光系统II反应中心复合物组成性质与光仰制分子机理研究

由于光系统Ⅱ反应中心Dl/D2/Cyt b559色素蛋白复合物(PSII-RC)的红 区吸收光谱严重重叠，给其组成特性研究及光抑制分子机理研究造成 了困难，因此我们运用多种光谱分析技术配合计算机数据处理技术对 PSII-RC复合物的组成特性进行了研究，并用自己建立的方法对PSII-RC 的色素和多肽的化学计量进行了进一步确定，另外还重点研究了单线 态氧在PSII-RC光破坏中的作用，据此提出新的PSD[-RC光抑制分子机 理。主要结果如下： 1．用反相HPLC外标法测定我们制备的色谱纯PSR-RC样品的色素化 学计量结果为Chl:Pheo:Car= 6:2:2。我们发现，当PSII-RC中存在微量CP47 时，Chl: Pheo的比例与CP47的含量呈正相关关系，说明较高的Chl比例 可能表示样品中有CP47污染。结果还表明PSII-RC中Car: Pheo的比例也与 CP47含量有关，说明CP47可影响Car在PSII-RC上的结合，这暗示CP47可 能结合Car，或者CP47对PSII-RC上Car的结合位点有影响，这一推测对阐 明CP47的功能有一定启发作用。 2．建立了一种估算PSII-RC多肽化学计量的理论计算方法，即利用计 算机统计PSII-RC中各多肽组分的不同氨基酸残基数量，以确定不同多 肽化学计量时的理论氨基酸残基组成，并与PSlI-RC的实测氨基酸残基 组成进行比较，得到所用PSII-RC样品的多肽化学计量值为D1+D2:Cyt b559-o+邮：I=2:1:1. 3．对PSII-RC的红区吸收光谱进行了高斯解析，发现680 nm附近含有 峰高和半高宽明显不同的两个高斯组分，它们对光抑制处理的响应具 有明显差别，分别表现了P680和Pheo的特征。由此可知，在680nm处除了 有P680的信号外，PSII-RC中的Pheo在这个区域也有跃迁组分。这个结果 表明光抑制进程中PSII-RC红区吸收光谱信号的下降除了P680的破坏 外，还与Pheo的破坏有关。 4．用Ste)anov关系式分析了PSII-RC色素激发态分布的平衡状态，发现 经过暗适应的PSII-RC的激发态可达到充分的平衡，光抑制处理可导致 PSIL-RC激发态平衡受到破坏。 5．用荧光发射光谱观察到PSII-RC在光抑制进程中有弱光破坏和强光 破坏两个破坏过程，前者是与色素间能量传递的色素结合状态与 取向的破坏，后者与色素本身化学结构的破坏有关。通过研究不同激发波长下的发射光谱发现Car的弱光破坏过程比Chl快，暗示Car可能的保护作用，而Pheo的破坏程度比Chl小。从发射光谱组分的光破坏时间 进程推断强光破坏过程导致的色素破坏是多步反应，验证我们小组原 先报导的PSII-RC的多步反应特性。 6．首次将磁圆二色光谱( MCD)技术应用于PSII-RC研究，发现MCD明显表现出比吸收光谱要丰富得多的光谱精细结构，同时还具有较高的灵敏度和分辨率，不经过任何解析就可直接观察到680 nm组分及其它色素组分的变化，而且PSⅡ-RC中的Car没有明显MCD信号，使PSII-RC谱 图简化，便于进一步分析。用MCD技术还观察到光抑制初期Chl从PSII- RC复合物上脱离及Pheo的光破坏现象。 7．分别用HPLC法、吸收光谱高斯解析法、荧光发射光谱分析法和MCD法共四种方法证明了PSII-RC中Pheo的光破坏，充分证实我们小组关于Pheo光破坏的报导，同时还证明Pheo的光破坏是单线态氧作用的结果。 8．给出了单线态氧参与PSII-RC色素和蛋白光破坏的直接实验证 据，即发现光抑制过程中色素和蛋白的破坏受到单线态氧的特异性清除剂的保护，用化学方法在暗中产生的单线态氧同样造成与光抑制相 似的PSII-RC各组分的损伤，由此说明单线态氧是PSII-RC光抑制过程中 的直接破坏因子。 9．提出了PSII-RC中Hiis残基光破坏的一种新的分子机理。用组氨酸残基的特异性化学修饰剂证实以前我们实验室发现的PSI[-RC组氨酸残基的光破坏，根据比较蛋白变性前后的测定结果，初步证明PSIl-RC中 受光破坏的His残基位于P680附近。我们还观察到光抑制处理后，PSII- RC表现与组氨酸残基被修饰后的样品相似的紫外吸收特征，由此提出 PSII-RC中His残基光破坏的一种分子机理，即His残基的眯唑环上的两个氮原子与其它多肽上的游离氨基在单线态氧的作用下发生反应形成酰 胺键而导致PsII-RC多肽间的共价交联，推测PSII-RC中His残基的光破坏与其蛋白的光致交联和降解有直接的因果联系。

