131 resultados para PCR-DGGE
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以武汉龙王嘴污水处理系统为研究对象,揭示了污水处理各阶段中浮游生物群落的DNA指纹拓扑结构,进而探索了其与浮游生物群落结构和环境理化因子的关系.首先建立了污水处理系统中浮游生物群落总DNA提取方法,然后用原核与真核特异性引物对流程(A2/O氧化沟工艺)中不同阶段的浮游生物群落总DNA进行PCR扩增,用变性梯度凝胶电泳(DGGE)检测,并对平行水样分别进行常规理化因子和浮游生物物种的检测与鉴定.结果显示,各采样点理化因子、物种组成与浮游生物DNA指纹的统计分析结果十分吻合,厌氧、缺氧和好氧阶段间差异较小,进
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Using artificial systems to simulate natural lake environments with cyanobacterial blooms, we investigated plankton community succession by polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE) fingerprinting and morphological method. With this approach, we explored potential ecological effects of a newly developed cyanobacterial blooms removal method using chitosan-modified soils. Results of PCR-DGGE and morphological identification showed that plankton communities in the four test systems were nearly identical at the beginning of the experiment. After applying the newly developed and standard removal methods, there was a shift in community composition, but neither chemical conditions nor plankton succession were significantly affected by the cyanobacteria removal process. The planted Vallisneria natans successfully recovered after cyanobacteria removal, whereas that in the box without removal process did not. Additionally, canonical correspondence analysis indicated that other than for zooplankton abundance, total phosphorus was the most important environmental predictor of planktonic composition. The present study and others suggest that dealing with cyanobacteria removal using chitosan-modified soils can play an important role in controlling cyanobacterial blooms in eutrophicated freshwater systems.
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Genetic diversity of the plankton community in Lake Xiliang was depicted by polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE) fingerprinting. Seventy-seven bands (33 of 16S rDNA and 44 of 18S rDNA) were detected, sixty-two planktonic taxa were