体细胞无性系变异与烟草抗黑胫病细胞突变体的筛选

体细胞无性系变异是植物组织培养过程中发生的一种较为普遍的现象，这种现象在遗传学理论和育种实践上都很值得研究。应用这种变异进行筛选人们已经获得了一大批生产上有广泛意义的细胞突变体。但对于无性系变异发生的机理，人们虽然也进行了详细研究，提出了不少假说，但一直未能给出一个较为全面的解释。有些解释仍然建立在推测的基础上，有待进一步的研究。在这些解释中，利用转座子活化进行解释是最使人感兴趣的一种，也是较有说服力的一种。我们的实验分为两个部分，一是对无性系变异发生与转座子的关系进行了初步的探索,一是利用体细胞无性系变异筛选烟草黑胫病细胞突变体的应用进行了研究。 对转座因子的转活性进行分析，通常采用标记基因的表型检测。本实验用农杆菌双元载体pSLJ721（Ac∷GUS）转化烟草（品种：红花大金元）， 然后对转基因烟草的愈伤组织进行GUS酶活性的组织化学分析。通过GUS活性变化来分析转座活性。结果表明组织培养可以增强转座子的活性。间接证明转座子活化是体细胞无性系变异的原因之. 本论文实验方面的另一部分是体细胞无性系变异在烟草抗黑茎病研究上的应用。烟草黑茎病是由烟草致病疫霉引起的一种烟草主要病害。首先从云南地区黑胫病病区分离、纯化黑胫病（Phytophythora parasitica via. Nicotina）病原菌，同时利用红花大金元为实验对象，以组织培养中自然发生的元性系变异为基础，以50％以及80％的黑胫病病菌粗毒素为选择压力，筛选出抗黑胫病毒素的烟草株系，用离体叶片法和茎部接种法进一步鉴定其对黑胫病病菌的抗性。最后进行田间检测以期获得综合性状优良的抗黑胫病细胞突变体。另外我们还利用随机引物扩增多态DNA（RAPD）分析技术，对选择到的九个抗病株系和六株对照的DNA进行分析。在使用的70种随机引物中，共有57个引物产生可检测扩增产物，产生306条搁增带，其中有多态性的条带数为51条，突变体的平均RAPD条带变异率为1.85％，其中有两个RAPD条带（CYA－17－100和Sangon03-350）为突变体所特有，可初步判断为抗黑胫病的RAPD标记。对突变体和对照植株叶片水溶性蛋白SDS电泳观察到一些条带的变异，但没有找到突变体特异的共同条带。

水稻富含甘氨酸蛋白在细胞中的定位及其基因调控元件的转基因分析

水稻Angrp-1基因编码富含甘氨酸蛋白质。氨基酸序列分析表明该蛋白在氨基端可能存在一个信号肽序列，其后为富含甘氨酸序列。亲水性指数显示AnGRP-1蛋白包含两个区域。第一个区域由氨基端的1到27氨基酸残基组成。为强疏水性区。该肽段的氨基端为带正电荷号肽特征。与水稻Osgrp-1和菜豆grp1.8基因编码的信号肽进行同源性比较，发现这三种信号肽具有alafLvLLNIg同源序列。AnGRP-1蛋白的第二区域由第28到183氨基酸残基组成。该区域富含甘氨酸，具轻度亲水性，并且含有15个Gly-Tyr-Gly基序，这些基序中的酷西安酸残基之间相互作用，有可能形成分子间或分子内的连接。 利用水稻原生质体瞬间表达系统，比较Angrp-1基因启动子283bp和－1020bp片段，以及Ubiquitin启动子、Actin启动子和35S启动子的活性。结果表明，在水稻原生质体瞬间表达中，Angrp-1基因的两个启动子片段活性较低，接近本底。三个对照的组成型启动子中，以Ubiquitin启动子的活性最强，Actin启动子次之， 35S启动子最弱。根据以上结果推测水稻Angrp-1基因的表达可能具有组织或发育特异异表达和特性。 为研究Angrp-1基因的稳定表达与调控特性，将Angrp-1基因的启动子缺失片段1020bp、941bp、568bp和182bp分别与GUS基因融合，得到pGRP6-121、pGRP7-121、pGRP8-121和pGRP9-121等4个克隆，进行烟草转化，获得转基因植株。GUS活性测定表明在－1020到－568之间，随缺失增多，启动子活性下降。当缺失至－182时，182bp的启动子片段活性高于568bp片段。因此，Angrp-1基因5'端－1020到－568之间存在正调控序列，在－568至－182之间存在负调控序列。对pGRP6-121的烟草转基因植株进行GUS组织染色和活性测发现，GUS基因在维管组织优先表达。在根、茎、叶三种器官中，叶和茎的表达量最高。营养生长期的表达量高于生殖生长期。用2283bp和1020bp的启动子片段分别与GUS基因融合，转化水稻，转化体的GUS组织学染色表明Gus基因具有维管束优先表达特性。因此，Angrp-1基因的表达具有较明显的组织、器官和发育特异性。 水稻AnGRP-1蛋白的免疫组织定位分析表明，Angrp-1基因产物主要定位于水稻的维管组织。利用免疫金方法对AnGRP-1蛋白进行超微结构定位，发现金颗粒主要分布于水稻细胞的细胞壁中。因此，可基本确定AnGRP-1蛋白为细胞壁蛋白。在细胞内的内质网和高尔基体上面或附近也有金颗粒的分布，表明至少有部分AnGRP-1蛋白经过内质网－高尔基体－质膜途径，最终达到细胞壁。 为研究Angrp-1基因编码的信号肽功能，将其信号肽与GUS的氨基端融合，分别置于35S启动子和Angrp-1基因1020bp启动子片段控制之下，得到克隆p35s-SP-GUS-121和pGRP6-SP-GUS-121，分别以pBI121和pGRP6-121作对照，进行烟草基因转化。转化体的GUS活性分析表明，在35S启动子控制下，加与不加信号肽对GUS活性影响不大。但是，在Angrp-1基因的1020bp启动子片段作用下，信号肽与GUS融合后的转化体中其本不表现GUS活性。利用免疫金方法进行的超微结构定位表明，在p35S-SP-GUS-121和pGRP6-SP-GUS-121转化的烟草植株中，均可在细胞壁中检测室GUS产物的存在，因此AnGRP-1的信号肽能引导GUS从细胞质分泌细胞壁中。 以Angrp-1基因5'端的－568到＋1作探针，发现Angrp-1基因以在水稻窄叶青和京系17两个亲本中存在多态性，并进一步将Angrp-1基因定位于水稻第10号染色体上。