光系统Ⅱ反应中心细胞色素b559结构和功能的研究

植物已经演化出多种保护其免受强光抑制和破坏的机制，从而使植物体在自然界能够应付复杂多变的光照环境。虽然人们早就确定Cyt b-559存在于PSII反应中心内，但目前对其性质与功能的认识还不充分。本工作的目的就是研究Cyt b-559天然分子特性，探讨其生理功能和存在的意义。取得了一些有新意的结果： 1、依据PSII反应中心分离纯化的原理，应用更有效的层析介质DEAE-Sephacel，我们设计了快速高效的从菠菜和水稻中分离纯化Cyt b-559的方法和流程，获得了高纯度的样品。它们在非变性胶电泳中具有相同的泳动性。蛋白组分的HPLC结果证明，纯化的Cyt b-559的确由两个亚基组成，α亚基和β亚基的分子量用我们设计的适合于分析小蛋白的Tricine—SDS—PAGE方法准确测定为9.4kDa和4.5kDa。 2、利用HPLC技术分析了纯化的Cyt b-559样品的色素组成，结果表明Cytb-559中含有Chl α而不含类胡萝卜素分子，这一结果通过吸收光谱和共振拉曼光谱的分析得到进一步地证明。通过等电聚焦方法分析了Cyt b-559的等电点，发现其亚基的等电点相差很大，全蛋白的等电点与...更多D1、D2蛋白的等电点也不相同，推测在体内生理pH条件下它们具有相反带电性而在PSII组装中发挥作用。 3、低温荧光光谱的检测结果表明，Cyt b-559的荧光发射峰位在563nm和666nm;首次证明Cyt b-559可以发出荧光和将电子传递给结合在其上的辅助叶绿素，但传递能力比较低故而导致其荧光特性与PSII反应中心的不相同。Cytb-559的紫外荧光光谱表明Trp残基位于其内部的疏水区域，证明Cyt b-559中的芳香族氨基酸可能在其功能的发挥中起一定作用。 4、通过MCD的分析，发现Cyt b-559中血红素的MCD信号在540—580nm和400—440nm波段，而且光谱形状和强度与PSII反应中心的相一致，说明PSII反应中心该范围内的MCD信号中有Cyt b-559的贡献。FTIR光谱的测定结果证明Cyt b-559血红素的配体是组氨酸，其二级结构中α-螺旋占了一半。此外，还比较了Cyt b-559和PSII反应中心的膜脂成分，发现两者有很大的相似性。不同植物来源的Cyt b-559在许多性质上都表现出高度一致，从一个侧面证明Cyt b-559在进化中的保守性。 5、PSll反应中心发生光破坏时，原初电子供体P680己受到严重破坏。我们发现，在光抑制的最初一段时间内，Cyt b-559吸收峰值发生变化：在受体侧光抑制的条件下，其吸收峰值先略有增加而后才下降，而在供体侧光抑制条件下则相反，说明 Cyt b-559对光抑制的发生非常敏感，可能在光抑制早期保护PSll反应中心。 6、纯化的Cyt b-559的组氨酸含量在照光前后没有显著的变化，说明 PSll反应中心内被破坏的组氨酸不属于Cyt b-559。PSll反应中心所含的组氨酸中有些可被DEPC修饰，但我们的实验结果表明DEPC不能修饰Cyt b-559的组氨酸。这可能有利于Cyt b-559保护功能的发挥。 7、我们观察到，在两种光抑制条件下，LP Cyt b-559光还原和 HP Cyt b-559光氧化具有对pH值的依赖性，说明Cyt b-559在光保护中的作用不仅与其高低电势态有关，而且与其质子化程度有联系。CCCP促进HP Cyt -559释放质子，从而维持循环电子传递。DCBQ和 DCMU在很低浓度时都抑制 Cyt b-559光还原，前者不影响Cyt b-559光氧化而后者在CCCP存在时也会抑制Cyt b-559光氧化。 8、Cyt b-559有定位PSll反应中心其它蛋白的锚蛋白的作用。黄化苗转绿实验证明在 HP Cyt b-559的含量增加超过 45％以后放氧活性开始逐渐增加。Cytb－559从低电势态到高电势态的转变是放氧复合物组装到PSll反应中心的关键步骤之一。在植物正常生长时，Cyt b-559与 P680的其它电于供体发生竟争，起到安全阀门的作用。 9、在逆境条件下，Cyt b-559具有保护PSll反应中心免受强光破坏而起到“分于开关”的作用。我们的实验表明，在室温条件下存在通过Cyt b-559的环式电子流，存在从氧化态LP Cyt b-559到还原态HP Cyt b-559的一个循环，其中的氧化还原变化与质子化／去质子化反应相连。通过与其它血红素蛋白的比较，我们推测 Cyt b-559“分子开关”的关键是：光抑制情况下，铁原子与远端His之间的疏水空穴被氧自由基占据后使得铁进入叶琳中央孔中，迫使近端HIS向叶琳平面位移，从而引起 Cyt b-559构象改变，使电势态发生转变。

