甘蓝(Brassica oleracea L. var. capitata L.)富集铊的环境地球化学研究

通过对甘蓝进行品种差异、亚细胞分析、根际分泌物提取污染土壤中的铊、营养元素添加以及野外甘蓝样品采集分析，结合地球化学理论。分析了甘蓝对铊吸收富集的机理，并得出以下几点结论： (1) 甘蓝叶、根及茎对铊的吸收存在着明显差异，表明在面临土壤铊胁迫时，叶是铊的主要储存部位，而根和茎主要起到了转运作用。甘蓝中铊含量的升高导致了对钙和镁吸收能力的提高。不同品种甘蓝之间的吸收能力差别不大，通过选择种植对铊吸收能力小的甘蓝来控制铊的食物链危害是不可行的。此外，还应该避免在高铊土壤地区种植甘蓝。 (2) 高达92%的铊存在于甘蓝叶细胞液组分中，表明细胞液组分是铊在甘蓝叶细胞中的一个重要储存部位。但是在不同品种甘蓝叶中，铊的亚细胞分布形态没有显著差异，在甘蓝面对铊胁迫时，其叶细胞器组分中铊含量始终维持很低的含量。甘蓝对铊的解毒机制很可能就是通过在细胞内的区隔化作用(compartmentalization)，把进入体内的铊结合到细胞液组分以及细胞壁上，从而减少了铊对重要细胞器官的损伤。铊在甘蓝叶各亚细胞组分中的分配与常量元素存在一定的关系。在甘蓝叶细胞内，Tl+往细胞液组分中的传输很有可能是通过Na+/K+/2Cl–联合传输机制、Ca2+活化的钾离子通道以及一些需Mg2+或Mn2+的K+活化酶完成的。需要Mn2+参与的K+活化酶可能对于铊往细胞器中的转移起到了主导作用。在细胞壁中，很可能Ca2+活化的K+通道或者是某些特定的需要Mn2+的K+活化酶对铊的迁移或固定起了影响作用。 (3) 随着氮、磷、钾营养元素的加入，甘蓝地上部的生物量有一定程度的上升。影响主次因素依次均为氮>磷>钾。随着氮、磷、钾营养元素的加入，甘蓝地上部和地下部的铊含量并没有上升，而是有一定程度的下降。甘蓝地上部中铊含量的影响主次因素依次为磷>氮>钾，甘蓝地下部中铊含量的影响主次因素依次为氮>磷>钾。氮、磷、钾营养元素的加入都提高了甘蓝对铊的吸收量。甘蓝对铊吸收量的影响主次因素依次均为氮>磷>钾。因此我们认为，氮，磷，钾的加入显著提高了甘蓝生物量和铊的吸收量，但是随之而来的生物稀释效应，导致了甘蓝地上部和地下部含量的降低。运用铊累积量来判断营养元素对甘蓝吸收铊的影响更为客观和可靠。 (4) 通过对比蒸馏水和根际分泌物提取液对污染土壤中铊的提取能力，发现甘蓝根际分泌物提取液(root exudates)对污染土壤中的铊具有明显的活化作用。提取液的pH和土壤铊的提取率存在一定的正相关(R2=0.1659)，也就是说提取液的pH与其对污染土壤中铊的提取能力成正比。但是甘蓝体内各部分铊含量与其根际分泌物提取液对土壤铊的提取率没有任何关系，表明大量的植物非必需元素铊进入甘蓝后，并没有对其根际分泌物的产生任何影响。土壤pH越高，生长的甘蓝的根际分泌物提取液对土壤提取率就越高，甘蓝分泌物提取液对铊的提取率升高可以补偿由于土壤pH升高而造成的水溶态存在的铊减少。 (5) 铊在甘蓝叶片和叶柄中的分布状况为老叶叶片>新叶叶片>老叶叶柄>新叶叶柄，表明叶柄也是运输铊的一个重要器官。但是叶柄对铊的转运能力并没有茎那么强烈，而叶片才是甘蓝中最主要的铊储存部位。铊在根、茎、老叶和新叶中亚细胞的分布均为细胞液>>细胞壁>细胞器，这和前期室内温室培养甘蓝叶片中的分布结果是一致的。根据植物采矿经济理论的计算结果，很显然甘蓝可以成为土壤铊污染的植物修复和采矿的备选对象。

青花菜原生质体培养和根癌农杆菌介导的遗传转化

从4-5天龄青花菜(Brassica oleracea var．italica)下胚轴游离原生质体，经纯化后培养在简化的KMsP培养基上，原生质体分裂形成了细胞团;同时，对影响外源DNA导入子叶和下胚轴原生质体后瞬间表达强度的若干因素作了较详细的研究，这些因素包括转化介质中二价阳离子的种类和浓度、PEG溶液的浓度以及PEG溶液的pH值， 为进一步进行原生质体水平上的细胞遗传转化创造了条件。 以青花菜(Brassica oleracea var．italica)子叶和下胚轴为外植体材料，进行了根癌农杆菌介导的遗传转化研究。在建立了子叶和下胚轴外植体组织培养的高频率植株再生系统的基础上，用携带有双元载体质粒的根癌农杆菌(Asrobacterium,tumefaciens)A208sE感染青花菜子叶和下胚轴，对根癌农杆菌的感染过程以及影响抗性芽分化频率的诸多因素作了详细研究，再生了具有卡那霉素抗性的完整转化植株。Dot Blot分析表明NPTⅡ酶活性的存在;以pROA93经EcoRI /HindⅢ酶切产生的gus基因片段(约2.6Kb)为探针进行Southern Blot分子杂交，结果表明gus基因已整合到植物细胞基因组中，并且得到了表达。