牛耳草Bose hygrometrica 离体叶脱水-复水过程的光合作用及基因表达

本文以复苏植物牛耳草Boea hygrometrica成熟植株的离体叶片为试材，对比非复苏植物烟叶唇苣苔Chirita heterotricha, 以光合作用在脱水－复水过程中的变化为切入点，从生理水平上探讨其脱水保护位点：应用mRNA差异显示技术，从分子水平上探讨其脱水保护机制。 光合放氧速率、快速荧光诱导动力学、慢速荧光诱导动力学、荧光发射光谱、荧光激发谱的结果表明，相对于烟叶唇柱苣苔，脱水对牛耳草净光合速率、PS II和PS I光化学活性、电子传递、光合磷酸化及CO_2固定的影响有一个共同的特点，即脱水时迅速降低，复水后恢复能力强。通过非变性绿胶的研究牛耳草叶片类囊体膜叶绿素－蛋白复合体在脱水－复水过程中保持高度稳定。色素含量分析表明牛耳草的叶绿素含量在脱水－复水过程中也相对稳定。这些特征可能是牛耳草叶片光合作用脱水保护机制的一部分。 SDS－PAGE和IEF电泳结果表明，牛耳草脱水复苏过程中蛋白质表达有差异，或增或减，并分别发现了一条（SDS－PAGE）和两条（IEF）在脱水过程中特异出现的蛋白质。 本文以银染法代替放射自显影用于mRNA差异显示，不但简化了实验步骤，缩短了实验周期，而且在不降低灵敏度的前提下避免了放射性危害，降低了实验成本。本文证明了mRNA差异银染显示法用于复苏植物牛耳草脱水－复水过程中基因表达变化的研究是可行的。 mRNA差异银染显示法揭示牛耳草耐脱水复苏机制涉及到基因表达的调控。脱水－复水过程中差异表达的基因有6种，其中脱水特异诱导表达的13个cDNA所相应的基因、脱水上调节的15个cDNA所相应的基因可能参与牛耳草叶片脱水保护机制，复水特异诱导的8个cDNA的所相应基因可能参与牛耳草复水后的修复机制。2个脱水特异诱导表达的cDNA片段进行了克隆和测序。

影响小麦遗传转化的因素及山菠菜BADH 基因导入研究

本研究在前人研究工作的基础上，以小麦转化系统的建立和完善为前提，将BADH基因导入小麦，获得外源BADH基因表达的小麦转基因植株。 （1）小麦不同基因型、不同外植体和不同器官对PPT或bialaphos选择的反应不同，两种试剂对小麦转化体的选择具有同样效果。轰击后的受体材料经过2-3天的恢复生长且植株分化时不用PPT选择可以提高转化效率。冀885-443和石90-4185两个品种对PPT敏感程度适中，具有较强的植株再生能力，得到的转基因植株数和转基因频率均较高。 （2）用pAHC25质粒转化冀885-443等小麦品种取得成功，获得转基因植株12株，平均转基因频率为0.4%。Southern杂交结果表明bar基因已经整合到小麦基因组中。根据研究结果认为，过快过高地提高PPT浓度是造成转基因频率低的主要原因。 （3）采用基因枪法成功地将山菠菜BADH基因（pABH9）导入到冀885-443等品种中。PCR检测和Southern杂交分析证实获得26株转基因植株，不同品种转化频率介于0.3-2.7%，外源BADH基因在转基因植株的叶片内表达。在胁迫条件下有15株转基因植株的BADH酶活力单位明显超过亲本;有6株的相对电导率显著比亲本低，说明这些植株在胁迫条件下细胞受到损伤比亲本低。 （4）采用花粉管通道法向小麦转化pAHC25，筛选出62株抗PPT，转化频率为3.97%。采用农杆菌介导转化冀885-443的成熟胚和幼胚愈伤组织，在转化愈伤组织中观察到gus基因的表达，也得到抗G418的愈伤组织，但没能得到再生植株。