光合放氧结构与机理的理论探索

光合放氧研究近十年来已有重要进展，但在该领域仍有很多重要问题待研究。本论文工作主要是对光系统氧化侧与光合放氧密切相关的组分的结构和性能进行理论和模拟研究，工作可概括如下： (一)、放氧中心结构和性能的探索。 1、对放氧中心Mn202单元与配体组氨酸、H2O和Cl等结合方式的理论研究显示：(a)、组氨酸和H20分子均可能与Mn202平面垂直，彼此保持较大的距离，且结合在不同的Mn离子上;(b)、2个H2O分子可能结合在不同Mn202单元上。 2、对Mn簇核心骨架的理论研究显示有必要引入新的Ca、Cl结合方式，以防止因两个Mn202单元线性化而导致2个H2O分子结合位点远离。 (二)、次级电子给体Tyr_z和Tyr_D的结构与功能。 对次级电子给体Tyr_z和Tyr_D进行精确量子化学研究显示：(a)、在中性条件下，Tyr_D和Tyr_z均只与组氨酸通过氢键作用;(b)、当失去电子后，结构发生明显变化，导致正电荷主要集中在组氨酸上，自由基主要集中在Tyr上;(c)、第三组分(H_20分子或羧基等)的引入使中性体系不容易给出电子;(d)、结合最新文献报导，推测Tyr_D~+和Tyr_z~+除与组氨酸作用外还可能分别与水和羧基作用。 (三)、原初电子给体的理论和模拟研究。 1、对紫细菌原初电子给体P_(870)的理论研究显示：(a)、双分子结构比单分子结构稳定;(b)、电荷分离之后，原初电子给体原有的空间结构不再是稳定的构型，它会向能量和化学活性均更低的构型转变。在光合细菌的原初电子给体P870中，这种转变可通过C3位的乙酰基旋转使其氧原子与另一个细菌叶绿素分子的镁原子相互作用使P870+•的总能量和化学活性明显降低。推测这种构型转变对于防止原初反应过程中的电荷重组、维持光能的高效转化有重要意义。提出了原初反应过程中结构动态变化的新观点，利用这一观点可对光合细菌原初反应动力学研究所观测到的慢过程及蛋白质微环境对原初电子给体和原初反应都有重要影响等实验现象给予较好的解释。 2、对光系统II原初电子给体P680的结构进行理论探讨，提出了两个叶绿素a分子平面间夹角为50.0±2.5°时能量最低的夹角模型。 3、采用N-甲基咪唑(C4H6N2)模拟生物体内的组氨酸，通过观测CCL4中的Chla与C4H6N2反应的吸收、CD和MCD光谱得到以下结论：(a)、在纯CCL4中，每个Chla处于5配位状态，Chla形成不对称的双聚体，彼此之间存在较强的偶合作用。提出两个Chla通过不等价的2个Mg-O配位键(O分别来自于C131位的酮基和C17位酯基的C=O)连接为紧密双体结构;(b)、当C4H6N2／Chla = 0.5和1时，其吸收、CD和MCD光谱均发生明显变化，两个Chla之间的偶合作用明显减弱，但此时仍为双聚体。推测C4H6N2首先取代原紧密双体结构中Mg-O酯键，进而取代Mg-O酮键，最后两个Chla分子通过两个Mg…O弱相互作用连接为松弛的双体结构，该模型与理论获得的P_(680)的结构相似。 在上述研究的基础上，提出了包括放氧中心外围配体和TyrZ在内的放氧中心结构新模型。在新结构模型中，2个H2O分子不对称地结合于“C”形结构开口端两个低价的Mn1II和Mn4III上，并保持较大距离;两个组氨酸的咪唑环通过N原子与两个高价的Mn2IV、Mn3IV结合;Cl结合于MB4TM，并与Ca相连;Ca通过O桥和COO-相连使两个Mn202单元保持特定空间构型。TyrZ通过组氨酸(D1-His190)与Mn簇作用。此外，新模型尝试着在O桥上引入质子。放氧中心结构及其邻近环境(包括TyrZ和TyrD)整体处于中性状态。 同时还提出了新的放氧机理，认为电子和质子的释放非同步进行，并首次明确提出两个水分子的不对称氧化和结构动态变化等观点。认为Ca在维持放氧中心的结构方面担负重要作用，C1与Mn离子之间的亲核作用变化是放氧中心结构变化的关键。

理化因子对PSII内周天线CP43和CP47色素蛋白复合体结构与功能的影响

从菠菜叶绿体中分离纯化出PSII内周天线CP43及CP47色素蛋白复合物。通过利用光谱学手段 (吸收光谱、荧光光谱、CD光谱等)及生化技术(HPLC和电泳等)，研究了酸、碱、强光及高温等理化因子对其结构和功能的影响。结果如下： 1：酸和碱处理对CP43和CP47结构和功能的影响 1），酸、碱处理均使CP43和CP47红区主峰吸收降低，蓝区Soret带吸收降低，Soret带的附属带吸收增加，红区及蓝区吸收主峰均蓝移。酸处理时在542 nm及510 nm附近出现Pheo a的吸收峰，碱性处理时出现642 nm的吸收峰。酸、碱处理后CP43及CP47中绝大部分色素仍然结合在脱辅基蛋白上, 吸收光谱的变化源于结合态的色素而非游离色素。酸性条件下Chl a受到破坏变为Pheo a 使CP43及CP47失绿, 但Pheo a仍牢固地结合在脱辅基蛋白上，使CP43及CP47出现Pheo a的吸收峰。碱性条件下虽然绝大部分色素也结合在脱辅基蛋白上，但色素与蛋白之间的亲和力减弱，使其在进行PAGE电泳时从蛋白质上脱落。碱性条件下642 nm吸收峰的出现是OH- 与Chl a之间相互作用的结果，它需要蛋白质次级结构的变化，当蛋白质次级结构保持完整时或Chl a 分子被尿素分子包围时这种作用受到抑制。碱性条件下CP43及CP47中642 nm吸收峰的出现取决于Chl a与OH- 的相对量，同样在进行PAGE电泳时CP43中Chl a与脱辅基蛋白的分离也取决于Chl a与OH- 的相对量。 2），CP43中β-Car与Chl a之间的能量传递易于受碱的干扰，而在CP47中易于受酸的干扰。酸对CP43和CP47蛋白质次级结构的影响远小于碱的影响。酸和碱都显著地影响了Chl a分子所处的微环境并干扰了Chl a分子之间的激子相互作用。 3), 酸和碱以不同的方式影响CP43和CP47的光吸收、能量传递及蛋白质的次级结构。H+ 可以在不破坏蛋白质次级结构的情况下渗透到色素蛋白内部与Chl a反应而产生Pheo a，同时使β-Car和Chl a (或Pheo a) 之间的相对位置发生变化, 它们之间的能量传递受到干扰。OH- 首先破坏CP43和CP47中的氢键, 引起蛋白质解折叠, 使屏蔽在蛋白质内部的Chl a 暴露，进而与暴露的Chl a作用而将其皂化为叶绿素酸酯。随着蛋白质的去折叠, 其远紫外CD活性丧失, 色素所处的微环境受到干扰, β-Car和Chl a (或Chl a酸酯) 之间的相对位置发生改变, 因此β-Car和Chl a ( 或Chl a酸酯) 之间的能量传递也受到干扰。 4),酸或碱处理使CP43和CP47中Chl a 在进行HPLC时洗脱时间和洗脱峰面积发生改变, 但β-Car洗脱时间和洗脱峰的面积相对稳定。意味着酸碱处理并不破坏CP43及CP47中的β-Car。 2.强光照射对CP43结构和功能的影响 强光(1000 μmol E./m2.s)可以引起CP43中Chl a的漂白及蛋白质的降解，这种作用明显地被连二亚硫酸钠抑制。同样条件下,β-Car 的光吸收几乎不受光破坏的影响。 3.高温处理对CP43、CP47及其它PSII亚基降解的影响 用从菠菜叶片中分离出的PSII、OECC(放氧核心复合体)、去除33 kDa的OECC、RC-CP47(结合有CP47的反应中心复合体)、RC(反应中心复合体)、CP43及CP47等多亚基或单亚基色素蛋白复合体，研究这些复合体中各蛋白亚基在高温时的降解情况。结果发现PSII各蛋白亚基降解对温度的敏感性显著不同： CP43、D2、CP29、LHCII >D1、CP47 >> PsbO、PsbP、PsbQ及Cytb559 (α亚基)。

