证明了转基因植株中内源OsLIC1在蛋白水平的确受到了抑制。采用RT-PCR技术、Promoter：：GUS和RNA in situ杂交三种方法相结合研究OsLIC1基因的表达模式，结果表明OsLIC1基因主要在叶颈、节以及分蘖原基中表达，这与转基因植株的表型相吻合，进一步证明了转基因植株的表型与基因功能之间的关系。Affymetrix 水稻全基因组芯片分析结果显示许多受油菜素内酯诱导表达的基因在转基因植株的叶颈材料中表达量上调，RT-PCR进一步验证了这一结果。由于在转基因植株中出现的叶夹角增大的表型和水稻油菜素内酯的作用相似，而基因芯片的结果又从分子水平提供了证据和线索。进一步采用RT-PCR和Promoter：：GUS相结合的方法研究OsLIC1基因对油菜素内酯的响应，结果发现OsLIC1基因可以被油菜素内酯诱导表达。而且，OsLIC1基因的反义转基因植株与野生型相比，表现出对油菜素内酯信号更敏感的响应。根据以上结果，推测OsLIC1可能是水稻油菜素内酯信号转导途径的负调控因子。水稻油菜素内酯合成和信号转导的突变体d2-1和d61-1具有直立的叶片的特征。用反义OsLIC1转基因植株以及野生型水稻与d2-1和d61-1突变体分别进行遗传杂交，结果发现在反义OsLIC1转基因植株与d2-1和d61-1突变体的杂交F1代中，都表现出叶夹角增大的表型。但是，在F2代中，在d2-1和d61-1纯合背景下，分别表现出叶夹角增大和叶片直立的表型，说明OsLIC1上位于d2-1，而d61-1则上位于OsLIC1。这一结果进一步证明了OsLIC1是通过参与水稻油菜素内酯信号调节而发挥对水稻叶夹角的调控作用。

北方农牧交错区土地利用（管理）方式对土壤氮素转化的影响

土壤氮素矿化是陆地生态系统氮素转化的重要组成部分。不同的土地利用（管理）方式会改变土壤氮素转化过程，影响土壤肥力的保持，进而可能造成土壤内氮素渗漏流失。为系统了解内蒙古农牧交错区土壤氮素转化的特点，本实验采用原位培养顶盖埋管法进行野外培养，每间隔一个月定期取样，于2004年7月-2006年10月在植物所恢复生态学实验站进行了两个试验，1：选择农牧交错区四种有代表性的土地类型（围封样地：FS，放牧样地：GS，弃耕地：AF，和农田：CF），比较土地利用方式之间氮素矿化的异同;2：在施肥样地通过不同施肥处理(F0: 1g N m-2, F1: 1g N m-2, F2: 2g N m-2, F3: 4g N m-2, F4: 8g N m-2, F5: 16g N m-2, F6: 32g N m-2, F7: 64g N m-2) 的土壤氮素转化动态，确定过度放牧的典型草原围封禁牧后，植被恢复过程中最适宜的施肥量。主要结论如下： 1. 与试验初期相比，整个非生长季围封样地、弃耕地和农田的铵态氮和无机氮含量逐渐降低，培养结束时铵态氮含量分别减少了67.04％，77.31％和70.54％，而放牧地的含量增加1.63％。围封样地、放牧地、弃耕地和农田的硝态氮含量分别增加了61.61%，376.43%，199.75%和133.16%。非生长季四种土地类型的土壤氮素转化速率主要受温度影响。围封样地、放牧地、弃耕地和农田非生长季矿化速率均值分别为-0.016，0.0429，-0.0051和-0.0030 μg g-1 d-1。硝化速率均值变幅为-0.43-0.17 μg g-1d-1。 2. 与没有冷冻而融化的土壤相比，冻融显著影响土壤无机氮含量的变化。只有在较低的土壤温度条件下冷冻以后，融化才会促进土壤氮素矿化。不同的冷冻时间长度下融化均会促进土壤硝化速率。土壤温度、土壤含水量变化是影响氮素转化速率的重要因子。 3. 四种土地类型的年日均矿化速率为放牧样地>农田>弃耕地>围封样地，分别为0.25，0.11，0.10，0.06μg g-1d-1，其年平均速率分别为11.65，5.50，5.00和2.46g m-2 y-1，而年日平均硝化速率分别为0.27，0.095，0.097和0.05μg g-1d-1。其中生长季日均矿化速率和日均硝化速率均为其年日均速率的两倍。因此，生长季形成的矿化氮是全年的93％，而形成的硝态氮占全年的86％。四种土地类型年均矿化氮的累积量平均为615.04 kg ha-1，而硝化作用的累积量变幅为230.44-1218.86 kg ha-1。四种土地类型的矿化速率和硝化速率的季节动态变化与气候因子的变化一致。 4. 不同施肥处理对典型草原土壤氮素转化均有显著影响。与对照相比，少量施肥（F1，F2）土壤铵态氮，硝态氮和无机氮含量分别减少20.57％，11.18％和17.18％。当施肥量大于F4（8g N m-2）时，随施肥量增加土壤铵态氮，硝态氮和无机氮含量增加18％-1191％。除F5（16g N m-2）外，与对照相比，随施肥量增加，土壤矿化速率增加了5-21倍。4 g N m-2 (F3)左右是典型草原生态系统比较合适的施肥量。 5. 氨气挥发速率的季节动态特征与气象因子的变化一致，其速率变幅为17.65 - 1228.39µg m-2 d-1，其中7月挥发量占全年的37％。与对照相比，少量施肥氨气挥发速率降低了1-2％，施肥量大于F3 (4g N m-2)，速率增加了1-4倍。实验期间总的流失量变幅为23.76-84.91mg m-2，而且通过氨气挥发流失量低于土壤全氮的3%。氨气挥发不是典型草原过量氮素流失的主要方式。 6. 氮素限制的典型草原，植被恢复过程中外源氮素添加阈值为：4 g N m-2 (F3)。与对照相比，短期施肥（3年）不会显著影响根系碳储量和土壤碳氮储量。施肥处理的土壤硝态氮和无机氮含量显著增加，说明施肥显著刺激硝化作用。典型草原60%植物根系主要分布在地下0-10cm，这里的碳储量占地下储量（0-50cm）的63%以上。随土壤深度增加，土壤全氮，全碳，无机氮储量降低。而铵态氮储量和可利用的无机氮含量随土壤深度增加，说明植物根系主要吸收利用上层可利用氮素，而且下层氮素矿化速率降低。

