入侵生物金苹果螺在滇池流域的首次记录

2004年10月,中国科学院昆明动物研究所首次发现金苹果螺(Pomacea canaliculata)入侵重要的水源保护区嵩明白邑黑龙潭.金苹果螺起源于中南美洲,在亚洲,它通过有意或无意的传播而逐渐扩散到菲律宾、越南、泰国、老挝、柬埔寨、马来西亚、印尼、巴布几内亚、韩国、日本和中国的南部.金苹果螺已成为水稻产区的最大害虫,给农业生产带来巨大的损失.为防止金苹果螺在云南扩散,目前已经实施了严格的预防、控制措施,同时开展了公众保护教育宣传活动.

亚历山大藻对海产贝类胚胎和蒙古裸腹溞的影响及致毒机制研究

本文研究了典型有毒赤潮藻——亚历山大藻(Alexandrium)对海湾扇贝(Argopecten irradians Lamarck)、文蛤(Meretrix meretrix Linnaeus)和太平洋牡蛎(Ostrea gigas Thunberg)受精卵孵化的影响和致毒机制以及对蒙古裸腹溞(Moina mongolica Daday)生命活动的影响。此外，还针对我国赤潮发生特点，模拟研究了我国东海大规模赤潮对菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum (Adams et Reeve)）受精卵孵化和蒙古裸腹溞种群数量的影响。 结果发现：8株产PSP毒素的亚历山大藻：塔玛亚历山大藻( ATHK, AT5-1, AT5-3, ATCI02, ATCI03)，链状亚历山大藻, A. lusitanicum、微小亚历山大藻和2株不产PSP毒素的相关亚历山藻(AC-1, AS-1)对海湾扇贝受精卵的孵化均有显著抑制作用，说明在亚历山大藻属中，这种抑制作用具有一定的普遍性，并与PSP毒素的产生无直接关系，表明存在非PSP毒素的其它毒性物质。一种PSP标准毒素STX也没有这种抑制作用，进一步证明该抑制作用与PSP毒素不直接相关。 相关亚历山大藻AC-1对海湾扇贝、文蛤和太平洋牡蛎受精卵孵化的有显著的毒害作用，其藻液、重悬液、去藻液和内容物均显著影响受精卵的孵化。相关亚历山大藻AC-1对海湾扇贝、文蛤和太平洋牡蛎担轮幼虫细胞的超微结构有显著破坏作用，破坏膜结构和胞内结构，影响细胞内的功能器官如溶酶体的稳定性，使卵黄颗粒萎缩变形；对文蛤和太平洋牡蛎的受精卵显示出极强的毒害作用： 3000cells•ml-1时，使二者胚胎完全溶掉消失；在2000cells•ml-1的藻液中培养2h后，担轮幼虫的外膜发生溶解，整个幼体呈葡萄串样。相关亚历山大藻AC-1产生的这种毒性物质可能对贝类胚胎细胞的结构和功能有影响。 亚历山大藻对蒙古裸腹溞的毒性效应与不同藻种/藻株密切有关：塔玛亚历山大藻（AT-6, ATCI02）、链状亚历山大藻、A. lusitanicum和微小亚历山大藻不影响蒙古裸腹溞的存活，而塔玛亚历山大藻（ATHK、ATCI03和AT5-1）和相关亚历山大藻(AC-1, AS-1)有显著影响。蒙古裸腹溞能摄食塔玛亚历山大藻(AT-6, ATHK, ATCI02, ATCI03, AT5-1)，链状亚历山大藻, A. lusitanicum和微小亚历山大藻，很少或基本不摄食相关亚历山大藻。亚历山大藻影响蒙古裸腹溞的RNA/DNA比值和蛋白质含量以及Na+,K+-ATP酶活性。相关亚历山大藻AC-1对蒙古裸腹溞的存活有极强的毒性作用，藻液、重悬液、内容物和碎片均有显著影响；即使与3×106cells•ml-1小球藻混合，10和50cells•ml-1的相关亚历山大藻AC-1仍能使蒙古裸腹溞的产幼数和存活时间显著下降。亚历山大藻对蒙古裸腹溞生命活动的影响不仅与PSP毒素有关，还与非PSP毒素有关；蒙古裸腹溞可能也是研究有害藻急性和慢性毒性的一种理想生物。 应用菲律宾蛤仔胚胎和蒙古裸腹溞评价我国东海特大规模赤潮对海洋生物资源的潜在危害时发现：单种链状亚历山大藻对菲律宾蛤仔受精卵的孵化和蒙古裸腹溞的种群增长均有显著不利影响；单种东海原甲藻（1~10×104cells•ml-1）对菲律宾蛤仔受精卵的孵化没有影响；较低密度的东海原甲藻能维持蒙古裸腹溞（2~5×104cells•ml-1）的种群增长；较高密度的东海原甲藻对蒙古裸腹溞（10×104cells•ml-1）种群有显著的抑制作用。两种藻以赤潮密度混合后，适当密度的东海原甲藻能在一定程度上减轻链状亚历山大藻对菲律宾蛤仔受精卵和蒙古裸腹溞的毒性。可见，东海连年爆发的大规模赤潮不仅对浮游生态系统有不利影响，若同时爆发亚历山大藻赤潮，则对海洋浮游生态系统和贝类资源的恢复产生更加不利的影响。