分子标记技术在甘兰型杂交油菜育种上的研究与应用

本文应用RAPD分标记技术对我国重要的油料作物“杂油59”杂种种子的Fl代杂种的纯度进了技术鉴定，并完善了这一技术，摸索出这一适合于目前生产应用的实用方法，填补了这一技术在油菜作物应用上的空白。用RFLP技术对我国重要的雄性不育材料“陕2A”细胞质进行了分子水平的鉴定，为证明“陕2A”是一类新型的雄性不育材料提供了重要的实验证据。 对甘蓝型油菜采用DNA快速提取法、酚仿法和CTAB法应用于不同的分子标记分析，实验结果显示： CTAB法适用于样品量大，纯度要术高的RFLP技术，酚仿法适用于引物筛选、DNA模板用量大的PCR反应，而快速提取法特别适合于生产上对种子纯度检测，是生产上推广前景很好的实用技术。 对甘蓝型油菜RAPD技术应用当中PCR体系的建立进行了探讨。实验结果显示：热启动对PCR结果的影响至关重要。而Mg++浓度、dNTP浓度、模板浓度、Tag酶用量对反应结果有不同程度的影响。经过反复实验：当PCR各组分按Mg++，2mM;dNTP，200uM;模板浓度，50ng - lOOng时，PCR的结果最好。PCR反应条件经反复实验后确定为：第一个循环：（热启动）94℃，Imin20sec．OoC 2min循环一次;第二个循环：（解链）94℃ 50sec，（退火）40℃ Imin30sec;（延伸）72℃lmin;循环40次。第三个循环：72℃lOmin，循环1次。反应总体积为20ul时最为适用。 用40个lOmer的RAPD随机引物对“杂油59”的2个亲本“垦C8”和“陕3A” 进行RAPD分析，共出现290条带，分布于3530-220bp之间。引物opA-06、opK-03、opK-13、opj-12出现阳性扩增。经重复实验后确定： opK-03的PCR结果重复性最好，该引物序列为：CCAGCTTAGG。用它对两个亲本进行RAPD分析，PCR结果共出现9条带，其中510bp、260bp为二条特征带。在Fl代中这两条特征带重现性很好。用50个商品用种萌发的F1单株进行验证，检测结果为3个个体没有出现510bp的特征带，4个个体没有出现260bp的特征带，有5个个体出现了其它带，纯度为78%，与生产用种的纯度相符。 通过对“杂优59”不同生育时期及不同取样部位作酯酶同工酶电泳方法与RAPD方法相比较，结果显示：RAPD方法可以弥补同工酶方法的缺限。由于它是基于基因水平的分析技术，可以不受环境条件、发育时期、取材部位等客观条件的限制，并具有取样量小、易操作、费用低、灵敏度高、可以检测出亲缘关系相当近的种闾或种内的材料，具有独到的优点。是值得今后在生产上推广的新技术。 用6个雄性不育材料线粒体的特异探针：ALXR 18（线粒体ATPaseα亚基）;COB 640(脱辅基细胞色素-b);COX -I（细胞色素氧化酶亚基-I）;COX -Ⅱ（细胞色素氧化酶亚基-II;PDC - 12（胡萝卜线粒体随机片断）;C2（玉米线粒随机片断），对“陕2A”，Hybrides Polima，Ogura NSL 94/96, Ogura MLCH036, Ogura NSL, Polima, Fu27,Fu38, Anand等9个材料进行RFLP分析，结果显示：用限制性内切酶EcoR I消化后的DNA与探针COB 640杂交，“陕2A”材料在4.5 kb处缺失，与ALXR 18探针杂交，在4.4 kb、4.2 kb处也明显缺失，证明“陕2A”显然不同与其它不育材料。用ALXR l8为探针，与用内切酶Nc01的酶切片断作Sourthern杂交，在RFLP谱带上6.1 kb、2.4 kb、2.5 kb处明显缺带，进一步为“陕2A”是一种新型的甘蓝型油莱雄性不育系提供了证据。