花粉管通道遗传转化方法的新证据

将pBIN35S-mGFP4质粒转入受体菌DH5α中，扩繁后提取纯化质粒DNA，待棉花盛花期时，用花粉管通道转化方法将其注射到授粉24小时左右的子房中。在被检测的950个发育10～20天左右的幼胚中，发现七个幼胚在蓝光(460～490nm)激发下发出绿色荧光，而对照发出程度不同的红色荧光。将收获的“转化种子”浸泡萌发得到生长5～6天的黄化无菌苗，在200粒种子来源的无菌苗中，检出两棵转化植株。在紫外光照射灯下转化植株发出绿色荧光，其叶片和下胚轴横切面在蓝光激发下也与对照明显不同。PCR及Southern blotting结果均证实转化植株的真实性，从而为花粉管通道转化方法的可行性提供了直接可靠的细胞及分子生物学证据。 将GFPmut1质粒的gfp通过一端平接一端粘接后重组到pBI121的BamH1和Sal1限制性酶切位点从而代替GUS基因，然后将新的重组质粒用三亲交配法转入到LBA4404菌株中得到双元载体，用于棉花下胚轴切段的转化。结果表明，gfp象gus一样可作为报告基因用于农杆菌介导的棉花转化。在对筛选培养基上生长的“抗性愈伤”进一步进行报告基因检测时，只需手持紫外灯就可以检出GFP阳性愈伤，大大减少了工作量和试验费用。 另外，在进行农杆菌转化前的棉花卡那霉素敏感性实验中发现，卡那霉素对棉花下胚轴的愈伤组织形成和增殖均有明显的抑制作用，随其浓度的增加，愈伤组织形成的频率降低，增殖的倍数减小;当浓度增加到100mg/L时，愈伤组织严重褐化，其正常生长受到完全抑制;下胚轴形态学上端切段较下端更易受卡那霉素的影响。

小麦春化相关基因的克隆及其功能分析

一． 小麦相关基因ver203F cDNA全序列克隆与功能分析 　　根据本实验室通过差异筛选技术克隆到的与春化相关的基因cDNA verc203的序列，设计PCR 5’端PCR引物，利用RACE（rapid amplification of cDNA ends）克隆策略，得到春化相关基因ver203基因的同源基因ver203F cDNA的3’端序列，长度为1,197bp。Northern分析表明ver203F全长约为1.5 kb，且其表达具有春化处理的特异性。根据3’RACE克隆的ver203F 3 ’端核苷酸序列设计了3’端PCR引物，利用5’RACE克隆到该基因的5’端片段，经DNASIS核酸分析软件分析将5’45RACE和3’RACE DNA序列拼接合并，得到ver203F全长cDNA，从TdT加尾5’末端到poly A全长为1,561 bp，5’端起始密码子ATG上游非编码区－1～－192共了192bp，终止密码子TGA到poly A的非编码区有253bp，cDNA编码区全长1,119 bp，推测编码373氨基酸残基。国际基因序列数据库检索表明该基因序列（GenBank/EMBL/DDBJ：AB012013）与大麦茉莉酸诱导基因有部分同源性。因上推测该基因在调控开花过程中可能参与茉莉酸介导的信号传导途径，ver203F作用的发挥可能需要其它蛋白的参与，或ver203F本身就是一个受体蛋白。 　　为了研究ver203F基因的功能，将通过3’RACE克隆到的ver203F 3’端序到分别构建正义和反义植物表达载体，通过花粉管通道法、农杆菌介导的叶圆片法以及农杆菌介导的真空转化法分别转化小麦、烟草和拟南芥菜。获得转基因植株后，PCR、DNA Dob Blot、Southern Blot分析以及GUS活性检测证明外源基因已整合到转基因植株中，并得到表达。在获得的小麦、烟草和拟南芥菜转基因植株中，它们开花时间都相应地推迟，表明正常植物体内该基因在控制营养生长向生殖生长的转变中起作用。ver203F可以影响小麦和拟南茶菜花序的发育，首先无论正义还是反义都使得花序的发育受到抑制，在小麦中表现为顶部小穗退化，在拟南芥菜中表现为顶花。其次在转化正义基因的转基因拟南芥菜中，观察到产生的顶花为对称的两朵或以对称的两朵顶花基部为生长点长出丛生花，这种对称花的麦型小麦小穗中小花的表型相类似，说明ver203F基因可能在小麦小花的发育过程中也起着重要作用。 二． 春化相关基因ver17在开花过程中功能的分析 以春化处理冬小麦（京冬1号）幼苗cDNA为材料，通过减法杂交与差异筛选得到春化相关cDNA克隆verc17。为了研究该基因的功能，以包含CaMV 35S启动子的pBI221为载体，将ver17cDNA片段分别从两个方向插入pBI221的BamH I－Sma I, Xba I－BamH I间，构建正义和反义表达质粒：p17S和p17X，通过花粉管通道法转化小麦。对T0和T1两代转基因小麦的观察发现，在转化反义基因p17X的转基因小麦首先表现为抽穗推迟，其次穗的顶部和基部小穗严重退化，另外还发现转化反义基因的小麦败育现象严重（主要是花粉败育），因此推测ver17基困能可具有以下几方面的特点：a．春化诱导型表达;b．促进植物开花;c．促进穗顶端和基部花的发育，减少其退化;d．影响雄蕊的发育。