小麦杂交坏死蛋白质组学研究

小麦杂交坏死是某些小麦杂交种表现出的叶片提前逐渐死亡的现象。它是由两个坏死基因Ne1和Ne2在杂交种中相遇后发生显性互补引起的。坏死从叶片尖端逐渐过渡到叶片基部，从成熟叶片发展到幼嫩叶片。一些严重坏死的F1完成它的生活周期前就在不同的生长阶段死去，无法获得F1种子，这就限制了携带优良性状的亲本的选择和优良基因的交流。另外，小麦杂交坏死是一个独特的研究植物程序性死亡的遗传系统。虽然小麦杂交坏死这种现象已经发现很多年，但其详细的分子机理却仍然未知。对小麦杂交坏死的分子机理进行深入研究将有助于克服小麦杂交利用中杂交坏死的遗传障碍，此外，也为深入研究植物的PCD机理提供可操作靶分子。 本论文采用高通量蛋白质组研究技术对小麦杂交坏死进行了研究。携带坏死基因Ne2的小麦品种Pan555（P）和携带坏死基因Ne2的小麦品种Zheng891（Z）生长发育完全正常，将两个亲本杂交，所得杂交F1代PZF1表现杂交坏死。在小麦生长阶段8，旗叶（Flag leaf）刚刚出现，PZF1的旗叶下第一片叶子（FL-1）还是完全绿色，FL-2叶尖开始有坏死斑出现。在这个阶段，分别将PZF1，P，Z的FL-2叶剪成相等的尖，中，基三段。我们选择的PZF1的FL-2叶，其叶尖段已经有成片的坏死斑出现;中间段零星出现少量坏死斑点;基部段和亲本一样还是完全的绿色，代表坏死进程中的不同阶段。又选PZF1的FL-1和FL-2分别代表杂交坏死启动前和杂交坏死启动后。两个亲本P和Z的FL-2叶的三段及FL-1叶正常，都是完全绿色。 首先分别分析了PZF1，P和Z的FL-2叶的尖、中、基三段的蛋白表达情况。在PZF1的尖、中、基三段共检测到23个差异表达蛋白点。这23个点在两个亲本的尖、中、基三段中的表达丰度没有显著差异（p<0.05），说明这23个蛋白的差异表达不是由于叶段的不同引起，确与杂交坏死相关。对这23个蛋白进行了MALDI-TOF质谱鉴定，其中18个得到成功鉴定。然后对PZF1，P和Z的FL-1叶和FL-2叶的蛋白表达情况进行了分析。与PZF1的FL-1叶比较，在FL-2叶中检测到19个蛋白上调，20个蛋白下调。这39个蛋白的丰度在两个亲本的FL-1和FL-2叶之间没有显著差异，说明这39个蛋白的差异表达不是由于叶位的不同引起，确与杂交坏死相关。对这39个蛋白进行质谱鉴定其中26个得到成功鉴定。 根据被鉴定蛋白的功能及其表达丰度的变化，对这些蛋白在小麦杂交坏死中可能的作用进行了讨论。与PZF1的FL-2叶基部相比，S-腺苷同型半胱氨酸水解酶（S-adenosyl homocysteine hydrolase）在中部极显著（p<0.01）下调，而在中部和尖段之间没有显著差异，保持低丰度不变。腺苷甲硫氨酸3（AdoMet synthase 3）和甲硫氨酸合成酶1（Methionine synthase 1）都在PZF1的FL-2叶尖段上调。甲基化循环中的这3个酶比例的不协调可能会以不同的方式加速细胞老化。 