海湾扇贝超氧化物歧化酶家族基因结构、表达和多态性分析

海湾扇贝Argopecten irradian Lamarck于1982年从美国引种到中国，由于具有较快的生长速度和很高的经济效益，海湾扇贝成为中国最主要的养殖贝类之一。近年来海湾扇贝养殖遇到了死亡率高等问题，深入开展海湾扇贝功能基因的研究，尤其是免疫相关基因及其机制研究并在此基础上寻找扇贝疾病防治的有效方法对海湾扇贝的健康养殖十分重要。 对于贝类免疫系统来说，其血细胞在先天性免疫防御中起着重要的作用。当受到外界病原侵染时，贝类血细胞的一个重要免疫反应就是吞噬作用。在吞噬病原过程中，受到病原侵染的贝类还会产生其他多种免疫反应，这些免疫反应将消耗大量的能量（ATP），产能的呼吸链会加速运转，由此也会引发与呼吸链相耦联的活性氧（ROS）的大量产生。这些活性氧具有极强的反应特性，能破坏病原微生物的结构和功能分子，实现对入侵病原的杀灭。利用活性氧对被吞噬的病原进行杀灭，这是吞噬作用消除病原抵御侵染的重要机制。但由于活性氧分子反应的非特异性，它们也会破坏宿主机体细胞内的功能蛋白分子、不饱和脂肪酸分子和核酸等，对细胞造成严重的伤害，进而导致机体生理机能的损伤和免疫系统的破坏。所以，及时消除病原感染机体内过量产生的ROS，维持相关细胞的正常代谢，对提高机体抵抗力和免疫力具有重要的作用。O2-是生物体内产生的第一种活性氧分子，其他的活性氧分子也是由它衍生而来，消除过量O2-是消除过量活性氧危害的第一步也是关键一步。生物体内，超氧化物歧化酶（SOD）是催化O2-发生歧化反应，消除O2-的关键酶。 首先，本文通过RACE方法获得了海湾扇贝SOD家族全部三种基因的cDNA全长并对其进行了序列的生物信息学分析，海湾扇贝AiCuZnSOD全长cDNA为1047个碱基，其中开放阅读框为459个碱基，编码152个氨基酸，与栉孔扇贝Chlamys farreri的CuZnSOD相似度为77.5%，与长牡蛎Crassostrea gigas的相似度为75%，与人的相似度为74.7%。AiMnSOD全长cDNA为1207个碱基，其中开放阅读框为678个碱基，编码226个氨基酸，序列比对结果发现AiMnSOD的氨基酸序列与虾夷扇贝Mizuhopecten yessoensis和皱纹盘鲍Haliotis discus hannai的相似度分别为85%和78.4%，与哺乳动物相似度也在68%~72%之间。AiECSOD全长cDNA为893个碱基，其中开放阅读框为657个碱基，编码218个氨基酸。AiECSOD与其它物种ECSOD相似度比较低。与线虫Brugia pahangi的相似度为27.9%，与疟蚊Anopheles gambiae的相似度为31.4%，与斑马鱼Danio rerio的相似度为27.8%，与人的相似度也只有28.6%，与同是贝类的长牡蛎ECSOD也只有28.1%的相似性。主要原因是AiECSOD的信号肽和肝磷脂结合区域在各物种中无同源性。 其次，采用qRT-PCR（quantitative real time PCR）方法分析三种SOD基因在不同组织中的表达情况，结果表明三种SOD基因的组织表达有所差异。AiCuZnSOD基因在鳃中表达水平最高，其次是血细胞和性腺，在外套膜、闭壳肌和肝胰脏表达水平较低。AiMnSOD基因在鳃中表达水平最高，其次是外套膜，在血细胞、性腺，而在肝胰脏和闭壳肌表达较弱。