转基因植物生产生物可降解塑料PHB的研究-phbA功能鉴定、多价表达载体的构建及转基因植物的获得

聚-β-羟基链烷酸（PHA）是许多微生物作为碳源、能源的一类贮藏性聚酯，具有广泛的应用价值。该聚酯可被微生物完全降解且有与塑料相似的性质，因而研究并提高PHA在植物中的合成为解决环境污染提供了新的解决途径。 聚-β-羟基于酸酯（PHB）是研究的最早、研究的最清楚的一种PHA。用聚合酶链式反应扩增并克隆了真养产碱杆菌（Alcaligenes eutrophus）中合成PHB的一个关键酶——3-酮硫裂解酶基因phbA。DNA序列分析表明所克隆的基因与国外报道序列同源性很高，只有一个碱基对的区别。为了检测该基因的功能及导肽的定位效率，构建了带有导肽基因的组成型表达载体，由根癌农杆菌介导转化烟草（Nicotiana tabacum cv. Wisconsin 38）得到转基因植株。蛋白质电泳结果表明导肽可以将外源蛋白定位于质体，phbA基因能翻译成相应大小的蛋白。酶活性分析证实了转基因烟草中phbA编码的3-酮硫裂解酶可以催化乙酰-CoA合成乙酰乙酰-CoA。 将携有导肽序列的phbC（编码PHB合酶）和phbB（编码乙酰乙酰-CoA还原酶）连入pBIB-HYG得到组成型表达载体pZCB，用冻融法转入根癌农杆菌，介导转化烟草。烟草为已获得的具有卡那霉素抗性整合并表达phbA的转基因烟草。通过二次转化将携有潮霉素抗性的phbB基因和phbC基因导入已整合phbA的烟草，各基因均由质体导肽控制，最后得到整合PHB合成的三个酶基因的转基因烟草。转基因烟草经PCR、PCR-Southern检测，初步确定整合phbB和phbC烟草植株。以气相色谱初步分析，转基因烟草中PHB的含量可达鲜重的0.233%。 结果表明phbB和phbC基因可以在真核表达系统中编码相应的蛋白。通过色素分析、荧光动力学等手段分析了PHB在叶绿体中的累积对其功能的影响。 为了提高底物乙酰-CoA的供应能力及减少惰性聚酯对植物体的伤害，分离了种子特异性启动子和质体导肽序列，利用忆经克隆的合成PHB的三个关键酶基因，通过一系列DNA重组，分别构建了含有种子特异性启动子的嵌合phbC、phbB的二价表达载体pSCB及嵌合phbC、phbA、phbB的三价表达载体pSCAB，并由导肽将基因表达产物定位于质体。经根癌农杆菌介导转化油菜（Brassica napus L.) H165，获得转基因油菜植株，并进行了PCR、Southern blot及RT-PCR-DNA杂交等分检测。结果表明，三基因已经分别整合到相应的转基因油菜中，并已在转录水平表达。同时转化了油菜不育系、恢复系和保持系，获得批量转化株，并移入温室栽培。

利用转基因植物生产生物可降解塑料(PHB)的研究

聚 3 一控基丁酸酯 (Poly – 3 - hydroxybutyrate,PHB) 及其它类型的聚 3-泾基链烷酸醋同属于聚酯类物质 , 是自然界中多种细菌的碳源及能源储备物。这种聚酯的物理化学特性与传统塑料相似 , 并具有生物可降解性 , 如能取代化学合成塑料将减少环境中的塑料废弃物 , 从源头治理 " 白色污染 " 问题。微生物发酵法生产的 PHB 价格过高 , 无法在市场上与化学合成塑料竞争。随着分子生物学的发展 , 人们逐渐将视线转向植物生物反应器。转基因植物能够利用二氧化碳为碳源、太阳能为能源合成目的产物 , 大大降低生产成本 , 为生产具有市场 竞争力的新型生物可降解塑料提供可行途径。在此领域虽然己取得一定进展 , 但远未达到商业化生产水平。大规模商业化生产要求转基因植物能够在确保环 境安全性的前提下高效、稳定地生产 PHB 。本文尝试改善植物中 PHB 的生产体系 ,为环保型塑料早日进入市场作出努力。 1. 由于表达框架中多次使用同一启动子会导致基因沉默 , 本文克隆了另一 种子特异性启动子 nap300, 以替换重复使用的7S启动子,减轻“共抑制”。将 nap300 与 GUS 基因相连进行功能鉴定。荧光检测和组织化学染色的结果都证明此仅 30Obp 的 DNA 序列足以调控基因进行种子特异性表达。尽管 B 盒作为 高度保守区在种子特异性表达中起重要作用 , 位于此处的两个碱基替代型突变 并未使 nap300 的活性明显降低 , 对启动子的时空表达模式也无明显影响。将 nap300 、 7S 分别与 phbA 基因 ( 编码 3-酮硫裂解酶) 相连 , 在相似表达环境中 对二者功能进行比较 , 发现两个启动子表达模式基本相同并在同一时期达到活 性高峰 , 因此 nap300 可用于改善 PHB 合成基因在植物体内的表达调控。通过 对种子特异性启动子的比较可加深对其表达模式的了解 , 为植物基因工程中的 精细调控提供依据。 2. 叶绿体基因工程是随着植物遗传转化技术发展刚刚兴起的生物技术 , 具 有超量表达外源基因 , 为原核基因提供适宜表达环境 , 消除 “位置效应”和基因沉默 , 环境安全性好等优点 , 较更适合用于植物生物反应器方面的研究。本研究在国内率先探讨将叶绿体转化技术引入植物生产生物可降解塑料这一领域 的可行性 ( 国外仅有日本一例 ), 构建了叶绿体转化及表达载体 pTRV-PHB, 通过基因枪法将 PHB 合成相关基因导入烟草叶绿体基因组。转基因烟草顺利达到同质化，其形态和生长发育均无异常。 Northern 点杂交检测表明与 PHB 合成相关的三个基因均能在转录水平表达 , 未出现核转化中经常发生的“基因沉默”现象。通过 RT-PCR 进一步检测表明叶绿体型转基因烟草中目的基因的表达水平明显比核转化植株中相应基因的表达水平高。气相色谱分析确证转基因植株具有合成 PHB 的能力。这些都表明叶绿体转化适合用于转基因植物生产 PHB的研究。虽然叶绿体型转基因烟草中产物含量偏低 , 并未达到预期结果 , 但经进一步改进与完善 , 终将会成功地用于生产高附加值产品的植物基因工程中。 3. 为初步探讨叶绿体转化中在同源重组反应介导下整合外源基因的机理 , 从油菜叶绿体基因组中分离两段序列作为同源片段 , 基因枪法转化烟草 , 结果显示即使供体所含同源片段与受体叶绿体基因组相应区域差异高达 10%, 转化效率也无降低。这一现象的发现有助于促进“通用载体”　的改进 , 扩展叶绿体转化受体范围乃至达到商业化应用水平。 4. 成功地通过二次转化获得整合并表达多基因的转基因烟草 , 缩短了研究周期 , 对相关转基因植物的研究有一定参考价值。本文还优化了油菜转化体系 , 使转基因油菜同时整合三个 PHB 合成相关基因的效率由 7.69% 增加至 16.0% 。 田间试验与产物分析正在进行中。