identified in six sample stations in November 2007. The most common taxa were Ceratium hirundinella, Bdelloidea, Keratella cochlearis, Polyarthra trigla, and copepod nauplii. Based on environmental factors, taxonomic composition, and PCR-DGGE fingerprinting, unweighted pair-group method using arithmetic averages clustering and principal components analysis were used to analyze habitat similarities. There was distinct spatial heterogeneity in Lake Xiliang, and the genetic diversity of the plankton community was closely related to taxonomic composition and environmental factors.
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维生素C生产废水有机物浓度高、成分复杂、排放量大,是一种亟待处理的典型工业废水。本研究分别采用实验室规模和中试规模的升流式厌氧颗粒污泥床反应器(UASB)对该制药工业废水的厌氧生物处理工艺进行了较为深入的研究。同时采用两种不依赖于纯培养的分子生物学手段—变性梯度凝胶电泳(DGGE)和扩增核糖体DNA限制性分析(ARDRA)技术揭示了UASB反应器不同运行阶段污泥中微生物群落多样性组成及变化。此外,首次研究了零价铁(Fe0)在厌氧消化过程中对反应器运行及微生物群落结构的影响。 采用城市污水处理厂厌氧消化池絮状污泥和处理啤酒废水的颗粒污泥混合接种,小试中温(35±1℃)UASB反应器在其运行的第65天启动成功。反应器稳定运行阶段,在进水COD浓度为9000mg/L、水力停留时间为12h、容积负荷为13.6 kgCOD/m3.d条件下,其COD去除率稳定在85~90%之间,沼气产率达到4.5 m3/m3.d,沼气甲烷含量平均为72%。中试UASB反应器的接种污泥为厌氧消化污泥,其启动时间相对较长,为90天。在稳定运行期,反应器的进水COD浓度为8000~10000mg/L,水力停留时间和容积负荷分别保持在12~16h和10.6~14.2 kgCOD/m3.d范围,该阶段反应器的平均COD去除率稳定在85%左右,沼气产率平均为5.2m3/m3.d,沼气中甲烷含量为69%。上述结果表明中温UASB工艺用于维生素C生产废水处理是高效、可行的。 与对照反应器相比,添加Fe0的小试UASB反应器的COD去除率和沼气产量分别提高了6.5%和10.2%。同时,磷酸盐平均去除率为79%,比对照提高了64%,目前尚未见类似研究报道。在中试规模的UASB反应器中补充一定量的Fe0可缩短反应器启动时间,促进颗粒污泥的形成,该结果可能具有重要的应用价值。培养试验进一步表明,Fe0可以作为产甲烷菌还原CO2生成甲烷的电子供体。培养实验还表明,当系统中存在硝酸盐(0.40 mM)和硫酸盐(0.26 mM)时,Fe0促产甲烷过程受到一定程度的抑制。 采用细菌通用引物968F/1401R和341F/907R获得的PCR-DGGE指纹图谱均表明UASB反应器不同运行阶段细菌种群结构变化明显。小试和中试稳定期污泥的微生物多样性均高于各自初始接种污泥。产甲烷菌通用引物340F/519R的PCR-DGGE结果显示,虽然接种污泥中产甲烷菌的丰富度系数略低于稳定期,但总体而言,反应器运行期间产甲烷菌的种群组成相对稳定。 通过构建不同处理和不同运行阶段污泥样品的16S rRNA基因文库并对克隆基因进行限制性内切酶消化、测序分析。结果表明,稳定期两个反应器微生物群落结构相似,但与各自接种污泥差异明显。小试UASB反应器接种污泥中细菌的优势菌群分别为变形菌纲的δ亚纲(28.7%)和β亚纲(17.4%),至稳定运行期则演替为革兰氏阳性低GC菌群(21.9%)和变形菌纲的δ亚纲(14.0%)。中试反应器接种污泥Green non-sulfer bacteria(25.9%)和变形菌纲的δ亚纲(16.4%)类群占优势,而稳定期Green non-sulfer bacteria类群(17.9%)、革兰氏阳性低GC菌群(16.2%)和变形菌纲的δ亚纲(15.4%)为优势菌群。 