高温和衰老对光合膜结构与功能影响的研究

本部分研究以菠菜和水稻为材料，比较系统的研究了高温对类囊体膜、PSII颗粒、PSII外周捕光天线LHCII、PSII核心复合物和PSII反应中心等不同层次膜蛋白结构与功能的影响，以探讨高温对光合膜蛋白的伤害机理。其主要结果如下： 1．类囊体膜结构与功能的完整性对于维持PSII的结构与功能在高温胁迫下的稳定性具有重要作用。当类囊体膜的完整性受到破坏，当与PSI有关的一系列保护机制失去作用时，PSII对高温胁迫的敏感性会大大加强。 2．虽然PSI的功能在高温下保持相对稳定，但PSI的结构在高温胁迫下并不稳定。本文的研究发现LHCI对高温非常敏感，在中度高温胁迫下就开始降解，但PSI的核心在高温下比较稳定，所以PSI介导的电子传递活性仍然维持在较高水平。 3．高温胁迫会对PSII的结构和功能产生多重破坏。这个过程首先应该是放氧复合体的失活：其次是反应中心的可逆失活;接下来可能是核心天线CP43和CP47的失活导致捕光天线同反应中心的能量传递受阻;再下来是QA到QR电子传递的受阻、反应中心的不可逆失活、捕光效率下降等过程;最后是大范围色素蛋白的变性和失活，PSII的结构和功能遭到彻底破坏。 4．高湿胁迫下Fo显著升高，Fo的升高的原因可能源于少量捕光天线同反应中心的分离和反应中心的失活。 5．高等植物体的类囊体膜中存在多种Chla和Chlb的光谱吸收形式。这些代表不同的光谱吸收形式的组分在高温胁迫下表现出不同程度的降解，其中C678 和C684组分降解最快。这些不同的光谱吸收形式组分可能以不同的比例存在于每一种色素蛋白复合物中。 6．LHCII的结构与功能对于维持PSII结构与功能的热稳定性具有重要作用，LHCII完全缺失的水稻突变体VG28及分离纯化的PSII核心复介物都人大增强了对高温的敏感性。但一种LHCII减少的水稻突变体249-Mutant,反而增加了PSII的热稳定性，进一步的研究表明，类囊体膜中 LHCII本身含量的多少对PSII热稳定性的影响不足决定性的，关键性因素可能主要取决于 LHCII含量改变而引起的膜脂组成和膜脂不饱和程度的改变，以及由膜脂变化引起的PSII放氧复合体结构与功能的变化。 7．本研究首次发现，高温可以促使分离纯化的LHCII的红区吸收光谱发生显著红移，而680nm处的荧光发射降低，长波长荧光组分大大增强。绿胶电泳表明中度高温胁迫能够诱导LHCII产生寡聚体，这种寡聚体可能在调节能量耗散方面具有重要生理意义：而严重高温胁迫下LHCII倾向于聚合产生大分子的非活性聚集体。 8．分离纯化的反应中心对高温非常敏感，各种色素的结构和功能在轻度高温胁迫下就开始受到破坏和抑制，各种色素变性和降解的顺序由快到慢是：P680>Pheo>Chla>β-Car。反应中心的多肽组分在高温胁迫下显著减少，Dl和D2减少的原因可能归因于高温胁迫导致大分子聚合物的产生，D2的减少显著快于D1的减少。