甘蓝型油菜中脯氨酸积累的分子调控机制

　　渗透胁迫下植物中游离脯氨酸的积累被普遍认为对植物有保护作用。本文对甘蓝型油菜（Brassica napus）中的脯氨酸积累及其调控机理进行了研究。正常生长条件下幼苗叶中脯氨酸含量最高，根中脯氨酸含量最低，盐胁迫后不同部位脯氨酸积累程度相近。盐浓度200 mM起，幼苗开始有明显脯氨酸积累,并随着浓度的增加而增加。PEG处理后脯氨酸积累要明显高于ABA和盐胁迫处理后脯氨酸积累。在成株中，生殖器官中脯氨酸含量明显高于营养器官中脯氨酸含量。 　　我们克隆了编码Δ1-二氢吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）,鸟氨酸转氨酶(OAT)和脯氨酸脱氢酶(PDH)的四个基因的cDNA。通过Southern杂交检测P5CS基因在甘蓝型油菜及其亲本白菜型油菜和甘蓝中的拷贝数，发现杂交条带在4倍体油菜中并没有显著的多于其两个2倍体亲本，推测有可能是在物种进化的过程中发生了基因丢失。 　　利用实时定量PCR的方法检测了渗透胁迫下甘蓝型油菜中BnP5CS，BnOAT和BnPDH等基因的表达水平。在ABA处理，盐处理和干旱处理时，BnP5CS1和BnP5CS2的表达在脯氨酸积累开始前就开始有明显上调，但是BnP5CS1的上调水平要比BnP5CS2高许多。BnOAT在ABA处理后表达水平没有太大的变化，在盐胁迫后甚至有一点下调，在干旱处理后却表现为一定程度的上调。另一方面，BnPDH的表达在ABA处理，盐胁迫和干旱胁迫后都受到了抑制。在成株不同器官相关基因表达的研究中发现，BnOAT在叶中表达量最高，BnP5CS和BnPDH在花蕾和花中的表达水平都比其他器官中要高。 　　我们的结果说明，渗透胁迫下甘蓝型油菜中的脯氨酸积累是脯氨酸合成途径的诱导和脯氨酸降解途径的抑制共同作用的结果。在轻度的渗透胁迫下，谷氨酸合成途径占主导地位，而在较为严重的渗透胁迫后期，谷氨酸合成途径和鸟氨酸合成途径共同起作用。甘蓝型油菜生殖器官花和花蕾中脯氨酸的代谢非常旺盛，说明脯氨酸可能在花发育中起着一定的作用。

油菜内源和外源蛋白的表达及环境因素的影响

植物与昆虫的互作关系是个长期进化的过程，虫害给农业生产带来巨大损失。本研究以甘蓝型油菜（Brassica napus）为例，研究了不同环境条件和遗传背景下外源基因的表达与效用，同时利用蛋白质组技术，研究了虫害损伤模拟条件下植物可能存在的内源抗性机制。甘蓝型油菜中转入了人工合成的Bt（Bacillus thuringiensis）杀虫基因，能使植物产生抗虫蛋白抵御虫害。我们在湖北湖南两个实验点进行了大田实验，按植株生长发育的4个不同时期从转基因植株的叶片上采样，研究抗虫蛋白在植物体内的表达动态。植株顶部第三片展开叶的Bt毒蛋白浓度在结荚期前随植物生长而不断增加，而在结荚期出现或增或减的现象。采样叶片的可溶性总蛋白浓度含量一直呈增加的趋势，直到结荚以后出现含量的明显降低。同时，收集了转基因油菜与湘油15号在田间自然杂交形成的杂交后代种子用于栽培，用GFP仪检测杂交后代的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein），并用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）检测并确认带有转基因的杂交植株。为了检测带有转基因的杂交后代油菜中Bt毒蛋白的杀虫效率，用对Bt毒蛋白敏感的试虫品系——初孵棉铃虫幼虫（Helicoverpa armigera）进行杀虫活性检测实验。结果表明，携带Bt基因的杂交湘油及其转基因亲本对试虫的体重增长量均产生了负面影响，可以推断在调查取样的植株生长发育阶段，转基因杂交后代与其转基因亲本植株的杀虫效率没有显著差异。转基因植物及其杂交后代中抗虫蛋白的持续表达及田间带有转基因的自播植物的出现会使害虫产生耐受抗性的潜在可能性增加。 相对于人为增加的抗虫基因，植物在长期对抗昆虫的过程中也进化形成了自我防御机制，能够产生特异的抗性蛋白来应对昆虫的取食。本研究用机械损伤模拟害虫取食，对比了油菜受到物理损伤前后可溶性总蛋白的含量变化并试图通过蛋白质组学技术来检测可能发生变化的蛋白质。Bradford定量测定发现，同一植株同一叶片损伤前后可溶性总蛋白含量差异显著，损伤后蛋白表达量显著增高。蛋白质组双向凝胶电泳及其差异分析显示，损伤前后有8个蛋白质点发生明显的上调或下调。选择其中2个差异蛋白点经过MALDI-TOF质谱鉴定，它们分别是Rubisco小亚基前体以及果糖－1，6－二磷酸醛缩酶和粪卟啉－3－氧化酶的混合物，这些蛋白质在其他植物的抗逆研究中也有报道，它们可能在油菜叶片应答机械损伤过程中对维持植物的生理功能也有重要作用。