与PZF1的FL-1叶比较，尿卟啉环脱羧酶（Uroporphyrinogen decarboxylase）在FL-2叶中下调，这将引起尿卟啉环III的积累。脂加氧酶（Lipoxygenases）在FL-2叶中上调。尿卟啉环III的积累和脂加氧酶的上调都会引起细胞内活性氧的增加。另外活性氧和脂加氧酶都会使脂发生过氧化作用，进而导致细胞膜完整性受到破坏，最终可能导致细胞死亡。 与基部段比较，在PZF1的FL-2叶的尖段和/或中间段;以及与PZF1的FL-1叶比较，在FL-2叶中，都有很多防御性蛋白的上调，这暗示应对活性氧、脂过氧化、甲基化循环中三个酶比例的不协调等引起的对细胞的破坏作用，细胞可能启动了抗细胞死亡系统来应对这种细胞内部的胁迫。 然而，与基部段比较，一些能量相关蛋白在PZF1的FL-2叶的尖段和/或中间段;以及与PZF1的FL-1叶比较，在FL-2叶中的异常表达可能会以干扰能量循环的方式加速细胞死亡。另外，与FL-2基部段比较，在尖段和/或中间段，以及与PZF1的FL-1比较，在FL-2中，都有一些防御性蛋白、蛋白合成相关的蛋白以及单链DNA结合蛋白下调，它们的变化可能会降低细胞的抵抗力，蛋白合成能力以及DNA修复能力。细胞正常代谢的很多方面都受到干扰从而使PZF1叶细胞最终走向死亡。 本研究中发现了三个甲基化循环中的酶变化，而且S-腺苷同型半胱氨酸水解酶是在坏死进程的较早阶段发生下调，它的变化可能是小麦杂交坏死的一个诱因，这暗示小麦杂交坏死可能是一个表观遗传学事件。另外本研究还发现一些和活性氧，脂氧化等相关的蛋白的变化，而活性氧增加和脂氧化都是细胞凋亡的典型特征。所以本研究为表观遗传细胞凋亡和氧化胁迫细胞凋亡的研究提供了很有价值的信息。

葡萄杂种实生苗糖酸品质童期鉴定的初步研究

对山葡萄(Vitis amurensis)杂交的F1、F2、F3杂种后代中，果实搪、酸含量不同的实生苗叶片，进行了Vc、VB1Vpp的分析测定，并对这些植株的叶片、卷须、一年生技条扦插芽和种子播出的幼苗分别进行了过氧化物酶同功酶的聚丙烯酰胺(PO-lyacrylamide)垂直平板电泳分析。实脸结果表明:在三代的实生苗中，Vc、VB1、Vpp的含量与含糖量均呈正相关，Vc和Vpp与含酸量负相关，VB1与含酸量呈正相关，Vc与Vpp呈正相关.Vc含量低的实生苗易受冻而导致萌芽推迟，Vc在果实潜色期间呈动态变化，着色期早的Vc含量降低，正处在着色期的Vc含量最低，着色晚的Vc含量就高。叶片中Vc、Vpp含量可作为实生苗含量筛选的参考指标。 而且发现，在实生苗幼龄阶段，通过过氧化物酶同功酶能够从品质上进行单株分离与筛选。一年生枝条的扦插芽以及生长季节的卷须和叶片为材料的分离筛选效果相对稍差。F1实生苗中，抗寒、含糖量高的单株表达出双亲的酶带;F2品贡优良的单株从表达出亲本中含糖童截的酶潜并且酶带数目相对少些的单株中产生;F3品质优良的单株则从酶谱复杂、杂种谱带较多的单株产生;品质性状较劣，同功酶表现出相反的结果。这为育种工作中果实品质性状的童期鉴定提供了参考依据。在实际鉴定工作上，最好有几种方法，几种酶的功酶联合使用。