AiECSOD基因在血细胞中表达水平最高，其次是肝胰脏，在鳃、闭壳肌表达水平较低，而性腺和外套膜没有检测到。同时，采用qRT-PCR对鳗弧菌Vibrio angullarum感染后海湾扇贝血细胞中三种SOD基因mRNA表达变化进行了检测。AiCuZnSOD表达量在各个时间段没有显著差异(P > 0.05)。AiMnSOD的表达量在1.5 h时略有下降，在3 h时达到最高表达量，是空白组（0h）的3倍(P < 0.01)，从6 h到24 h表达量逐渐下降，24 h时表达量是空白组的1.6倍，24 h到48 h又稍有升高。AiECSOD的表达量在1.5 h时有所下降，是空白组的0.3倍（P < 0.05)，随后逐渐升高，在12 h时达到最高表达量，是空白组（0h）的4.5倍（P < 0.01），从24 h到48 h表达量逐渐下降并恢复到空白组的水平。在对照组，各个时间点没有显著差异（P > 0.05）。在鳗弧菌感染后，海湾扇贝三种SOD的表达并不一致，且差异比较显著。AiCuZnSOD被认为是构成性表达基因，其受外界刺激的影响最小，AiMnSOD和AiECSOD受刺激后表达上调比较明显。 第三，采用Genome-walking的方法得到了海湾扇贝三种SOD基因的基因组全长和近端启动子序列并对其进行了相关分析。AiCuZnSOD的基因组序列全长为4279bp，包含有4个外显子和3个内含子。AiMnSOD的基因组序列全长为10692bp，包含有4个外显子和3个内含子。AiECSOD的基因组序列全长为5276bp，包含有5个外显子和4个内含子。三种基因外显子和内含子的结合处序列遵循-AT/GT-原则。我们把海湾扇贝SOD家族的三个基因的近端启动子进行了比较分析。发现三种SOD在靠近起始密码子的位置都有Oct-1结合位点。三种SOD共有的转录位点有：Oct-1、C/EBPalp、Oct2.1、Sp-1和GATA-1。AiCuZnSOD和AiMnSOD共有的转录位点有：ICSBP、Ftz、TATA-box、C/EBPbeta和Antp。AiCuZnSOD和AiECSOD共有的转录位点有：AP-1和NFκB。AiMnSOD和AiECSOD共有的转录位点有：GR和ER。AiCuZnSOD独有的位点有：SRF、YY-1和NF-1。AiMnSOD独有的位点有：HNF-1、Hb、MEB、NF-muE1、Pit-1a和Eve。AiECSOD独有的位点有：CREB、RATA-alph、Kruppel-like和AP-3。 此外，通过构建原核表达载体，本研究对AiCuZnSOD和AiECSOD基因进行了体外重组表达，并对纯化的重组蛋白进行了酶活分析。酶活分析表明，重组AiCuZnSOD蛋白有较高的酶活和稳定性。 最后，我们对海湾扇贝三种SOD基因的部分区域，包括启动子、编码区，部分内含子区域进行了SNP检测，并对SOD基因部分SNP位点多态性和鳗弧菌敏感性进行了相关分析。三种SOD基因中，我们共发现了59个SNP位点，其中AiECSOD的SNP位点最多，特别是在启动子区，AiCuZnSOD和AiMnSOD多态性较低。其中AiCuZnSOD启动子区的-1739 T-C 位点的基因型和等位基因，AiECSOD启动子区的-498 A-T和-267 G-A等位基因频率，AiECSOD的第一个外显子38 Thr-Lys的多态性在敏感和抗菌群体中存在显著差异（P < 0.05）。