猪粪农用的生态风险——以东北黑土为例

集约化养殖大量使用铜(Cu)作为饲料添加剂会在养殖废物的排放和利用中导致一定的环境问题。随着东北老工业基地产业结构的调整，畜牧业作为东北地区二次振兴的主要产业得到迅速发展，由此会产生大量的畜禽粪便用于农业土壤施肥。而东北地区又是我国重要的农副产品生产基地，研究畜禽粪便农用的健康及环境风险就显得殊为必要。黑土是东北地区最主要的土壤类型，本文以东北黑土为供试材料，通过在盆栽实验中添加不同Cu浓度的猪粪来模拟施肥年限不同的菜园土，研究土壤中Cu累积对小白菜(Brassica chinensis L.)地上部分生物量与Cu含量、土壤微生物生物量和土壤酶(脱氢酶、脲酶、酸性磷酸酶)活性、微生物群落功能多样性以及对土壤功能微生物——氨氧化古菌(AOA)和氨氧化细菌(AOB)等的影响，从而实现含Cu猪粪农用对食物链途径的健康风险以及土壤生态系统的生态风险的综合评价。 研究结果表明，施用猪粪显著地改善了土壤的pH，增加了小白菜地上部分生物量，对其体内Cu浓度则没有显著影响;小白菜地上部分Cu浓度与土壤全Cu和水溶态Cu浓度显著正相关(P<0.01)，而地上生物量与土壤全Cu浓度显著负相关(P<0.05)。当土壤全Cu浓度达到300 mg kg-1后，小白菜地上部分生物量受到强烈抑制。 猪粪的施用在一定时期内显著地促进了脱氢酶和脲酶的活性，但随土壤Cu浓度的增加，脱氢酶、脲酶和酸性磷酸酶的活性逐渐受到抑制。当土壤全Cu浓度达到300 mg kg-1后，微生物生物量、脱氢酶、脲酶、酸性磷酸酶等均受到强烈抑制。 施加猪粪提高了土壤微生物群落功能多样性，当土壤Cu浓度达到170 mg kg-1后，显著地抑制了微生物群落功能多样性。种植小白菜后，各处理间微生物群落功能多样性没有显著差异，意味着植物能够维持微生物群落功能多样性。主成分分析(PCA)结果显示，当土壤全Cu浓度达到300 mg kg-1后，微生物群落功能多样性与其它处理显著不同。 猪粪显著地促进了土壤的硝化潜势速率(PNR)。随着Cu浓度的增加，硝化潜势速率逐渐受到抑制，当土壤全Cu浓度达到170 mg kg-1后，即与对照无显著差异。植物在维持硝化速率方面也起到重要作用。古菌amoA基因在每克干土中的拷贝数在9.4*106~2.59*107，细菌amoA基因在每克干土中的拷贝数约为1.48*106~1.41*107。猪粪在一定时期内显著地增加了AOA和AOB的数量，当土壤Cu浓度达到300 mg kg-1后，AOA和AOB的数量显著下降，并且AOA与AOB amoA基因拷贝数的比值增加，在小白菜栽种前(B1)和小白菜收获后(B2)分别为2.33和9.26，这意味着在高Cu浓度胁迫下，AOA的耐受性更强。古菌与细菌的amoA拷贝数与PNR之间则没有显著的相关关系，意味着AOA和AOB种群结构以及其中某些种群的活性可能发生了变化。 本文通过对东北黑土菜地土壤中Cu在作物体内的迁移积累及其对土壤微生物学指标(微生物生物量、酶活性、微生物群落功能多样性及功能微生物)的影响的综合研究，揭示了含Cu猪粪农用所造成的健康和生态风险，为建立适宜的土壤环境质量标准提供了一定的科学依据。通过本研究得出，黑土蔬菜种植中Cu浓度的阈值在170-300 mg kg-1之间。