产甲烷菌的优势克隆为SRJ 230、SRJ 26和SRJ 583,前两者分别与Methanosaeta concilii和未培养的Methanobacteria-like克隆Gran7M4的同源性达到97%和98%,后者与Methanomethylovorans. sp同源性为99%。接种污泥中上述类群占总克隆数量的比例较低。小试、中试接种污泥中产甲烷菌分别占7.8%和3.0%,但稳定运行期,该比例明显增加,分别达到21.9%和18.8%。上述结果表明启动期与稳定期污泥产甲烷菌种群组成相对稳定,但各类群数量明显增加。 添加Fe0的UASB反应器稳定运行期污泥中产甲烷菌比例(31.2%)高于对照反应器(24.2%), 革兰氏阳性低GC类群、变形菌纲的δ亚纲比例差异不明显,而变形菌纲β亚纲(6.0%)和Green non-sulfer bacteria(9.2%)的比例均分别低于对照反应器(13.1%和17.1%)。该结果表明,添加Fe0使反应器内微生物群落多样性发生了显著变化。 此外,在添加Fe0的UASB反应器中检测到特异性的克隆SRJ 341和SRJ 320,两者分别同磷酸盐去除和铁氧化有关的克隆子Orbal D41和Clone195的序列相似性达95%和96%。这两个类群可能分别与磷酸盐去除及铁促产甲烷作用密切相关。这一结果尚未见报道。
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针对辽河油田锦采污水处理厂稠油废水,利用传统培养方法和PCR-DGGE诊断技术,对稠油废水处理过程中优势微生物种群组成和多样性进行全面系统的研究。结果表明,微生物对稠油废水生物处理的作用为细菌>真菌>放线菌。细菌数量、基因多样性指数与废水中TPH、CODCr均正相关,可以作为稠油废水水质评价的生物指标。 对影响稠油废水生物降解的主要因子进行优化表明,当30℃,pH值7.5,HRT为216h,添加N、P营养盐使N:P比为5.63:1时,CODCr去除率最高,去除后CODCr值满足污水综合排放一级标准(GB8978-1996)。利用GC-MS技术分析降解前后稠油废水中主要有机成分表明,微生物对饱和烃类化合物降解率最高,其次是低分子量芳香烃,而高分子量芳香烃、胶质和沥青质最低。 以稠油为唯一碳源,对筛选出的菌株进行摇瓶实验表明,各菌株对稠油均具有一定的降解能力,其中F0504除油能力最强,56d去除率可达63.3%;动力学方程拟合表明稠油生物降解过程符合一级动力学方程。降解后残油组分分析表明,B0505和F0501对烷烃、B0510、F0505和F0507对芳香烃、B0501和F0504对胶质、沥青质的去除率均较高,去除率都在30c%之间。 经鉴定,优势菌株B0501和B0505分别为液化金杆菌(Aureobaterium liquefaciens)和弗氏丙酸杆菌(Propionibacterium freuclenreichii),主要真菌有青霉(Penicillium)、曲霉(Aspergillus)、木霉(Trichoderma)和交链孢霉(Alternaria)。
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本论文以沈阳张士污灌区土壤为例,首次采用传统微生物生态学与现代微生物分子生态学相结合的研究方法系统地研究了污灌区长期重金属污染胁迫下原位农田土壤微生物特征。结果表明,虽然已经停止污灌十多年,张士灌区土壤耕作层(0~30 cm)仍然存在普遍的Cd污染,灌区土壤Cd含量高达1.75~3.89 mg kg-1。部分区域土壤Cd呈现向下迁移的趋势,且同时伴随有Cu、Zn复合污染。灌区土壤Cd含量较高时清水灌溉能降低土壤表层Cd含量,灌区土壤Cd含量下降到一定程度(约2 mg kg-1)后,清水灌溉对消除土壤表层Cd污染的作用消失。重金属元素中Cd对土壤微生物的影响最突出,在三个不同季节中土壤Cd与土壤微生物生物量(MBC)和微生物商(qM)呈显著负相关,与土壤微生物代谢商(qCO2)呈显著正相关。所检测的微生物指标中qM和qCO2与多种重金属元素呈显著相关性,可作为评价一定程度重金属污染的微生物指标。土壤营养元素(除P外)与微生物特征呈显著正相关性,土壤营养元素对微生物的刺激作用有可能在某种程度上掩盖了重金属对土壤微生物的负面影响。 用16S rDNA-PCR-DGGE方法,研究了不同浓度Cd胁迫下土壤Cd抗性细菌群落结构的动态变化,结果表明在Cd的胁迫下Cd抗性细菌多样性显著增加,不同土壤样品中Cd抗性细菌群落结构向相似的方向偏移,群落结构最终将可能趋向一致。Cd胁迫使敏感菌Pontibacter消失,而伯克氏菌(Burkholderia)、罗尔斯通氏菌(Ralstonia)、芽孢杆菌(Bacillus)和节杆菌(Arthrobacter)则富集成为优势菌。 