光系统Ⅱ放氧复合物的光组装研究

光合水氧化是地球上最重要的生化过程之一。这个过程是在位于类囊体囊腔侧的放氧复合物中完成的。光系统II中的锰簇催化中心在四个连续的氧化还原反应作用下将水裂解为四个质子和氧气。水氧化的催化中心含有四个锰、一个钙离子、一至两个氯离子和一个具氧化还原活性的YZ(D1-Y161)。在光系统II的功能性组装过程中，氧合催化中心的形成是在一个被称作光组装的作用下完成的。光组装是无机锰、钙、氯离子与光系统II蛋白结合并在光驱动下氧化形成功能性放氧中心的过程。到目前为止，放氧复合物(OEC)的结构及水氧化的机理仍不清楚，光组装的研究工作对于阐明放氧复合物的结构与功能具有重要的理论和实际意义。 本论文研究了一系列具有不同配位环璄的锰化合物与去锰的PSII的光组装过程， 同时研究了稀土离子LaCl3和TbCl3及重金属离子Co2＋和Ni2＋对PSII 放氧活性及光组装的影响。主要结果如下： 1. 选择了咪唑氮配位的锰化合物和非咪唑氮配位的锰化合物与去锰的PSII 颗粒进行重组, 发现化合物中锰的配位结构与其恢复电子传递能力和放氧活性之间有一定关系。 研究结果表明，锰中心为锰-咪唑氮连接的化合物能够有效地恢复去锰PSII的电子传递能力和放氧活性;而非咪唑氮配位的锰化合物恢复电子传递和放氧活性的能力都相应较低甚至没有，由此推测，咪唑氮为放氧中心锰簇的一个配体。 2. 选择了两个不同价态的二核锰化合物和一个带氧桥的三核锰化合物与去锰的PSII 颗粒进行重组。 研究结果表明，三核锰化合物表现出比另外两个二核锰化合物更强的恢复放氧活性的能力，但其作为电子供体的能力比另外两个化合物要差。由此可推测，影响锰化合物恢复电子传递和放氧活性效率的因素是不同的。另外, 三核锰化合物在重组过程中对CaCl2非常敏感，我们推测锰化合物中的羧基与Ca2+之间存在相互作用，而这种作用有助于锰的配位进而促进光组装。三个化合物重组放氧复合物能力的大小顺序为：Mn3(III)锰化合物>Mn(III)Mn(III)锰化合物> Mn(III)Mn(IV)锰化合物。 3. 研究了LaCl3、 TbCl3 对光系统II放氧复合物光组装的影响。研究表明，在光组装过程中，两种稀土离子La3+和Tb3+对光系统II的光组装有很强的抑制作用，这种作用很大程度上依赖于Ca2+的存在，两种稀土离子在Ca2+结合位点是一个混合型竞争抑制剂。 另外，在10 mmol/L Ca2+存在时，抑制50%的光组装活性所需的稀土离子浓度比抑制50%功能性PSII的放氧活性所需的稀土离子浓度小约10倍，这对理解稀土离子对光合作用的影响具有重要的理论意义。 4．本文研究了Ni2＋和Co2＋两种金属离子对光系统II膜蛋白复合体结构与功能的影响。结果表明，毫摩尔级Ni2＋和Co2＋可以使完整的光系统II和去除17 kDa、23 kDa外周蛋白的光系统II的放氧活性被一定程度地抑制，而且对后者的抑制作用更强，在上述两种情况下，CaCl2可使抑制作用减轻。两种金属离子对给体侧的完整性有一定影响：5 mmol/L金属离子存在的时，可使17 kDa蛋白解离，10 mmol/L的金属离子存在时可使17 kDa、 23 kDa蛋白解离。两种金属离子在光组装过程中对Mn、Ca的组装无明显的影响。

LPA3蛋白参与调控PSII组装的功能研究

PSII是一个叶绿体类囊体膜的蛋白复合体，它由20多个蛋白亚基组成，这些蛋白由核基因和叶绿体基因共同编码。由于PSII结构的复杂性，PSII的组装是多步骤的，并得到辅因子和调控蛋白的协助。但我们对参与调控步骤的蛋白因子还了解不多。鉴于叶绿体有限的编码能力，推测参与叶绿体组装调控的因子主要是由核基因来编码的。辨定这些核编码的叶绿体蛋白并深入研究其作用的分子机制将有助于我们了解PSII生物发生的分子机理。为此，我们利用叶绿素荧光成像系统对pER16 T-DNA插入突变体库进行了筛选，并对高荧光突变体lpa3进行了研究。主要研究结果如下： 突变体lpa3生长较为缓慢，叶色黄绿，叶绿素含量低。在突变体中，最大荧光量子产率Fv/Fm降低到0.514，表明PSII光合功能受到了损伤。突变体lpa3叶绿素荧光慢诱导曲线的正常下降表明PSII后的电子传递正常。突变体P700氧化还原动力学与野生型一致，则进一步表明PSI在突变体中是具有功能的。77K发射荧光光谱显示PSII的特征峰在突变体中较高，而PSI的特征荧光峰没有变化，则进一步显示突变体lpa3是一个PSII突变体。 通过Tail-PCR，发现突变体中T-DNA插入导致基因lpa3缺失表达，并且lpa3基因的互补可以使突变体的性状得到恢复。该基因表达的蛋白LPA3含有一个跨膜区域，是一个类囊体膜蛋白。该蛋白不是PSII的蛋白组成成分，可能与自身或者其它的蛋白组成一个复合体而起作用。 在突变体lpa3中PSII蛋白质尤其是核心蛋白D1、D2，含量下降。并且突变体中PSII蛋白复合体含量下降。但是突变体中PSII基因的表达并没有在转录水平受到调节，并且蛋白D1和D2的翻译起始也没有受到影响。体外标记实验表明，PSII中D1蛋白的合成明显降低，而其它蛋白的合成没有改变。进一步实验表明，突变体中PSII的组装效率降低。推测D1蛋白由于不能有效组装而反馈调节自身的合成。 酵母双杂交实验表明LPA3蛋白可以与D1蛋白相互作用，并且也与参与PSII组装的蛋白Alb3相互作用。因此，LPA3蛋白可能和蛋白Alb3形成一个复合体，该复合体与D1蛋白直接相互作用而参与调控PSII的组装。