寄生植物在入侵植物防治中的作用——以两种菟丝子为例

生物入侵在全世界广泛发生，目前已经受到全球关注。入侵生物对群落生物多样性和生态系统功能造成严重威胁，导致严重的环境问题和惨重的经济损失。薇甘菊(Mikania micrantha)、五爪金龙(Ipomoea cairica)和南美蟛蜞菊(Wedelia trilobata)是我国华南地区危害最严重的三种外来入侵种，其中以薇甘菊危害最严重，是世界十大有害杂草之一。从20世纪80年代发生以来，薇甘菊已在我国广东农林区域造成严重危害。 机械防治、化学防治和传统的生物防治等治理措施，未能有效治理外来入侵种的危害，直到使用本地种菟丝子(Cuscuta spp)的防治策略。与从原产地引进有害生物天敌的传统生物防治方法不同，本地种由于适应当地气候且与其他物种协同进化，因此，对生态环境潜在的负作用小。从2000年，被发现寄生和抑制薇甘菊之后，菟丝子被认为是防治薇甘菊的有效措施。 为了探讨菟丝子寄生对外来入侵种的治理，及对入侵群落的恢复，本研究在内伶仃岛的林地(入侵种群落被引入菟丝子寄生1-4年)，以及东莞、深圳和海丰的干扰样地(入侵种群落被菟丝子自然寄生5年以上)开展野外调查。在每个样地分别设立外来种入侵亚群和菟丝子治理亚群，通过测定群落结构与组成、土壤性质与养分含量，以及外来种和菟丝子的生长与养分含量等参数之后，本研究得出以下主要结论。 (1) 虽然，被寄生的外来入侵种薇甘菊、五爪金龙和南美蟛蜞菊通过调节资源分配以抵御南方菟丝子(Cuscuta australis)的寄生影响，但是，菟丝子寄生导致外来入侵种生物量降低、繁殖能力下降、养分含量降低。虽然，很多寄生植物都是广谱寄生，能同时寄生多种寄主植物，但是，在本研究的被入侵的群落中，菟丝子主要寄生外来入侵植物。尤其是寄生于南美蟛蜞菊和薇甘菊的菟丝子，生长旺盛、繁殖能力强，表现出高度的适应性。因此，菟丝子对外来入侵种(南美蟛蜞菊和薇甘菊)有寄生偏好性，并对本地种的负面影响小。 (2) 通过吸收寄主的养分，田野菟丝子(Cuscuta campestris)有效地抑制了薇甘菊的危害。由于入侵种的凋落物养分含量高且分解效率高，而且，菟丝子能够促进其它凋落物的分解，并使难以被植物吸收的养分转化成易于被吸收利用的状态。因此，菟丝子与薇甘菊的寄生作用导致土壤养分含量的升高。在薇甘菊被抑制之后，本地种利用丰富的土壤养分资源，提高生长适应性，增强抵抗入侵的能力，甚至抵制薇甘菊的再生。 (3) 菟丝子的寄生作用改变了外来寄主与本地非寄主的竞争平衡，促进本地植物的生长与重建。在外来种被抑制之后，本地种的丰度和群落的物种多样性逐渐增加。本地种如：野葛(Pueraria lobata)和芦苇(Phragmites australis)，取代了入侵群落中的入侵种，成了群落的优势种。而其它原先被薇甘菊抑制的本地草本、藤本和灌木，在引入菟丝子防治之后长势较好。群落稳定性与物种多样性密切相关，被治理群落本地种的增加有利于群落的演替与稳定。 (4) 被干扰的生态系统往往更容易被外来种入侵，而外来入侵种又常导致人工干扰生境的严重退化。在人工干扰样地的菟丝子对薇甘菊的抑制效果与在林地的效果一致，导致被寄生的薇甘菊生长衰退、养分竞争能力下降、入侵危害能力降低。而在薇甘菊被菟丝子治理之后，土壤养分资源增加，入侵群落的物种丰度和生物多样性提高。本 地种的重建与本地群落的恢复密切相关，利于本地被治理群落的稳定，促进被干扰植被的恢复。 菟丝子是一种治理外来入侵种危害的有效措施，适用于破碎的生境和被干扰的生态系统，尤其是在采用目前防治措施难以治理的情况下。本研究为本地种防治外来入侵种提供科学依据，且表明以入侵地的本地种治理外来入侵种有可能成为有效且可持续发展的生物防治策略。

转基因油菜和野芥菜杂交种的适合度

转基因植物与野生亲缘种间的基因流动是目前生物安全的研究热点。甘蓝型油菜（Brassica napus 以下简称油菜）及其亲缘种是基因流研究中的模式植物体系，油菜的亲缘种之一野芥菜(B. juncea)在中国分布广泛，是常见的农田杂草。本文以转基因抗虫油菜和野芥菜为研究材料，分别用综合适合度(基于生长和生殖)和适合度(仅基于种子产量)的指标来评估其杂交种在模拟农田情况下的适合度，揭示转基因在自然环境中的命运，以期为中国的油菜基因流的管理和控制提供参考。主要结果如下： 由于杂种优势和亲本效应的影响，转基因杂交种在不同的种植季节的生长与长势较好的亲本相近。因而转基因杂交种的综合适合度介于双亲之间，或与表现较好的亲本相似。因结实较差，从种子产量上来看，转基因杂交种的适合度较低。杂交种的后代因母本效应保留了一定的休眠特性，这有助于杂交种在种子库中持续存在。野芥菜和杂交种秋播时在冬季覆大棚条件下的适合度较高，在全球变暖的情况下，野芥菜和杂交种有可能在原先较冷不适宜的地区生长，从而促进转基因的散布。 杂交实验表明，转基因花粉与野芥菜的亲和性略高于非转基因花粉，但不显著；在两种花粉发生竞争时，转基因花粉的亲和性显著较高。混合花粉授粉的结实率高于单种花粉的结实率。可见在转基因花粉在授粉阶段不存在适合度代价。同时两季秋播田间实验表明，转基因油菜与非转基因油菜的适合度没有明显差异，即在植株的生长结实阶段，当没有竞争和虫害选择压力时，转基因没有适合度代价。也证明转基因散布的潜在可能性较大。此外，转基因杂交种的开花量很大，而回交实验中转基因杂交种花粉的育性高于胚珠的育性。转基因有可能通过持续的回交逃逸。 油菜的种子较大，野菜芥的种子较小，转基因油菜与野芥菜的杂交种基本都是小种子，其种子直径低于双亲。种子大小影响了发芽率、出苗率和营养生长期。小种子出苗率和发芽率较低，营养生长期较长。在没有竞争的条件下，春播实验中，种子大小对植物的适合度及综合适合度没有影响。秋播实验中种子大小对除转基因油菜外的所有植物基因型的综合适合度有显著影响。但对于依据种子产量计算的适合度指标来说，种子大小仅对野芥菜有影响，而对其它基因型影响不大。竞争扩大了种子大小之间生长表现的差异。竞争条件下，不同种子级别间的生长变异系数大于无竞争的情况。 总之，转基因花粉较强的竞争能力和其与野芥菜的亲和性使转基因杂交种的产生成为可能。来自母本的休眠特性有助于杂种种子在种子库中存在并在条件适宜时萌发、开花，有助于转基因的进一步扩散。转基因杂交种具有较高的综合适合度，虽然结实率很低，但其开花量比较大，可能会产生大量可育的花粉，在与野生亲本的持续回交过程中，转基因有可能逃逸。同时，转基因杂交种的种子级别偏小有可能会加剧这种逃逸。