两个固氮相关的植物基因对烟草和水稻的转化及其表达

豆科植物凝集素基因和血红蛋白基因在对根瘤菌的识别作用和类菌体在低氧分压下的共生固氮中起重要作用。本文的目的是试图将这两个基因转移到非豆料植物烟草和水稻，使其能识别根瘤菌，探讨非豆科植物的共生和联合固氮的可能性。 构建了含有豌豆凝集素（P－Lec）基因、Parasponia andersonii血红蛋白基因、gus基因及植物选择标记潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）的两个植物表达载体pCBHL和pCBHUL;同时，还构建了含有P－Lec基因、gus基因及植物选择标记PPT乙酰转移酶基因（bar）的植物表达载体pBBUL。在pCBHL中，CaMV35S启动子调控P－Lec基因的表达，而在pCBHUL和pBBUL中，该基因由玉米Ubiquitin 1启动子调控。 用农杆菌法将pCBHL导入烟草，得到53株再生植株，PCR检测表明转化频率为88％。用基因枪法分别将pCBHUL和pBBUL导入水稻幼胚或幼胚诱导的愈伤组织。转pCBHUL的材料共得到40株再生植株，经分子检测有18株分转基因植株，转化频率为0.9%。转pBBUL的幼胚愈伤组织经PPT筛选，只得到能分化出小芽的抗性愈伤组织。 PCR检测、Southern杂交表明P-Lec基因和Paraspoina血红蛋白基因都已经整合到转基因烟草及水稻的基因组中，转基因水稻植株中两个外源目的基因的拷贝数较高。Western杂交分析转基因植物中P-Lec基因的表达情况，结果表明该基因在转基因的烟草和水稻叶片中得到正确地表达。同时，GUS组织化学染色表明转基因烟草的嫩茎和幼根，转基因水稻的嫩叶和幼根中都有gus基因的表达。转基因烟草中外源基因的表达频率高于转基因水稻。T1代转基因烟草幼根的蛋白原位免疫杂交显示P-Lec正确定位于正在生长的幼根根毛的顶端，与对照豌豆中的P-Lec基因表达部位相一致。关于Parasponia血红蛋白基因，以前本实验室对转基因烟草和水稻的研究表明有转录水平的表达，国外实验室证实转基因烟草中有转译表达。 上述结果有可能为进一步研究转基因非豆科植物与根瘤菌的相互作用奠定一定的基础。

高赖氨酸蛋白基因的克隆及其转基因水稻植株的获得

水稻、玉米、小麦和大麦等许多主要禾本科作物的第一限制性氨基酸是赖氨酸。本文将一个来源于四棱豆的高赖氨酸蛋白基因导入水稻，以研究通过转基因改善蛋白质的可能，获得有经济价值和社会意义的转基因作物。 构建了含有高赖氨酸蛋白基因（Lys）、gus基因及植物选择标记潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）的植物表达载体pBRLys;在pBRLys中，该高赖氨酸蛋白基因由目前已知最强的单子叶植物启动子玉米Ubiquitin 1启动子调控。用基因枪轰击法将pBRLys导入水稻幼胚或幼胚诱导的愈伤组织。共得到36株潮霉素抗性再生植株，经分子检测有22株为转基因植株。 实验中对影响水稻转化、再生和移栽一些条件进行了研究。从潮霉素筛选浓度、愈伤组织干燥处理、光照对分化的影响、多效唑的影响和移栽环境等做了一些简化和改善。 PCR检测、PCR-Southern杂交和Southern杂交表明潮霉素基因和Lys基因已经整合到转基因水稻的基因组中，外源基因在转基因水稻基因组中以1个拷贝以上的形式存在。同时，GUS组织化学染色表明转基因水稻植株的叶、茎和根中都有gus基因的表达。 初步对5株转基因植株进行赖氨酸含量测定，结果表明：与非转化对照相比，有两棵植株赖氨酸含量提高，分别增加6.0%和12.4%。对更多抗性转化植株的分子检测、GUS分析和赖氨酸含量测定正在进行之中。