LPA2蛋白调控PSII组装的分子机理研究

光系统II（PSII）是叶绿体类囊体膜上电子传递链中第一个色素蛋白复合体，由20多个蛋白亚基组成。它催化光驱动的水的裂解和醌的氧化。由于其结构的复杂性，PSII的生物发生和组装是核基因与叶绿体基因编码的蛋白以一定次序多步骤合成、组装的复杂过程，并需要大量的核基因编码的调节组装因子的参与。分离、鉴定拟南芥中这些核基因编码的叶绿体蛋白并研究它们的作用机制有助于我们认识高等植物PSII复合物组装和功能调控的分子机理。因此，我们从T-DNA插入的拟南芥突变体库中筛选到PSII突变体lpa2（low photosystemII accumulation），对LPA2蛋白调控光系统II复合物组装的功能进行了研究，并进一步探讨了LPA2和其他调节因子协同作用参与PSII组装的模式。 突变体lpa2具有高叶绿素荧光表型，与野生型相比生长量、色素含量均显著降低。蛋白免疫印记发现在lpa2突变体中光系统II复合物的累积量明显降低，仅有野生型的30%左右，而其他复合物的含量变化不大。核酸杂交和与多聚核糖体结合的检测表明光系统II亚基在转录及翻译启始水平没有受到影响。拟南芥叶片蛋白标记实验证明在突变体中CP43的合成量明显降低而其他光系统II主要蛋白CP47, D1 和 D2的合成正常，但相对于野生型这些蛋白的周转速率加快。在突变体中，新合成的蛋白亚基可以组装进入光系统II复合物，但新合成的CP43蛋白组装效率降低。以上的结果表明LPA2对光系统II的正常组装起着重要的作用，LPA2的缺失导致CP43不能有效组装进入光系统II，从而引起其他核心蛋白周转加快，光系统 II复合物累积量降低，最终植株光合效率降低。 基因克隆和蛋白定位分析表明LPA2基因编码一个内在的类囊体膜蛋白，但并不是光系统II的亚基组分。进一步采用酵母双杂分析证实了LPA2蛋白与光系统II核心蛋白CP43有相互作用，而与中心蛋白D1和D2没有相互作用。此外实验还表明LPA2蛋白与参与类囊体膜生物发生有关的Alb3蛋白有相互作用。因此LPA2可能是与Alb3形成复合物来协助CP43有效的整合进入光系统II。 另外，我们实验室已鉴定，LPA3，LPA4也是分别特异地参与CP43和D1组装的光系统II分子伴侣。LPA2，LPA3基因共同缺失会使幼苗不能光合自养而致死，因而LPA2和LPA3共同相互作用促进CP43的组装。体内和体外实验证明LPA2，LPA3和LPA4都和Alb3相互作用，而参与D1组装的分子伴侣LPA1不和Alb3以及上述这些伴侣因子作用。因此，Alb3 很有可能与LPA2、LPA3和LPA4形成多蛋白复合物在D1蛋白合成之后的组装过程中起作用。这些结果表明光系统II多亚基复合物组装是多步骤的，并通过一个精确复杂的调控网络确保复合物的有效组装以及功能行使。

拟南芥光系统复合物组装调控因子的功能研究

光系统I与光系统II ( PSI和PSII ) 是由核基因与叶绿体基因共同编码的蛋白组成的多亚基色素蛋白复合体，其复合物组装过程中蛋白以一定地次序合成并组装。现有研究表明光合膜多亚基复合物形成的每一个过程都需要一个或多个调节因子的参与。发现这些调节因子，并研究它们的作用机制将有助于我们认识高等植物两个光系统复合物组装和功能调控的分子机理。因此，我们采用正向遗传学和反向遗传学方法去寻找这些调控因子。我们一方面应用Gateway技术构建拟南芥cDNA表达文库，采用酵母双杂交技术从中筛选与Alb3互作的蛋白，称为ALIP ( Albino3 Interacting Protein )；从ABRC订购编码这些互作蛋白的基因的T-DNA插入突变株系，其中发现了一个影响PSI功能的突变体alip1；另一方面，通过对拟南芥T-DNA插入突变体库进行筛选，发现了一批影响PSII功能的突变体 ( low photosystem II accumulation )，其中包括lpa1、lpa2和lpa66-1。本实验对alip1和lpa66-1突变体进行了深入研究，初步探讨了这两个基因编码的蛋白参与调控PSI以及PSII的组装机理。 突变体lpa66-1是一个高叶绿素荧光突变体，与野生型比较生长缓慢，叶色黄，叶绿素含量低。叶绿素荧光慢诱导曲线显示它是一个影响PSII功能的突变体。类囊体膜蛋白的免疫印迹发现lpa66-1突变体中PSII复合物的累积量降低到野生型的30%左右，其他复合物的含量变化不大。体内蛋白标记实验显示，PSII反应中心蛋白D1，D2的合成速率下降，PSII核心蛋白的周转加快。新合成的蛋白组装进PSII的效率比野生型显著降低。LPA66是一个定位于叶绿体的PPR蛋白。因为野生型拟南芥LPA66蛋白能够特异性的编辑psbF转录本，故野生型psbF转录本中第77C被编辑为77U，从而使相应的氨基酸序列中第26个氨基酸丝氨酸被编辑为苯丙氨酸，而lpa66-1突变体中，LPA66蛋白的缺失导致该位点不能被编辑，PSII复合体也不能有效组装。 Alb3/Oxa1p/YidC蛋白家族广泛的参与蛋白质转运和多亚基复合物组装，采用分裂泛素化酵母双杂交发现与Alb3相互作用蛋白ALIP1。突变体alip1也是一个高叶绿素荧光突变体，叶色黄，在土里生长极为缓慢，且不能开花，不育。叶绿素荧光慢诱导曲线显示，突变体中PSII功能基本没有受影响；而P700显示alip1是一个影响PSI功能的突变体。类囊体膜蛋白的免疫印迹发现突变体中PSI核心蛋白PsaA/B的累积量为野生型的40%左右，而PSII及其他复合物的含量无明显变化。Northern印迹结果显示PsaA/B在转录水平不受影响，而体内蛋白标记实验显示，PSI反应中心蛋白PsaA/B的合成速度下降。蔗糖密度梯度离心分析类囊体膜蛋白的组分显示ALIP1能够与Alb3共迁移。而Alb3对于类囊体膜上大分子复合体的组装有重要作用，我们推测，ALIP1可能与Alb3形成一个复合物，或者作为一个中间体介导Alb3参与PSI的组装。

Karyotype Differentiation in Newly Discovered Members of the Drosophila obscura Species Group from Yunnan , China