镉、铅污染土壤的植物-微生物联合修复研究

植物－微生物联合修复是利用微生物作为植物修复重金属土壤的一种强化手段，在弥补单纯植物及微生物修复技术不足的同时，利用植物和微生物的共存体系提高植物修复效率。本研究考察了向日葵（Helianthus annuus L.），芥菜（Brassica juncea L.），紫花苜蓿（Medicago sativa L.）和蓖麻（Ricinus communis L.）对Cd、Pb的富集特征，并筛选出向日葵作为富集植物；探讨了向日葵根系分泌物在重金属胁迫下的变化；通过重金属耐受菌株与向日葵的配伍对Cd、Pb污染土壤进行联合修复，结果如下： 液体培养实验结果表明，四种植物对Cd、Pb富集能力明显不同，其中向日葵对两种重金属的提取效果较好。四种植物对重金属的富集量随着浓度的增加而增加，而富集系数随重金属浓度的增加而减小，转移系数同重金属浓度及地上部/地下部生物量比值呈现一定的相关性；Cd、Pb复合处理中，一种重金属的存在会在不同程度上影响植物对另一种重金属的吸收；此外，不同植物及重金属处理中根际区域的酸碱度及氧化还原电位呈现负相关性。 砂培实验结果表明，向日葵对重金属的富集规律基本同液体培养实验相似。富集系数与重金属浓度和培养时间呈现线性相关关系。复合处理中，当Cd和Pb在适当浓度比例时，向日葵可以增加对某一重金属的吸收效率。向日葵的根系分泌物组成因重金属的存在而明显减少，根系分泌物中的草酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、乙酸及丁二酸含量随着不同浓度Cd、Pb而发生不规则变化。 在以根系分泌物作为唯一营养来源筛选重金属耐受菌株实验中，细菌和真菌对Cd及Pb的耐性及吸附效率不同。总体上看，微生物生物量随重金属浓度升高而降低，而重金属吸附量随浓度升高而增加，重金属复合毒性也减少了微生物对单一重金属的吸收；另外，培养基中酸碱度因微生物种类及重金属浓度而有所差异。 将筛选出的优势微生物与向日葵配伍处理Cd、Pb污染土壤的实验中，由于Cd、Pb污染模式及菌株种类的不同，微生物对向日葵吸收重金属的强化效果呈现很大差异，其中真菌对植物吸收重金属的强化能力较细菌强；同时，根系分泌物中6种有机酸的含量在不同处理中变化较大；在处理单一Cd或Pb污染的时候选用菌株B1、F1或混合菌B1+B2、F1+F2、B2+F1、B1+F2与向日葵配伍修复的效果较好；混合菌F1+F2、B1+F2、B2+F1的添加能较好的强化Cd、Pb复合污染中向日葵吸收重金属的能力。