水稻OsRAA1基因的克隆与功能分析

FPF1（flowering promoting factor1）蛋白最早在白芥中研究发现是开花促进因子, 可能参与了赤霉素的信号传导途径。它可以和AP1和LFY蛋白协同作用，促进茎顶端分生组织向花分生组织转化。本论文将AtFPF1基因转化水稻，转基因水稻抽穗时间只有微弱的提前。然而异源表达AtFPF1却抑制了转基因水稻根的生长，促进了成苗根系的发达。这些表型类似于我们克隆的水稻OsRAA1 （Oryza sativa Root Architecture Associated 1）的功能。这是首次报道AtFPF1/OsRAA1在水稻中具有控制根系发育的功能 生物信息学分析表明水稻OsRAA1基因定位于水稻1号染色体，它编码的蛋白推测分子量为12kD和AtFPF1有58%的同源。通过RNA原位杂交和OsRAA1基因启动子调控GUS基因表达的模式，证实OsRAA1基因主要在根尖的顶端分生区和伸长区，根尖分支区和幼侧根的中柱，侧根的原基表达。同时在幼穗分支顶端，根茎结合区的边周维管束，稃片，花药与花丝的结合区也有表达。OsRAA1在玉米泛素启动子驱动下组成型表达，可以抑制水稻初生根的生长，促进不定根的形成，部分植物形成不同程度螺旋状的初生根。这些表型和野生型水稻用生长素处理的表型类似。OsRAA1组成型表达，在成苗阶段，特别是孕穗前，大大促进叶片伸长，并导致部分小花败育。光学镜检表明OsRAA1组成型表达的水稻的花丝伸长过快，部分小花花药萎缩败育。剑叶表面细胞电镜扫描表明，OsRAA1组成型表达的水稻剑叶的硅化细胞比对照植株要长。野生型水稻根系生长素处理的Northern杂交和OsRAA1基因启动子调控GUS基因表达的水稻生长素处理后GUS活性染色表明，OsRAA1基因的转录受生长素诱导。而且OsRAA1组成型表达的水稻根的向地性反应减缓。这些结果表明，OsRAA1可能参与了生长素的信号转导途径。 与此同时，从基因序列数据库中，在很多植物中寻找到很多表达片段和FPF1/OsRAA1基因同源。从已有报道和我们的结果表明，在植物中可能普遍存在一个受赤霉素和生长素调控FPF1/OsRAA1基因家族，调控着植物各个器官的发育。

拟南芥AST基因的精细作图

拟南芥ast (anthocyanin spotted testa) 突变体是由碳离子束诱导产生的与花青苷生物合成有关的突变体，受单隐性核基因控制。由于花青苷的异常积累，突变体未成熟种子的种皮呈现紫红色的斑点;野生型植株幼嫩的种皮没有花青苷的异常积累，呈淡绿色。初步作图分析表明，AST基因定位于拟南芥第I号染色体上，并且位于SSLP分子标记nga280和CAPS分子标记PAB5之间。 AST基因与SSLP分子标记nga280紧密连锁，遗传距离为3.2cM;与CAPS分子标记PAB5相距较远，遗传距离为21.1cM。 采用DDRT-PCR的策略，分析野生型与突变型植株未成熟角果中基因表达的差异。通过调整DDRT-PCR中总RNA、锚定引物、随机引物、cDNA和dNTP等关键试剂的用量，优化了适用于银染检测的DDRT-PCR方法。PCR扩增产物经6%变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳分离后，银染能检测到多而清晰的条带。泳道中的条带数最少为40个，最多达80个，平均为60个，条带大小分布在100bp-900bp范围，银染的灵敏度为5pg/mm2。此方法操作简便快速，灵敏度高，重复性好。采用这个改良的的方法，分析了拟南芥野生型和ast突变型植株未成熟角果中16,000个cDNA扩增产物条带，从中筛选出28个差异条带。二次PCR扩增后，进一步筛选出10个差异表达的cDNA条带，其中6个是野生型特异表达的，4个是突变型特异表达的。对这10个差异片段进行测序。BLASTN分析表明，这10个差异表达的cDNA片段与数据库中花青苷生物合成途径中的结构基因和调节基因序列没有同源性，表明用DDRT-PCR的方法克隆特定的AST基因有一定的局限性。 利用图位克隆（map-based cloning）的策略，对拟南芥AST 基因进行克隆。根据拟南芥数据库中的SNPs (simple nucleotide polymophisms) 序列和插入/缺失多态性（insertion/deletion polymorphisms）序列，设计了一系列分子标记。利用这些分子标记，对600个F2代有突变表型的植株进行重组子筛选，完成了对拟南芥AST基因的精细作图，成功地将AST 基因定位到BAC克隆T13M11上。初步确定该BAC克隆中的基因T13M11.8 可能是AST基因。该基因的DNA序列长1432bp，含有6个外显子和5个内含子，编码的蛋白与花青苷生物合成途径中的二氢黄酮醇4-还原酶有较高的同源性。功能互补实验正在进行当中。