观察了新近发现于我国云南的果蝇属暗果蝇种组( Drosophila obscura species group ) 种类 D1luguensis 、D1 dianensis 和D1limingi 的有丝分裂中期核型, 并将3 个种的核型与各自的近缘种类进行了比较。 D1luguensis 具2n = 12 条染色体, 包括3 对中央着丝粒(V 形) 染色体、2 对近端着丝粒(棒状) 染色体以及1 对微小(点状) 染色体。其中X 和Y染色体均为中央着丝粒染色体。D1 dianensis 和D1limingi 具2n = 10 条染 色体, 包括1 对大的V 形常染色体, 1 对小的V 形常染色体, 2 对J 形(亚中着丝粒型) 常染色体和1 对点状染 色体。其中X 染色体为J 形, Y染色体为短棒状。基于核型比较的结果以及D1sinobscura 亚组地理分布的资料, 结合种间系统发育关系研究结果, 认为D1 luguensis 可能保留了该亚组祖先种类的核型。D1sinobscura 的核型(2n = 12 : 2V , 1J , 2R , 1D) 可能由一个pre2“sinobscura2hubeiensis”谱系的一个分支通过臂间倒位演化而来, 而D1 hubeiensis 的核型(2n = 10 : 4V , 1D) 可能由该谱系的另一分支通过着丝粒融合(2 对近端着丝粒常染色 体的融合) 而形成。推测在D1 dianensis 和近缘欧洲种D1subsilvestris (2n = 12 : 3V , 2R , 1D) 间、D1limingi 和 东亚近缘种D1tsukubaensis (2n = 12 : 3V , 2R , 1D) 间的物种分化过程中, 可能有相似的染色体变异类型发生。

饲料中豆粕替代鱼粉蛋白对异育银鲫生长、代谢及免疫功能的影响

本实验评价了饲料中豆粕替代鱼粉蛋白后对异育银鲫的生长、饲料利用、氮代谢和鱼体免疫力等的影响。实验设计4种等氮等能的饲料,每种3个重复,分别以豆粕替代饲料中鱼粉蛋白的0(对照,D1)、20%(D2)、80%(D3)和100%(D4)。实验在半循环水养殖系统持续16周,鱼的初重约2.32g,实验期间水温23—30℃。结果表明,随着饲料中豆粕含量的升高,摄食率显著升高(p<0.05),特定生长率、饲料转化效率、蛋白沉积率和能量沉积率显著降低(p<0.05);蛋白表观消化率显著升高,干物质和能量表观消化率则显著降

Solar UV radiation drives CO2 fixation in marine phytoplankton: A double-edged sword

Photosynthesis by phytoplankton cells in aquatic environments contributes to more than 40% of the global primary production (Behrenfeld et al., 2006). Within the euphotic zone (down to 1% of surface photosynthetically active radiation [PAR]), cells are exposed not only to PAR (400-700 nm) but also to UV radiation (UVR; 280-400 nm) that can penetrate to considerable depths (Hargreaves, 2003). In contrast to PAR, which is energizing to photosynthesis, UVR is usually regarded as a stressor (Hader, 2003) and suggested to affect CO2-concentrating mechanisms in phytoplankton (Beardall et al., 2002). Solar UVR is known to reduce photosynthetic rates (Steemann Nielsen, 1964; Helbling et al., 2003), and damage cellular components such as D1 proteins (Sass et al., 1997) and DNA molecules (Buma et al., 2003). It can also decrease the growth (Villafane et al., 2003) and alter the rate of nutrient uptake (Fauchot et al., 2000) and the fatty acid composition (Goes et al., 1994) of phytoplankton. Recently, it has been found that natural levels of UVR can alter the morphology of the cyanobacterium Arthrospira (Spirulina) platensis (Wu et al., 2005b). On the other hand, positive effects of UVR, especially of UV- A (315-400 nm), have also been reported. UV- A enhances carbon fixation of phytoplankton under reduced (Nilawati et al., 1997; Barbieri et al., 2002) or fast-fluctuating (Helbling et al., 2003) solar irradiance and allows photorepair of UV- B-induced DNA damage (Buma et al., 2003). Furthermore, the presence of UV-A resulted in higher biomass production of A. platensis as compared to that under PAR alone (Wu et al., 2005a). Energy of UVR absorbed by the diatom Pseudo-nitzschia multiseries was found to cause fluorescence (Orellana et al., 2004). In addition, fluorescent pigments in corals and their algal symbiont are known to absorb UVR and play positive roles for the symbiotic photosynthesis and photoprotection (Schlichter et al., 1986; Salih et al., 2000). However, despite the positive effects that solar UVR may have on aquatic photosynthetic organisms, there is no direct evidence to what extent and howUVR per se is utilized by phytoplankton. In addition, estimations of aquatic biological production have been carried out in incubations considering only PAR (i. e. using UV-opaque vials made of glass or polycarbonate; Donk et al., 2001) without UVR being considered (Hein and Sand-Jensen, 1997; Schippers and Lurling, 2004). Here, we have found that UVR can act as an additional source of energy for photosynthesis in tropical marine phytoplankton, though it occasionally causes photoinhibition at high PAR levels. While UVR is usually thought of as damaging, our results indicate that UVR can enhance primary production of phytoplankton. Therefore, oceanic carbon fixation estimates may be underestimated by a large percentage if UVR is not taken into account.

Residual donors and compensation in metalorganic chemical vapor deposition as-grown n-GaN

In our recent report, [Xu , Appl. Phys. Lett. 76, 152 (2000)], profile distributions of five elements in the GaN/sapphire system have been obtained using secondary ion-mass spectroscopy. The results suggested that a thin degenerate n(+) layer at the interface is the main source of the n-type conductivity for the whole film. The further studies in this article show that this n(+) conductivity is not only from the contribution of nitride-site oxygen (O-N), but also from the gallium-site silicon (Si-Ga) donors, with activation energies 2 meV (for O-N) and 42 meV (for Si-Ga), respectively. On the other hand, Al incorporated on the Ga sublattice reduces the concentration of compensating Ga-vacancy acceptors. The two-donor two-layer conduction, including Hall carrier concentration and mobility, has been modeled by separating the GaN film into a thin interface layer and a main bulk layer of the GaN film. The bulk layer conductivity is to be found mainly from a near-surface thin layer and is temperature dependent. Si-Ga and O-N should also be shallow donors and V-Ga-O or V-Ga-Al should be compensation sites in the bulk layer. The best fits for the Hall mobility and the Hall concentration in the bulk layer were obtained by taking the acceptor concentration N-A=1.8x10(17) cm(-3), the second donor concentration N-D2=1.0x10(18) cm(-3), and the compensation ratio C=N-A/N-D1=0.6, which is consistent with Rode's theory. Saturation of carriers and the low value of carrier mobility at low temperature can also be well explained. (C) 2001 American Institute of Physics.