海洋经济动物精子超低温保存的研究

从1949年以来经过近五十年的发展，超低温保存种质细胞技术已经趋于成熟，特别是在家畜推广良种化的过程中发挥重要作用。对海洋动物种质细胞保存研究的范围主要集中在鲑鳟鱼类和牡蛎等少数几种海洋生物上。本研究结合“国家自然科学基金”研究项目，进行了三种贝类和两种鱼类精子的超低温保存实验，得到了它们在液氮（－196 ℃）条件下的适宜保存条件。栉孔扇贝（Chlamys farreri）冻精解冻后复苏比例、受精率和孵化率最高可达到49.39％、42.06％和12.15睦栉孔扇贝精子超低温保存时发生冷冻伤害的温度范围在－30 ℃～－60 ℃；其低温保存的最适降温速率为20 ℃／min；使用抗冻剂二甲基亚砜（DMSO）的最适浓度为5 ℃，其保存效果优于甘油；样品保存的最佳体积为0.6ml～1ml；解冻精子的最适水温为35 ℃，50 ℃次之，20 ℃最差；用自然海水激活解冻后精子的效果好于低盐度溶液；在0 ℃进行预处理平衡时间不宜太长；在抗冻液中加入蛋黄对保存效果没有改善，并且会对冻精的孵化率有抑制作用；用20 ℃／min和5％DMSO冷冻精子，液氮中保存栉孔扇贝精子55天后其复苏比例达到42.17％。超低温保存紫贻贝（Mytilus galloprovincialis Lamarck）精子，解冻后其复苏比例、受精率和孵化率最高可达到41.63％、69.52％和54.74％。保存紫贻贝精子最适降温速率为5 ℃／min，发生冻伤的温度范围是－20 ℃～－60 ℃；使用抗冻剂DMSO的保存效果好于甘油，且使用抗冻剂DMSO的最适浓度为15％；利用自然海水激活冻精效果好于低盐度或高pH值的溶液；样品体积（在0.2～1ml之间）对保存效果没有影响；采用15％DMSO和5 ℃／min的降温速率处理精子，液氮中保存90天后复苏比例仍达到41.8％。保存菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum （Adams and Reeve））精子的最适降温速率为5 ℃／min，发生冻伤的温度范围是－30 ℃～－60 ℃；抗冻剂DMSO的保存效果好于甘油，也用DMSO与甘油混合使用，使用抗冻剂DMSO的最适浓度为10％；利用自然海水激活冻精效果好于低盐度或高pH的溶液；样品体积（在0.2％～1.6ml之间）对保存效果有显著影响。冷冻保存后精子复苏比例、受精率和孵化率最高达到40.84％、68.87％和47.17％；以最适降温速率和抗冻剂浓度处理精子，并在液氮中保存36天后冻精复苏比例仍可以达到38.54％。黑鲷（Sparus macrocephalus）精子经过超低温保存后复苏率、存活率最高可以达到61.37％和61.4。保存黑鲷精子时发生冷冻伤害的温度范围是－20 ℃～－60 ℃，适宜的降温速率为20 ℃／min；使用抗冻剂DMSO的适宜浓度为20％；样品体积对保存效果有相关性；利用自然海水激活冻精效果好于低盐度或高pH值的溶液；使用20％DMSO和20 ℃／min降温速率处理，在液氮中保存黑鲷精子66天后解冻，其复苏率和存活率分别为59.81％和58.45％。在液氮中保存真鲷（Pagrosomus major）精子时发生冷冻伤害的温域为－30 ℃～－60 ℃，适宜的降温速率为20 ℃／min；使用抗冻剂DMSO的适宜浓度为20％；采用低盐度或高pH值的溶液激活冻精的效果不如自然海水。真鲷冻精的复苏率和存活率最高可达到50.73％和62.5；以20 ℃／min和20％DMSO处理真鲷精子，保存在液氮中46天后冻精复苏率和存活率为50.63％和61.02％。通过对多种贝类和鱼类精子的超低温保存实验，不仅获得超低温保存基本条件，并且通过显微镜观察结合前人的研究，对产生冻伤的原因和保护的机理提出了一个模式。

The effect of the causative algae of large-scale HAB in the East China Sea on egg hatching of Argopecten irradians, and population growth of Brachionus plicatilis and Moina mongolica

The impacts of Prorocentrum donghaiense Lu and Alexandrium catenella Balech, causative species of the large-scale HAB in the East China Sea, were studied under laboratory conditions. According to bloom densities, the effects of monoculture and mixture of the two species were examined on the egg-hatching success of Argopecten irradians Lamarck, and the population growth of Brachionus plicatilis Muller and Moina mongolica Daday. The results showed that monoculture of A. catenella had a significant inhibition on the egg hatching success of A. irradians, and the population growth of B. plicatilis and M. mongolica. The median effective densities ( EDSo) inhibiting the egg hatching success of A. irradians for 24 h and the population growth of B. plicatilis and M. mongolica for 96 h were 800, 630, and 2 400 cells/cm(3), respectively. Monoculture of P. donghaiense has no such inhibitory effect on the egg hatching success of A. irradians; P. donghaiense at lower suitable densities could sustain the population growth of B. plicatilis (1 x 10(4) similar to 3 x 10(4)cells/cm(3)) and M. mongolica (2 x 10(4) similar to 5 x 10(4) cells/cm(3)); P. doaghaiense at higher densities had significantly adverse effect on the population growth of B. plicatilis (4 x 10(4) similar to 10 x 10(4) cells/cm(3)) and M. mongolica (10 x 10(4) cells/cm(3)). When the two algae were mixed according to bloom densities, P. donghaiense at suitable densities to some extent could decrease the toxicity of A. catenella to B. plicatilis and M. mongolica. The results indicated that the large-scale HAB in the East China Sea could have adverse effect on zooplankton, and might further influence the marine ecosystem, especially when there was also Alexandrium bloom.