利用转基因植物生产生物可降解塑料(PHB)的研究

聚 3 一控基丁酸酯 (Poly – 3 - hydroxybutyrate,PHB) 及其它类型的聚 3-泾基链烷酸醋同属于聚酯类物质 , 是自然界中多种细菌的碳源及能源储备物。这种聚酯的物理化学特性与传统塑料相似 , 并具有生物可降解性 , 如能取代化学合成塑料将减少环境中的塑料废弃物 , 从源头治理 " 白色污染 " 问题。微生物发酵法生产的 PHB 价格过高 , 无法在市场上与化学合成塑料竞争。随着分子生物学的发展 , 人们逐渐将视线转向植物生物反应器。转基因植物能够利用二氧化碳为碳源、太阳能为能源合成目的产物 , 大大降低生产成本 , 为生产具有市场 竞争力的新型生物可降解塑料提供可行途径。在此领域虽然己取得一定进展 , 但远未达到商业化生产水平。大规模商业化生产要求转基因植物能够在确保环 境安全性的前提下高效、稳定地生产 PHB 。本文尝试改善植物中 PHB 的生产体系 ,为环保型塑料早日进入市场作出努力。 1. 由于表达框架中多次使用同一启动子会导致基因沉默 , 本文克隆了另一 种子特异性启动子 nap300, 以替换重复使用的7S启动子,减轻“共抑制”。将 nap300 与 GUS 基因相连进行功能鉴定。荧光检测和组织化学染色的结果都证明此仅 30Obp 的 DNA 序列足以调控基因进行种子特异性表达。尽管 B 盒作为 高度保守区在种子特异性表达中起重要作用 , 位于此处的两个碱基替代型突变 并未使 nap300 的活性明显降低 , 对启动子的时空表达模式也无明显影响。将 nap300 、 7S 分别与 phbA 基因 ( 编码 3-酮硫裂解酶) 相连 , 在相似表达环境中 对二者功能进行比较 , 发现两个启动子表达模式基本相同并在同一时期达到活 性高峰 , 因此 nap300 可用于改善 PHB 合成基因在植物体内的表达调控。通过 对种子特异性启动子的比较可加深对其表达模式的了解 , 为植物基因工程中的 精细调控提供依据。 2. 叶绿体基因工程是随着植物遗传转化技术发展刚刚兴起的生物技术 , 具 有超量表达外源基因 , 为原核基因提供适宜表达环境 , 消除 “位置效应”和基因沉默 , 环境安全性好等优点 , 较更适合用于植物生物反应器方面的研究。本研究在国内率先探讨将叶绿体转化技术引入植物生产生物可降解塑料这一领域 的可行性 ( 国外仅有日本一例 ), 构建了叶绿体转化及表达载体 pTRV-PHB, 通过基因枪法将 PHB 合成相关基因导入烟草叶绿体基因组。转基因烟草顺利达到同质化，其形态和生长发育均无异常。 Northern 点杂交检测表明与 PHB 合成相关的三个基因均能在转录水平表达 , 未出现核转化中经常发生的“基因沉默”现象。通过 RT-PCR 进一步检测表明叶绿体型转基因烟草中目的基因的表达水平明显比核转化植株中相应基因的表达水平高。气相色谱分析确证转基因植株具有合成 PHB 的能力。这些都表明叶绿体转化适合用于转基因植物生产 PHB的研究。虽然叶绿体型转基因烟草中产物含量偏低 , 并未达到预期结果 , 但经进一步改进与完善 , 终将会成功地用于生产高附加值产品的植物基因工程中。 3. 为初步探讨叶绿体转化中在同源重组反应介导下整合外源基因的机理 , 从油菜叶绿体基因组中分离两段序列作为同源片段 , 基因枪法转化烟草 , 结果显示即使供体所含同源片段与受体叶绿体基因组相应区域差异高达 10%, 转化效率也无降低。这一现象的发现有助于促进“通用载体”　的改进 , 扩展叶绿体转化受体范围乃至达到商业化应用水平。 4. 成功地通过二次转化获得整合并表达多基因的转基因烟草 , 缩短了研究周期 , 对相关转基因植物的研究有一定参考价值。本文还优化了油菜转化体系 , 使转基因油菜同时整合三个 PHB 合成相关基因的效率由 7.69% 增加至 16.0% 。 田间试验与产物分析正在进行中。