钙钛矿过渡金属氧化物电、磁性质的理论研究

钙钛矿过渡金属氧化物已有大量实验和理论研究。本论文采用一般梯度近似（GGA）和GGA+U（U表示原位的库仑相互作用）下的第一性原理密度函数方法研究了双层，四层和含氧空位的钙钛矿过渡金属氧化物的晶体结构、电子结构以及电、磁性质。 从对双层钙钛矿Sr2FeMoO6和Sr2CoMoO6的研究，我们发现Sr2FeMoO6的四方相比立方相稳定，而且两种结构下它都显半金属特性；对于Sr2CoMoO6，原位的库仑相互作用决定了它的半导体性质。此外，我们还研究了实验上备受争议的Ba2YIrO6和Ba2LaIrO6在立方 Fm-3m, 菱形 R-3和单斜 P21/n三种结构下的相对稳定性。结果表明第一性原理与半经验的键价模型得到的结论相同，即Ba2YIrO6和Ba2LaIrO6的最稳定结构分别是单斜 P21/n和菱形R-3。 不同Mn-O-Mn角度下YBaMn2O5的电子结构和磁结构的计算结果表明，当Mn-O-Mn 角度处于实验所测的157.8o时，G-型反铁磁结构比A-型稳定，与实验结果相符。随着角度的增加，大约在170出现了磁结构转变。当角度大于170时，A型反铁磁结构比G型稳定，即YBaMn2O5从G型过渡到A型。此外，我们还研究了YBaMn2O5在不同磁结构以及不同角度下的导电性。 通过对四层钙钛矿化合物CaCu3M4O12 （M是3d过渡金属离子：Ti, V, Cr, Mn, Fe, Co）的能带结构计算研究了M离子的电子构型对其磁结构和导电性的影响。结果表明随着M电子数的增加，该系列化合物磁结构为：在CaCu3Ti4O12（Ti4+：d0）中Cu-Cu为反铁磁性耦合，即该物质为反铁磁体；在CaCu3M4O12 (M= V4+：d1, Cr4+：d2, Mn4+：d3, Fe4+：d4；dn，0

氧络铬卟啉配合物的合成结构及其氧化活性研究

本文选择不同配体（苯酚类和迭氮）通过Cr(III)(TPP)Cl (Al)的氧化还原取代，分别合成了四个新的铬（III）卟啉配合物，Cr(TPP)N_3P_Y(B_1), P-O_2NC_6H_4OCr(TPP)·THF (C1), P-CH_3OCoH_4OCr(TPP)·THF (D1), Cr(TPP)OC_6H_5·THF (E1)。通过元素分析，红外光谱、~1H NMR、ESR、MS和UV-Vis等分析、表征，确认了以上四种化合物。B1单晶进行了X－射线分析，得其晶体结构和分子结构，从而进一步证实了B1的组成。在CH_2Cl_2或C_6H_6中，氮气保护下，用PhIO直接氧化以上五种铬（III）卟啉配合物，合成并分离出了相应的高价氧络铬卟啉配合物，(PhI) O=Cr(▽)(TPP)Cl (A2), (PhI) O=Cr(▽)(TPP)N_3, (B2), P-O_2NC_6H_4O Cr(▽)(TPP) (1/2IPh) (C2), P-CH_3OC_6H_4O Cr(▽)(TPP) (1/2IPh) (D2), PhIO- Cr(IV)(TPP) (OC_6H_5)·P_Y (E2)。通过研究其元素组成，IR、UV－Vis、ESR、MS等分析，确定了以上五种化合物的组成。基中PhI和P_Y分子的位置尚无法确定。这两类高价氧络铬卟啉，是继右淑珍等第一次得到P450模型化合物的活性中间体－氧络铬（▽）四苯基卟啉对硝基苯甲酸配合物后，又一次得到的苯酸类和迭氮氧络铬卟啉配合物。不同的是，氧络铬（▽）卟啉配合物中都各有PhI分子，化合物E2是第一次得到的关键氧络铬（IV）卟啉配合物，类似于PhIO－Mn~(IV)(TPP)(P-H_2N C_6H_4 CO_2)。高价氧络铬卟啉配合物不稳定，室温下分解，暴露在空气中同时发生分解和还原。不过低温下比较稳定。在CH_2Cl_2或C_6H_6中，我们研究了上述五种氧络铬及Cr(TPP)ClPhIO对碳氢化合物和DNA碱基的氧化反应。不同摩尔比的PhIO-Cr(TPP)Cl对环已烷的氧化给出相同的产物，但转化率和产物分布不同。Al-PhIO和C_2-PhIO体内对碱基胞嘧啶，胸腺嘧啶，腺嘌呤的氧化反应呈阳性，氧化产物中都有尿素CO(NH_2)_2，其中胸腺嘧啶的氧化产物中含有CH_3CO-或CH_3CHOH。这说明氧络铬卟啉配合物能够氧化DNA碱基。氧络铬卟啉具有较高的氧化活性和立体选择性。比较不同轴向配体的氧络铬卟啉的氧化活性，其大小次序正好与其轴向配体的配位能力次序一致。这是由于轴向配体的给电子能力越强，通过中心离子铬向其周围转移的电荷就越多，导致氧络键的强度减弱，即其活性增加。上述研究结果表明，铬（III）卟啉配合物是P－450的较好的模型化合物，氧络铬卟啉配合物是其活性中间体。同时该研究结果支持了Groves等提出的定居卟啉配合物催化氧化机理。