从张士灌区Cd污染土壤中分离出32株Cd抗性细菌,研究了Cd抗性细菌和Cd抗性基因cadA的分布特征。这32株Cd抗性细菌分别归属于拟杆菌门(Bacteroidetes)(37.5%)、变形菌门(Proteobacteria) (37.5%)、放线菌门(Actinobacteria)(9.4%) 和厚壁菌门(Firmicutes)(15.6%)。在液体LB培养基中对Cd的抗性浓度都大于2 mmol L-1,对Zn抗性浓度介于5~13 mmol L-1。首次从Cetobacillus属的Cd抗性菌株S1基因组DNA中扩增出cadA基因的部分片断。在芽孢杆菌属(Bacillus)的4株菌N7,N9,N10和N11的基因组DNA中扩增出cadA基因的部分片断。序列分析结果表明这5株菌的cadA基因序列相似性为99%~93%,它们与坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus) cadA 基因序列(M90750)相似性为94%~92%。系统发育分析结果表明这5株菌的cadA都与Bacillus firmus cadA 基因有着较近的亲缘关系。不同属的Cd抗性细菌间cadA基因的高度相似性揭示了cadA基因能在不同种属间转移的特性。
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本文通过盆栽模拟试验运用PCR-DGGE和形态学分析方法研究了外源添加铜锌对土壤线虫多样性的影响,为应用PCR-DGGE技术开展线虫对重金属污染土壤的生物指示作用研究提供理论依据。 形态分析结果表明:较高浓度的Cu、Zn对土壤线虫的总数、线虫营养类群的数量和多样性指数产生明显的抑制作用,在小麦成熟期表现得最显著。与单一铜、锌污染相比,复合污染对线虫群落结构及多样性的影响更明显。 研究发现,通过PCR-DGGE与形态分类方法得到线虫多样性信息的变化趋势基本一致,且相对于形态学方法,PCR-DGGE方法得到的多样性指数能够比较迅速地反映线虫多样性的变化,具有较高的灵敏度。PCR-DGGE结果的聚类分析能够直观地反映线虫群落结构的变化。PCR-DGGE方法能够在优化样品量和提取方法的条件下获得更多的种属信息,且凝胶条带的峰强度能够反映出该条带基因测序后所对应种属的丰富度,是揭示土壤重金属污染条件下线虫多样性变化的有效工具。
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随着环境污染问题的日益严重,微生物修复起到越来越重要的作用。假单胞菌是土壤微生物中最重要、研究最多的细菌之一,能降解简单和复杂的有机物,它们因此而广泛的存在于土壤和水体。但有关于石油、重金属及农药污染物对农田土壤假单胞菌多样性及种群结构的影响却缺乏全面和系统的认识。 本论文首次采用传统微生物培养方法与PCR-DGGE等现代微生物分子生态学研究方法相结合的手段,系统评价了长期含石油和重金属污水灌溉对中国最大的石油、重金属污灌区——沈抚、张士灌区农田土壤中的假单胞菌多样性及其种群结构的影响。同时,本论文也研究了乙草胺、甲胺磷对黑土假单胞菌多样性及种群结构的影响。得出以下结果: 石油污灌区土壤中总的假单胞菌多样性显著高于重金属污灌区;石油污灌区旱田土壤假单胞菌多样性接近于对照清洁土壤,同时低于相似污染程度的石油污灌区水田土壤。进一步测序发现,Pseudomonas mendocina、Pseudomonas stutzeri、Pseudomonas aeruginosa是所分析石油和重金属污灌区土壤中的优势类群,说明在长期污染胁迫下这3种假单胞菌分别得到了不同程度的富集。DGGE 结果显示石油和重金属污染土壤样品的可培养假单胞菌多样性没有显著差异,但均低于对照清洁土壤样品。对各个土壤样品可培养假单胞菌菌株进行REP-PCR基因分型,结果表明这些假单胞菌之间有显著的遗传差异。进一步测序表明,土壤样品中可培养假单胞菌优势类群中含有Pseudomonas. fluorescens 和Pseudomonas. Putida两种。 黑土农田土壤中使用乙草胺会严重降低总的及可培养假单胞菌群落的多样性,而且在5周内不能恢复。而甲胺磷处理土壤与对照相比则差异不显著,并且经过一段时间的适应,土壤中的总的及可培养假单胞菌种群不仅得到恢复而且超过对照。对各处理土壤总的及可培养假单胞菌DGGE谱带类型聚类分析,发现乙草胺、甲胺磷处理土壤样品均各自聚为一簇,说明农药污染类型是影响土壤中假单胞菌种群结构的重要因素。