小麦春化相关基因元件克隆分析与小麦矮化突变体的研究

一、 春化相关基因全长cDNA序列及其启动子的克隆与分析研究 通过建立小麦（Triticum aestivum. L. cv Jingdong No.1）胚芽春化cDNA文库，以春化相关基因VER2的3’端序列为探针，筛选获得全长1195 bp cDNA序列，它编码300个氨基酸。在VER2中存在植物疾病抗性反应蛋白和茉莉酸诱导凝集素两种蛋白的结构域。另外在VER2蛋白中存在核定位信号和多种磷酸酶的作用位点，VER2可能参与了多种调控途径。 以VER2基因的cDNA为探针，利用改进的池式PCR以及高密度膜杂交筛选的方法，从小麦TAC基因组文库中获得41,788 bp的基因组克隆，该序列含有11个基因，其中VER2基因位于第三个基因。VER2基因组序列含有3个内含子，4个外显子与cDNA序列100%同源。通过对转录起始点和转录终止点的分析，进一步证明从cDNA文库筛选得到的VER2基因为全长序列。 对VER2基因的上游启动子区域进行分析，发现基因上游启动子区存在三个小的重复序列，每个片段有482 bp，另有两个较大的重复序列，每个片段有2,161 bp。对上游2.8 kb启动子区（不含重复序列）的响应元件分析，其包括ABA响应元件（ABRE）、茉莉酸甲酯响应元件（Me-JARE）、胚乳特异性表达元件、参与淀粉酶合成的元件以及存在类似GA响应元件（ATAACAAAC）如ATAACATAC等等。根据VER2基因上游6 kb序列结构特点，将VER2启动子区域进行缺失突变形成10个片段，分别以GUS和GFP为报告基因构建成瞬间表达载体和植物表达载体等四类质粒。通过基因枪方法将最大片段（6 kb）驱动GFP报告基因的瞬间表达载体转入经春化处理或未春化处理的小麦幼叶中，结果发现GFP在春化处理的幼叶中表达，而在未春化处理的幼叶中不表达，说明VER2基因的启动子驱动基因转录受春化处理调控。 二、 小麦矮化突变体的研究 通过对小麦矮化突变体gaid遗传生理分析发现该突变体为半显性阻断GA信号途径，由此发现在赤霉素信号途径中，α-淀粉酶的诱导一定程度上通过某些与株高相关的基因控制。突变体gaid呈现对高浓度的脱落酸更敏感，当ABA浓度达到10-6M时，突变体的生长几乎完全受到了抑制，而野生型的生长需要ABA浓度达到10-5M时才能完全受到抑制。通过突变体gaid对乙烯等抑制型生长调节剂的响应实验研究，首次提出GA调控植物伸长生长存在两条信号途径，即GA基础水平信号途径（GA basal level signaling pathway）和GA正常水平信号途径（GA normal level signaling pathway），而乙烯以及高浓的GA合成抑制剂（如PAC）是通过第一条途径（GA基础水平信号途径）起作用。光形态建成中对植株生长的抑制作用存在独立于GA的信号途径。 突变体gaid的根系在强光照（63.5 Es-1m-2）和培养基内（低氧）的生长条件下，表现出弯曲、变短、加粗等异常性状，而随光照强度的减弱，这种根系异常生长的表型也减弱，在暗培养中则完全消失，但无论在哪种环境条件下，相对野生型对照而言，突变体的种子根短、侧根少。低浓度的ABA（10-8M）可以恢复突变体gaid根系在强光低氧条件下的正常生长发育。然而利用IAA及其极性运输的抑制剂（TIBA）、乙烯生物合成前提物（ACC）及合成抑制剂（AOA）处理突变体gaid，并没有发现突变体根系的生长发育得到恢复。 突变体gaid可能是一个新的属于小麦GA信号途径中的负调控基因（GAID）发生了突变或超表达，导致其负调控作用增强，呈现半显性的矮化突变。在与另一已知小麦GA信号途径中的负调控基因RHT的关系研究上发现，GAID可能对RHT蛋白磷酸化后的降解途径起抑制作用。通过双向电泳发现突变体gaid与野生型对照（京冬1号）在生长过程中存在差异蛋白，这将有助于对GA信号途径分子机理的深入研究。

烟草NtFtsZ2-1基因在叶绿体分裂中的作用机制研究及NtFtsZ1-2基因启动子的克隆

根癌农杆菌通过将一段含有“癌”基因的T-DNA导入植物基因组中，引起植物的肿瘤：冠瘿。根癌农杆菌的这种能力来源于Ti质粒（Tumor inducing plasmid）。遗传工程中，根癌农杆菌的这一特性被用来将连接入Ti质粒T-DNA区两个边界之间的外源基因转入植物基因组。随着植物分子生物学的发展，T-DNA转化的原理被进一步阐明，农杆菌介导的转基因技术也得到进一步优化，更适合遗传工程操作。特别是Ti质粒毒性区和T-DNA区的反式作用（即位于不同质粒的T-DNA和毒性区也能侵染植物）被发现以来，双元表达载体的构建使遗传工程操作大为简便。 常用的双元表达载体大小都在11kb以上，尽管远远小于几百kb的野生型Ti质粒，但在实际的体外操作中还是不够简便。常用的植物双元表达载体pBI121的基因序列被测定（Frisch et al.，1995），数据显示非T-DNA区一半以上的序列被发现和功能无关，这使双元载体的进一步缩小成为可能。本文即通过PCR方法克隆到pBI121非T-DNA区中载体复制、三亲杂交必需的片段，结合载体pART27中的T-DNA区（含有真核、原核表达活性的嵌合npt II基因）创造了小的合成型植物表达双元载体pSY1（小于7kb）。然后将pBI121上带有35S启动子和nos终止子的GUS基因克隆到pSY1的T-DNA区中，得到pSY2（约10kb）。进一步用pROK2上的35S启动子和nos终止子区替换pSY2上的GUS表达区，得到pSY3（约8kb）。通过三亲法将pSY2转入根癌农杆菌中，根癌农杆菌再通过叶盘法侵染烟草叶片，获得愈伤组织，愈伤组织进一步分化出小苗。GUS组织化学染色表明GUS基因在转基因的愈伤组织和小苗中均有表达，PCR检测也证明GUS基因被导入了植物基因组。pSY系列载体能成功的用于植物遗传转化。