饲养层FGF2表达量对猕猴胚胎干细胞自我更新及多能性的影响

用转基因和RNA干扰(RNAi)法建立5组不同成纤维细胞生长因子-2(fibroblast growth factor-2,FGF2)表达量的猕猴耳部皮肤成纤维细胞(MESF)系:过表达FGF2组(f1),过表达的阴性对照组(f2),FGF2 RNA干扰组(f3),RNA干扰的阴性对照组(f4)和未作任何处理的对照组(f5).5组MESF的FGF2表达量相对值为f1:f2:f3:f4:f5=4:2:1:2:2;c-fos,TGF-β1,INHBA,Gremlinl在f1中表达量上升,在f3中表达量下降;BMP4,TGF-β2在f1中表达量下降,在f3中表达量上升;表明内源FGF2能够作用于MESF的TGF-β信号通路,引起相关基因表达量的变化.用这砦细胞作为饲养层长期培养(10代)猕猴胚胎干细胞(RhESC),结果在f1上培养的RhESC增殖速度都比对照组快,并且c-fos,TGF-β1,INHBA,Gremlinl,Oct-4,Nanog,Sox2表达量均上升,BMP4表达下调;在f3上培养的RhESC增殖较慢,BMP4表达上调,c-fos,TGF-β1,INHBA,Gremlinl,Oct-4,Nanog,Sox2表达下调.5组MESF上培养的RhESC形成的EB均表达各胚层早期标记基因(marker),说明RhESC的多能性没有受到影响,但表达量有差异,f1上RhESC形成的EB所有marker都低表达.结果表明饲养层的FGF2含量不仅影响自身相关基凶的表达,还对RhESC的自我更新有一定的作用.

云南纳帕海越冬黑颈鹤日间行为模式与年龄和集群的关系

2006年10月2007年5月,在云南省西北部纳帕海,采用路线调查结合瞬时扫描行为取样法,对越冬黑颈鹤(Grus nigricollis)种群的时间分配及其与年龄、集群和时间的关系进行了观察.结果说明,黑颈鹤越冬活动主要足以觅食为主,占日间时间的(76.81±9.1)%.越冬期间黑颈鹤日间行为的节律性较为明显,具有适应高寒气候的特点.集群形式对成鹤的行为有着显著影响,集群和家庭中活动的成鹤红觅食、警戒和争斗中存在显著差异(F1.76=0.27、0.77,U=2779,P=0.001-0.000).年龄是影响鹤群行为的因素之一.幼鹤相比成鹤有较多的觅食时间和休息时间,警戒行为比例较低(F1.76=0.04-2.59,U=188-2779,P=0.006-0.000),且小受集群形式的影响.随着越冬期间的早、中、晚3个时期的环境变化,黑颁鹤的时间分配有显著变化(F2.36=4.63-26.54,x22=5.29-13.68,P=0.0016-0.000).不同越冬地的黑颈鹤行为存在差异.气候、食物资源和人为影响可能是造成这些差异的主要因素.

不同世代改良型路南奶山羊血液免疫学参数的比较研究

本文测定了“改良型路南奶山羊”的亲本及改良不同世代 (F1,F2 ,F3,F4 )母羊的外周血T淋巴细胞转化率、ANAE阳性率、B淋巴细胞ZYC花环率、红细胞IC花环率、C3b花环率以及血清γ -球蛋白等免疫学参数 ,比较研究其随着世代增递的变异情况。结果表明 :从亲代到F4代随着改良世代的递增 ,T淋巴细胞转化率、ANAE阳性率、红细胞C3b花环率和IC花环率和血清γ -球蛋白含量均呈F1>F2 >P >F3>F4变化 ,ZYC花环率呈F1>P >F2 >F3>F4变化。回归分析的结果表明 :从亲代到改良四代 ,上述各项免疫学参数均呈显著负相关 ,趋势线为下降趋势。即随着世代的递增有逐代递减的趋势。结果提示 :用西农莎能羊改良路南圭山羊 ,其改良一代和二代的上述各项血液免疫学参数均略高于路南圭山羊 ,以后随着世代的递增有逐代递减的趋势。预示着随着世代的递增 ,改良型路南奶山羊的体质状况 ,免疫功能和抗病能力可能会出现下降趋势。

东北梅花鹿与东北马鹿种间杂交F_(1)能育性的细胞遗传学基础的研究

从F_(1)的染色体组型、G带、C带和Ag-NORs观察表明: F_(1)双亲鹿 的染色体高度同源, 差异只涉及一个罗伯逊易位, F1两性皆育说明其亲本鹿之间 隔离机制不完善。这两种鹿应属同一个孟德尔群体。图版3参11