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利用微生物分子生态学方法(16S rDNA-PCR-DGGE,clone library,ARDRA,sequencing),研究了乙草胺、甲胺磷胁迫对土壤抑真菌作用的影响及微生物学机理。首次构建了具有相同理化性质而抑真菌作用不同的土壤模型,报道了乙草胺和甲胺磷胁迫可降低土壤抑真菌作用,土壤细菌,尤其是假单胞菌群落结构以及phlD功能基因丰度和多样性与土壤抑真菌作用密切相关。 经100℃、110℃和121℃处理得到土壤抑真菌作用逐渐下降的系列土壤样品,经PCR-DGGE分析、克隆文库构建以及测序等证实了土壤细菌多样性和群落结构与土壤抑真菌作用密切相关,其中假单胞菌是重要的功能种群,酸细菌、α,β-变形细菌、节杆菌以及一些不可培养细菌可能存在潜在的抑真菌能力。 乙草胺(50、150、250 mg•Kg-1)处理可降低自然清洁土壤抑真菌能力。随着土壤抑真菌作用的逐渐下降,土壤细菌、真菌以及特异性功能种群假单胞菌和芽孢杆菌的群落结构均发生一定改变。乙草胺通过改变土壤微生物群落组成而降低土壤抑真菌作用。甲胺磷(50、150、250 mg•Kg-1)处理在低浓度时即可极大降低土壤抑真菌作用,且不同浓度处理间差异不显著。 乙草胺和甲胺磷胁迫(浓度均为50、150、250 mg•Kg-1)均能降低土壤中总的可培养假单胞菌和抗典型病原真菌立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的假单胞菌多样性,改变其群落结构。同时还能降低重要抗真菌抗生素2,4-DAPG合成的关键功能基因phlD的多样性。而phlD基因的丰度在甲胺磷胁迫下亦逐渐下降。上述影响在实验5周内持续存在,不可恢复。 研究结果表明乙草胺和甲胺磷胁迫可通过改变土壤细菌,尤其是假单胞菌群落结构及phlD功能基因多样性而降低土壤抑真菌作用,对土壤质量存在潜在生态风险。 此外,对土壤真菌DNA的提取方法进行了优化,得到了适于我国北方土壤类型且真菌多样性程度较高的真菌DNA提取方法。
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污水生物处理系统本质上是一种人工强化的工程化微生态系统。污水处理过程往往由多个功能互补的反应单元协同完成,例如因对污水中有机碳、氮和磷兼具良好的去除功能而在城市污水处理中被广泛应用的Anoxic / Oxic(A/O)生物处理工艺。不同反应单元特有的微生物群落之间的相互关系和相互作用与处理系统的稳定性和处理效率密切相关。所以对污水处理系统中微生物群落进行系统分析非常重要。研究系统中微生物群落的时空演替对于优化处理系统的设计和操作具有重要意义。但是,以往对于污水处理系统中微生态系统的解析多数针对实验室规模的其中个别反应器独立进行,还缺乏从系统水平对实际大规模运行的整个污水处理过程中所有反应单元群落进行分析的研究。 悬挂链移动曝气系统是对A / O工艺的完善和发展。悬挂链曝气工艺的实现是依靠悬挂链移动曝气设备和完善的自动控制系统来完成的。可以在系统中实现类似多级A/O的可能性,水力停留时间较长,污泥龄达到15天以上,能够完全实现A / O 工艺。 目前正被广泛应用在各种行业的污水处理项目中。 本文应用基于细菌16S rRNA中的PCR扩增方法(Polymerase Chain Reactor),结合变性梯度凝胶电泳指纹分离技术(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE),对实际规模的运用Anoxic / Oxic(A/O)工艺并采用悬挂链式移动曝气技术的污水生物处理系统中微生物群落特征,主要对细菌组成结构和群落动态,细菌优势菌群的多样性以及与系统功能稳定性的关系进行了研究,拟为更全面了解活性污泥处理系统中的优势菌群特征,以及细菌群落结构和功能动态变化关系,实现对活性污泥处理的优化操作,对污染物降解功能菌群的筛选,为运用现代培养技术实现分离培养并运用于环境修复实践奠定方法和理论基础。 首先,对影响PCR-DGGE分析的重要前操作步骤进行了优化和筛选,包括两个方面:细菌基因组DNA的高效提取和纯化;不同16S rRNA靶序列对PCR-DGGE分析的影响。从中选出适合于活性污泥样品的细菌基因组DNA提取方法和PCR-DGGE分析的最优靶序列组合。 其次,运用PCR-DGGE指纹图谱技术分析了该污水处理系统中不同功能反应单元中活性污泥的细菌种群结构特征,探讨了系统运行过程中细菌种群时间和空间上的动态特征。并将图谱中所显示的优势条带进行切割回收,重复扩增,电泳检测,序列测定并与GenaBank数据库中的微生物类群进行同源性比对,探讨活性污泥中细菌种群多样性,了解污泥中可能含有的主要具有污染物降解功能的类群信息。 在整个处理过程中,同一功能反应单元中不同位置的活性污泥微生物菌群结构不同。