I.小麦非叶器官碳酸酐酶活性与定位分析II.镉毒害导致芦苇胚性细胞死亡的激素调控研究

第一部分： 通过生理测定和化学染色分析了冬小麦品种小堰54和京411的叶片和非叶片组织的碳酸酐 酶活性。叶片碳酸酐酶活性(CA)在挑旗时期达到最大值，之后减少到最小，而在饱粒期又呈 增加趋势。从灌浆期到饱粒期，颖片和内稃的CA活性均减少，而外稃和种皮的CA活性均增加。在饱粒期，小堰54的叶片、颖片、外稃和种皮CA活性均高于京411。组织化学染色表明，CA主要分布在旗叶的叶肉细胞叶绿体中，也分布在非叶片组织颖片、外稃和内稃的叶肉和维管束鞘细胞的胞质中。这些结果表明，小麦非叶组织叶肉和维管束鞘细胞的胞质中的CA可能对饱粒期冬小麦的C4光合途径起作用。饱粒期小堰54的C02传递到Rubisco酶速率和抗旱性较京411高。 第二部分： 以继代培养的芦苇胚性细胞为材料，利用台盼兰拒染法检测了悬浮细胞死亡过程，并利用石蜡切片法及苏木精染色法观察了不同浓度镉对芦苇细胞的毒害作用。1000μM的CdCl2迅速导致芦苇悬浮细胞死亡，200μM的CdClz在接种后第5天引起悬浮细胞死亡，100μM的CdCl2在接种后第7天引起悬浮细胞死亡，≤50μM的CdClz在接种后7天不引起悬浮细胞死亡。同时对不同浓度镉处理的芦苇胚性细胞的内源植物激素和可溶性蛋白质进行分析，≤50μM的镉浓度显著地降低胚性细胞内IAA、ZR、GA3和GA4的含量，却提高ABA的含量，抑制可溶性蛋白质的合成：≥100μM的镉浓度显著地提高IAA、ZR、GA3和GA4的含量，却降低ABA的含量，促进可溶性蛋白质的合成。这些结果表明，镉的毒害至少包括镉浓度决定的两种细胞死亡机制，高浓度的镉(1000μM)引起的细胞死亡应当为坏死，而100μM的镉引起植物悬浮细胞发生程序性死亡。在较高浓度(≥100μM)的镉处理下，芦苇细胞内内源IAA、ZR、GA3和GA4的浓度较高，可能调控可溶性蛋白质的合成而促进细胞发生程序化死亡。

利用反义RNA技术进行木质素生物合成调控的研究

木质素是一类酚类次生代谢产物，在植物体内行使重要的生理功能，但它却是形成造纸污染的主要来源。利用基因工程手段，在分子水平调节木质素的生物合成，降低木质素的含量或改变组分以培育适合造纸的植物原料树种具有较大的应用价值和环保效益。本研究利用反义RNA技术，主要围绕木质素合成三种相关酶咖啡酸-O-甲基转移酶（COMT）、咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)、4-香豆酸：辅酶A连接酶（4CL）的基因对植物木质素生物合成途径调节的研究，取得如下进展： 1.农杆菌介导法将COMT和CCoAOMT基因的单价和双价的反义表达载体导入烟草，比较了两个甲基化酶的功能。PCR-Southern和Northern点杂交结果表明反义基因已整合到烟草基因组DNA上，并在转录水平表达。两种反义基因对木质素生物合成调节的效果显示，CCoAOMT能更有效地调节木质素生物总量的合成，COMT仅特异调节S木质素的合成。表达反义CCoAOMT基因的转基因毛白杨，内源CCoAOMT基因的表达在转录和蛋白水平均受到抑制，最终引起转基因植株木质素含量普遍降低，最多降低达26.20%，筛选出木质素含量下降10%以上的转基因毛白杨株系8个，为源头治理造纸废水污染奠定了基础。 2． 对克隆的4CL基因进行了表达特性分析， RT-PCR分析表明，分离的毛白杨4CL基因主要在木质部丰富表达，叶中表达量较少，树皮中不表达。在毛白杨的一个生长季，该基因表达显示明显的双锋特征，该表达模式与木材早材和晚材的发育时期相吻合，表明分离的毛白杨4CL基因与木质素的生物合成密切相关。农杆菌介导法将反义4CL基因导入烟草和毛白杨，利用分子生物学检测手段对转化植株进行筛选，获得批量转基因植株。Klason木质素含量测定分析表明，抑制内源4CL基因表达，能有效降低转基因植物中的木质素含量，且不影响植株正常生长和发育以及碳水化合物的合成。转基因毛白杨的茎杆上一些区域呈红棕色，颜色的深度与转基因毛白杨木质素含量的下降幅度呈一定的正相关性，颜色变化可作为转基因植株筛选的一个辅助指标。现已获得木质素含量下降10%以上的转基因株系3个，最多下降达41.73%，可供中试与制浆实验，为培育低木质素环保型毛白杨提供理论与实践依据。 3.为了优化现有的表达框架，使目的基因更有效地调节木质素的生物合成，应用PCR技术从毛白杨基因组中分离得到C4H(肉桂酸4—羟基化酶)基因启动子片段（GenBank注册号：AY351673）。GUS荧光活性分析和组织化学染色显示，该启动子在一些木质化的组织和器官中特异表达，随着组织成熟度和木质化程度的增加，表达活性逐渐增强，并且该启动子受伤诱导。反义CCoAOMT基因在C4H启动子的调控下，会引起转基因烟草木质素均有不同程度的减少，但不影响碳向碳水化合物的转换合成，对植物的生长发育也无明显负效应。这些结果证明了从毛白杨中分离的C4H 启动子可以应用于造纸原料树种材性改良的遗传工程操作。 4．首次从水稻中华10号（Oryza sativa L. ssp. japonica）分离了CCoAOMT基因家族的三个成员，对其基因结构及表达特性的分析表明，该基因家族的三个成员与水稻的木质化进程关系密切，研究结果有助于了解单子叶植物中的甲基化途径发生机制，为高产水稻抗倒伏和茎杆饲料作物的遗传改良奠定了基础。