镉、铅排异大白菜品种的筛选和鉴定及安全生产调控技术

随着工农业的快速发展，土壤重金属尤其Cd和Pb污染日益严重。筛选和培育具有重金属低积累特性的农作物排异品种被认为是当前应对土壤重金属污染最为合理和有效的途径之一。本文通过盆栽试验、大田试验和砂培试验，研究了大白菜品种对Cd和Pb的吸收和积累的品种差异、对Cd、Pb胁迫的响应以及大白菜安全生产的调控技术，得出以下结论： 1) 盆栽梯度试验中，80种大白菜地上部对Cd的吸收存在显著差异(p < 0.05)。在3种Cd处理下(1.0, 2.5和5.0 mg/kg)，80种大白菜Cd含量浓度范围分别为(mg/kg) 0.22–2.46, 0.90–14.10和2.03–18.01, 其平均值分别为 0.79, 3.76 和6.79 mg/kg DW。大白菜对Cd胁迫具有较强的耐性。大田试验中，15种大白菜的富集系数和转运系数与盆栽梯度试验的结果基本一致。排异植物的筛选和鉴定标准包括：(1)该植物的地上部和根部的Cd含量都很低或者可食部位低于有关标准；(2) 富集系数(BF) < 1.0；(3) 转运系数(TF) < 1.0；(4)该植物具有较高的Cd耐性，在较高的Cd污染下能够正常生长且生物量无显著下降。采用此标准，结合盆栽梯度试验和大田试验结果，北京新3号、绿星70和丰源新3号可鉴定为Cd排异品种。秋傲和赛新5号具有排异Cd特性，但其对Cd的耐性较差。 2) 盆栽梯度试验中，在Pb投加浓度为500和1500 mg/kg处理下，30种大白菜地上部对Pb的吸收存在显著差异 (p < 0.05)，其Pb浓度的范围分别为：0.52–8.68 和1.86–16.20 mg/kg, 其平均值分别为3.01 和6.87 mg/kg DW。并且，随着Pb浓度的增加，白菜地上部Pb含量有随之增加的趋势。大白菜对Pb具有较强的耐性。低浓度的Pb处理对大白菜的生物具有一定的促进作用。结合盆栽试验和大田试验的结果，秋傲、世博秋抗和福星80可鉴定为Pb排异大白菜品种。 3) 砂培试验中，在Cd和Pb胁迫下，大白菜地上部的丙二醛(MDA)含量增加，随着Cd处理浓度的增加，超氧化物歧化酶(SOD)活性呈现先下降后上升接着下降的趋势，酸菜王的SOD活性要高于北京新3号SOD的活性。随着Pb处理浓度的增加，福星80地上部的SOD活性随之增加，而绿星大棵菜地上部的SOD活性先下降后增加。在不同梯度的Cd处理下，大白菜地上部的可溶性蛋白(SP)含量未见显著降低，甚至有所增加，而在不同梯度的Pb处理下，大白菜地上部的SP含量有所降低。 4) 施用改良剂可升高土壤的pH值和降低土壤中的有效态Cd，从而对大白菜的生长具有促进作用。施用改良剂可显著降低大白菜对Cd和Pb的吸收和累积。

矿山废弃物中重金属污染行为及其对白菜品质的影响

综合运用环境地球化学、土壤学、生态学和统计学的方法开展了矿山废弃物尾矿石的堆置对土壤造成的污染以及矿区土壤重金属污染对白菜（Brassica Chinensis）的卫生品质和营养品质的影响研究。静态培养试验和动力学淋溶试验证明：在环境因素（如降水）的作用下，尾矿石的堆置将对下伏土壤的重金属含量产生长久影响，随着降水量以及酸度的增加，土壤中Cu、Cd、Pb、Zn的全量和有效态含量都有所升高并且土层间的差异减小。有机酸能不同程度地促进土壤中的重金属转化为有效态，增强重金属的生物有效性；多元梭酸比一元梭酸的转化率高。另外，有机酸对重金属的转化作用随其浓度的增大而增强，在低温范围内，随温度的升高而增加。通过网室盆栽试验，研究了土壤受Cu、Cd、Pb，Zn单一重金属污染后对大白菜吸收Cu、Cd、Pb、Zn以及植物体内粗纤维和维生素C含量的影响；同时还进一步对Cd-P交互作用影响大白菜吸收Cd、P以及植物体内粗纤维和维生素C含量的情况进行了研究，结果表明大白菜从污染的土壤吸收重金属与土壤中目标元素的含量呈极显著正相关，对非目标重金属的吸收情况复杂，因不同元素间的相互作用机制而异；白菜体内粗纤维和抗坏血酸含量随土壤重金属浓度的增加而降低，它们之间呈极显著的负相关关系。在采用大白菜进行高等植物毒性试验的基础上，首次运用典型相关分析方法对Cu、Cd、Pb、Zn复合污染土壤的生态毒性进行了评价，分别建立了由4元素共同组成的复合污染土壤毒性的线性组合函数和由芽生物量抑制率和根伸长抑制率组成的植物学表征的线性组合函数，并计算了其第一典型变量Toxl（土壤毒性）和BloL（植物学表征）之间的相关系数为0.94（p＜0.01）。典型相关分析是介质毒性评价的有效方法之一。

东北地区千里光属、华千里光属及狗舌草属分类学研究

本文在前人工作的基础上，对东北产千里光属Senecio植物进行了形态分类、花解剖及花粉形成结构的研究。结果表明：1. 华千里光组Sect. Sinosenecio和狗舌草组sect. Tephroseris在形态和花结构上与千里光属Senecio植物有显著差异，应从千里光属中独立出来，自立为属，即：华千里光属Sinosenecio对狗舌草属Tephroseriso 2. 东北产华千里光属只有一种，即朝鲜千里光Sinosenecio Koreanus (Kom.) B. Nord。3. 东北产狗舌草属分为2组，共5种1变型，其中T. Campestris (Retz.) Reichb.f.spathulatus (Miq.) R. yin et C. y. Li为新组合，并订正了狗舌草T. campestris (Retz.) Reichb的拉丁名。4. 东北产千里光属分为2组，共5种，2变种1变型。5. 狗舌草属和千里光属花粉形态基本相似，都为球形，表面具刺，3孔沟型。花粉形成不能作为划分属的依据。本文还详细描述了每个种的形态学特征，地理分布和文献考证，并附有每个种的叶形。花解剖图及花粉的扫描电镜、光镜照片。还有分属及分种检索表。