执行不同功能的处理单元活性污泥细菌多样性和组成结构各有不同。 在系统稳定运行的状态下,细菌组成结构的时间变化动态不显著。但是在系统的不同操作条件下,主要处理池的微生物群落的DGGE遗传指纹图谱较独特。 对该处理系统污泥中优势菌群的序列测定和同源性比对表明,优势菌群所对应的细菌的16S rDNA序列可以被归属于以下四个主要的细菌系:α, β, γ- Proteobacteria 以及厚壁菌门 phylum Firmicutes (low G+C Gram-positive)。 该处理系统的优势菌群的DGGE条带拥有潜在的具有异养硝化/好氧反硝化的除 N / P 类群。该类菌群中的大多数属于Pseudomonas spp.。另外,回收到两个与已鉴定的具有异养硝化和好氧反硝化能力的Pseudomonas stutzeri 和 Pseudomonas borbori 最相似的菌株的条带。γ-变形菌纲门(γ- Proteobacteria)的微生物类群在该缺氧-好氧处理厂中分布较广泛,尤其是和 N / P 去除紧密相关的具有脱氮除磷能力的Pseudomonas 类群,而且在好氧曝气处理池中分布较广,这可能和系统中表现的好氧反硝化现象相关。 不同的操作状况下微生物群落结构有差异。增加污泥回流比,增加DO(Dissolved oxygen)浓度,COD去除率和NH4+-N去除率显著增加,总N和总P的去除率改变不显著。 最后,对整个处理过程中微生物群落结构在系统正常调控改变范围内的长期动态和稳定性进行了探讨。整个处理系统的长期稳定性与体系中的每个处理环节相关,而不是仅与其中的单个主要反应池相关。污水处理体系的功能稳定性与其中的微生物群落稳定性相关,微生物群落结构决定了生态功能,群落结构变化能反应系统的运行状况及其降解效率。
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研究长期施肥黑土微生物群落特征及其季节变化,可准确揭示施肥对黑土肥力质量的影响。本文以黑土肥料试验基地10个有机肥和无机肥处理0—20 cm表层土壤为研究对象,以不施肥和休闲处理为对照,分别经过8次季节取样,分析长期施肥与季节更替条件下黑土微生物群落特定磷脂脂肪酸(PLFA)含量、微生物量碳(氮)含量、r-k策略菌群数量、土壤酸(碱)磷酸酶活力以及16S rDNA的PCR-DGGE条带构成等微生物特征及其变化规律,探讨长期施肥与季节更替对黑土微生物群落的影响,明确限制各微生物群落生长的主要养分因子。 不同季节、多种施肥处理之间的土壤微生物指标多重比较表明,施肥与季节更替显著影响黑土微生物各菌群生长与活力,且施肥×季节更替交互作用显著。 与无机肥处理相比,有机肥施用能显著提高黑土各菌群特征PLFA与微生物量碳(氮)含量、r-k策略细菌或真菌数量以及磷酸酶活力;在一定时期、一定程度上改变土壤细菌PCR-DGGE条带构型,提高细菌群落多样性。不同有机肥-化肥配施处理之间各微生物学指标比较发现,有机肥+磷肥(MP)处理中的可培养细菌数量、细菌与放线菌PLFA含量、微生物量碳含量以及碱性磷酸酶活力普遍较低;高量有机肥(M2CK)处理中的各菌群特征性PLFA、微生物量碳(氮)含量以及酸性磷酸酶活力等则有一定提高。单施化肥各处理,尤其是氮磷钾(NPK)处理,在一定程度上抑制了黑土各菌群生长与活力。各处理PLFA因子分析表明,施用有机肥对黑土放线菌、G+与G-细菌等菌群影响较大。另外,休闲处理真菌特征PLFA含量、r-策略真菌数量、碱性磷酸酶活力及微生物量碳(氮)含量等均处较高水平。 季节更替对微生物群落各指标影响亦达显著水平,且各指标季节变化趋势存在一定差异。黑土各菌群特征性PLFA含量、微生物量氮、G+/G-比值及r-策略细菌等指标,均自春至夏有显著升高趋势;而磷酸酶活力、真菌/细菌比值及k-策略细菌等指标则自春至夏有明显的下降趋势。各处理PLFA因子分析表明,夏秋季节对土壤单烯不饱和脂肪酸影响较大。 多元线性回归分析表明,碱解氮、有机碳、有效磷等养分几乎是影响所有已测微生物学指标的最关键养分因子,较次要的微生物生长限制因子是速效钾与pH值。
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辽河流域工业历史长,污染负荷大,大量污染物随废水排放沉积于河道底泥,成为二次污染源。对污染底泥进行修复,对保障水质安全、实现人与自然和谐发展具有重大意义。本研究针对辽河流域污染状况,开展了微生物与零价铁两种方式联合修复氯代烃、多环芳烃、重金属污染底泥的研究;并采用PCR-DGGE和PLFA两种分析技术相结合,研究了零价铁修复对底泥微生物群落结构的影响。 研究结果表明:①利用水-硅油双相系统从污染底泥中筛选得到3株三氯乙烯降解菌WT1、FT10、FT17,经鉴定分别为Achromobacter xylosoxidans、Sporosarcina aquimarina、Sporosarcina ginsengisoli。在5mg•L-1三氯乙烯作为单一基质的情况下,3天后的降解率分别为:53.4%、48.1%、44.6%。500 mg•L-1乙酸钠和乳酸钠作为共代谢基质均可以促进菌株WT1对三氯乙烯的去除。全细胞蛋白图谱分析表明,乙酸钠和三氯乙烯共同诱导菌株WT1表达了一条分子量约为59kDa的新蛋白带,可能与三氯乙烯降解有关。②零价铁对底泥三氯乙烯、1,3-二氯苯、菲、芘、Cr(Ⅵ)污染具有较好的去除作用,土著微生物也能促进上述污染物的去除,但是去除效果不及零价铁明显。③正交实验结果表明:零价铁粒径对三氯乙烯、1,3-二氯苯、Cr(Ⅵ)污染底泥修复有显著影响;初始pH值越低,温度越高,粒径越小,添加量越大,零价铁对污染物的去除效率就越高。④DGGE和PLFA分析结果表明:零价铁修复使污染底泥中耐受菌群减少,敏感菌群重新出现,使部分污染底泥微生物的多样性、磷脂脂肪酸含量、特定微生物类群和环境压力恢复至未污染对照水平,表明零价铁修复有利于污染底泥微生物群落结构的恢复。
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沈抚灌区是我国面积最大、污灌历史最长的石油类污水灌溉区,土壤中大分子量多环芳烃污染严重,对当地粮食生产与生态安全造成严重危害。对此类污染土壤进行生物修复,对保证农产品的安全,实现当地人与自然的可持续发展具有重大的意义。 本研究以沈抚灌区污染土壤中大分子多环芳烃芘为主要研究对象,采用稳定同位素比率分析技术(IRMS),以磷脂脂肪酸(PLFA)为生物标记物,分析污染土壤参与芘降解的优势微生物类群;并以此为指导,采用分子生物学手段和传统微生物学分析方法,筛选土壤中的高效降解菌,并追踪其释放到土壤中后的动态变化与调控。 从沈抚灌区土壤富集培养芘的降解菌,经过双层平板法初筛和芘降解菌液体摇瓶复筛,获得5株以芘为唯一碳源生长的具有较高降解活性菌株。 将筛选的降解菌投加到污染土壤中,以13C标记的芘为代谢底物,以土壤微生物的磷脂脂肪酸为生物标记物,采用稳定同位素比率分析方法(GC-C-IRMs),分析投加的降解菌在原位土壤中的降解作用。结果显示,与不加菌的对照土壤相比,富含13C的磷脂脂肪酸指纹图谱相似度较高的为投加了菌株B05和菌株B15的土壤,芘的降解效率也最高,表明这两株菌在原位土壤芘降解中发挥了重要作用。根据形态学观察、16项生理生化鉴定和16S rDNA序列分析结果,将菌株B05鉴定为 Aminobacter ciceronei,将菌株B15鉴定为 Microbacterium arabinogalactanolyticum。菌株B05初步确定为一株新的芘降解菌,并对菌株培养条件进行了优化。 采用PCR-DGGE方法,研究了筛选的5株降解菌在不同的营养条件下释放到土壤中后的数量和代谢活性的变化。PCR-DGGE图谱分析表明:投加初期外加菌在竞争中占据优势,但是随时间推移,营养物质的消耗,优势逐渐消失,PCR-DGGE的条带趋向于一致。菌株B05的稳定期相对较长,在DGGE图谱中的条带相对密度大,而且对芘的降解率最高,是一株具有潜在应用价值的高效降解菌。混合菌比单一菌降解率高,添加碳氮源有利于外加菌群更快更好的适应在污染土壤中生存,而且有助于对多环芳烃的降解。
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以中国科学院沈阳生态试验站的长期定位试验为平台,测定并分析了下辽河平原不同土地利用方式下潮棕壤的微生物生物量、基因多样性和群落结构。结果表明,不同土地利用方式会对土壤微生物特性产生影响: 氯仿熏蒸法测定土壤微生物生物量结果显示,裸地处理的微生物生物量碳、氮较低,割草和休闲地则显著高于其它处理。在农田生态系统中,长期单施循环猪圈肥显著提高了土壤微生物生物量碳、氮,而长期单施NPK肥处理与CK相比则略有降低,在施用化肥基础上配合养分循环再利用,微生物生物量碳、氮介于CK和单施循环猪圈肥之间。 PCR-DGGE图谱显示,处理间细菌条带分布较相似,其中裸地处理细菌多样性最高;长期土地利用格局改变了土壤真菌群落结构,施肥增加了真菌多样性,且有机肥的影响大于化肥;不同处理间氨氧化细菌群落结构差异明显,NPK+M处理明显增加了氨氧化细菌多样性,且无机肥和有机肥对氨氧化细菌影响不同。土地利用方式对细菌影响较小,但明显改变了真菌和氨氧化细菌的群落结构。聚类分析结果显示,撂荒和割草处理较施肥对细菌、真菌和氨氧化细菌多样性的影响更明显。 PLFA测定的细菌脂肪酸和真菌脂肪酸与总微生物量变化规律相似,均为:休闲和割草处理最高,农田次之,裸地最低;农田处理间PLFA含量差异较小,其中M处理最高,其次为CK和NPK+M处理,NPK处理最低;撂荒和施用有机肥提高了微生物PLFA量,而施用化肥则降低了微生物PLFA量;自然生态系统中土壤具有较高的G+/G-;休闲和割草处理具有较低的细菌/真菌,农田生态系统和裸地的细菌/真菌则较高;PLFA与土壤养分相关性分析表明, PLFA量与土壤有机质和总氮显著相关。PLFA表征的微生物生物量呈现春秋略低,夏季略高的趋势。 不同的测定方法从不同角度分析了微生物特性,氯仿熏蒸法和PLFA方法之间存在很好的相关性,微生物生物量和多样性之间相关性比较弱。
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OLAND两阶段生物脱氮系统是一项正在开发且极具应用前景的处理高氨氮、低COD废水的新技术。在实验室水平,对OLAND系统限氧亚硝化阶段MBR反应器和厌氧氨氧化阶段SBR反应器的启动和运行进行了系统研究。MBR反应器控制参数在DO0.1-0.3mg/L,pH7.8±0.1,温度30±0.5℃,SRT无穷大的条件下,可实现在较高的容积负荷By=IO00mgN/L,水力停留时间HRT:ld下稳定的亚硝酸型硝化,使NH4+-N和NO2-N的出水比例达到理想的比值(1:1.20±0.20),保证厌氧氨氧化阶段SBR反应器的理想进水;SBR反应器在完全厌氧、pH7.8-8.2,温度30±0.5℃,SRT无穷大的条件下,无需外加任何有机碳源,在较高总氮负荷550mgN/L下,可实现NH4+-N和NO2--N同时稳定的去除,二者的消耗比例为1:(1.21±0.05),总氮去除率高达92%。采用巢式PCR、DGGE、 FISH等分子技术对MBR反应器硝化菌群随溶解氧的动态变化规律和SBR反应器厌氧氨氧化菌群结构、组成进行了研究,并探讨了硝化菌群与氮素组成变化之间的内在联系。结果表明:在限氧亚硝化阶段硝化菌群中氨氧化菌受溶解氧浓度的影响较大,其种群结构从反应器启动初期到稳定后期发生了非常明显的变化。亚硝酸氧化菌NOB的种群组成受溶氧影响并不明显,从启动初期到稳定后期其种群结构无明显变化。硝化菌群中氨氧化菌 AOB与亚硝酸氧化菌NOB的数量比例关系随溶解氧的降低而不断升高,从最初的3.6:1升高到稳定后期的5.5:1。MBR反应器优势硝化菌群主要由A、B、C三类氨氧化菌和硝化杆菌D、硝化螺菌F组成,其中优势菌C为维持MBR反应器稳定出水比例的主要功能菌。硝化菌群组成和结构的变化,带来了不同N素之间组成和比例的规律性变化。厌氧氨氧化阶段基本由厌氧氨氧化菌AnAOB和ANAMMOX两类菌组成,二者空间结构紧密,在反应器中的活菌数量比例分别为55%和42%。厌氧氨氧化菌AnAOB种群多样性相对比较丰富,主要由条带I和H所代表的两种优势菌组成;ANAMMOX菌种群多样性变化较小,其种群主要由优势菌K和J组成。对MBR和SBR反应器中的优势菌进行了克隆、测序和系统发育学分析,结果表明:限氧亚硝化阶段MBR反应器启动初期的优势菌A属于Nitrosomonadaceae科,是否是一个新属,还有待于进一步鉴定。运行中期优势菌B与Nitroso)nonaseurooaea亲缘关系最近,同源性高达99.1%,暂命名为Nilrosomonas sp.BI。稳定后期优势菌C与Nitrosomonas eutroPha亲缘关系最近,同源性为96.3%,暂命名为Nifrosomonas sp.cl。硝化杆菌属优势菌D与Nitrobacter alkalicus、Nitrobacter hambllrgensts和Nitlobac招rwinograsky 亲缘关系较近,同源性分别为95.5-97%、96.5~97%和95.8~96.8%。SBR反应器中AnAOB优势菌I与MBR反应器优势菌B亲缘关系最近,同源性高达98.7%,与Nitlosomonas euroPaea同源性为98.3%。根据序列比较和生理特性分析,优势菌I与优势菌B应为Nitrosomonas属两个不同的种,暂将优势菌I命名为Nitrosomonas sp.II。优势菌H与MBR反应器优势菌C亲缘关系最近,同源性达97.9%,与Nitrosomonas eutropha同源性为96.3%。结合其生理特性分析,二者应为Nitrosomonas属两个不同的种,暂将优势菌H命名为Nitrosomollas sp.Hl。ANAMMox优势菌K与未培养的 Planctomycete和已鉴定的另一种ANAMMoX菌尤uenenia sf况ttgartiensis亲缘关系较近,同源性分别为99.8%和96.6%。优势菌J与Gen bank收录的所有菌的相似性均低于76%,说明该菌是OLAND系统厌氧氨氧化阶段比较独特的菌,是迄今为止在厌氧反应过程中未发现的一个新菌。