Responses of antioxidant system in Arabidopsis thaliana suspension cells to the toxicity of microcystin-RR

Microcystins are cyclic heptapeptide hepatoxins produced by many species of cyanobacteria. The toxic effects and mechanism of microcystins on animals have been well studied both in vivo and in vitro. It was also reported that microcystins had adverse effects on plants. However, to our knowledge, there is no information about the toxic effects and mechanism of microcystins on plant suspension cells. In this study, Arabidopsis thaliana suspension cells were exposed to a range dose of microcystin-RR. Lipid peroxidation, a main manifestation of oxidative damage, was studied and a time- and dose-dependent increase in malondiadehyde was observed. In contrast, glutathione (GSH) levels in the cells decreased after 48 h treatment with 1 and 5 mg/L of microcystin-RR. The activities of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) increased significantly after 48 h exposure to I and 5 mg/L of microcystin-RR, but glutathione S-transferase (GST) activity showed no difference compared with the control. These results clearly indicate that microcystin-RR is able to cause oxidative damage in A. thaliana suspension cells. Decrease of GSH content and increases of SOD and CAT activities reveal that the antioxidant system may play an important role in eliminating or alleviating the toxicity of microcystin-RR. The possible toxicity mechanism of microcystin-RR on the A. thaliana suspension cells is also discussed in this paper. (C) 2005 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Molecular cloning, expression and biochemical property analysis of AtKP1, a kinesin gene from Arabidopsis thaliana

Kinesins are common in a variety of eukaryotic cells with diverse functions. A cDNA encoding a member of the Kinesin-14B subfamily is obtained using X-RACE technology and named AtKP1 (for Arabidopsis kinesin protein 1). This cDNA has a maximum open reading frame of 3.3 kb encoding a polypeptide of 1087 aa. Protein domain analysis shows that AtKP1 contains the motor domain and the calponin homology domain in the central and amino-terminal regions, respectively. The carboxyl-terminal region with 202 aa residues is diverse from other known kinesins. Northern blot analysis shows that AtKP1 is widely expressed at a higher level in seedlings than in mature plants. 2808 bp of the AtKP1 promoter region is cloned and fused to GUS. GUS expression driven by the AtKP1 promoter region shows that AtKP1 is mainly expressed in vasculature of young organs and young leaf trichomes, indicating that AtKP1 may participate in the differentiation or development of Arabidopsis thaliana vascular bundles and trichomes. A truncated AtKP1 protein containing the putative motor domain is expressed in E. coli and affinity-purified. In vitro characterizations indicate that the polypeptide has nucleotide-dependent microtubule-binding ability and microtubule-stimulated ATPase activity.

不同启动子调控的ipt基因表达质粒的构建及其对植物的转化

作为一类重要的植物激素，细胞分裂素在植物的生长与分化发育过程中起着重要的作用。 农杆菌来源的Ti质粒上基因4区域ipt基因特异地编码控制细胞分裂素生物合成中的关键酶—异戊烯基转移酶。 启动子是一类非常重要的基因元件，在控制生物体内基因表达上起决定作用。 本文从以下两个方面着眼，进行了一些分子水平上的工作．1）利用外源基因的导入，从调节内源激素水平的角度研究细胞分裂素与植物生长发育的一些关系．2)研究比较不同启动子在转基因植物不同部位的表达功效． 为此，我们构建了一系列不同启动于调控下的iPt基因表达质粒;pCaI、pRI、pII以及pIG并转化了烟草（NIcotinacum：Wisconsin38）和拟南芥菜(Arabidonsis thaliana: NeW Zealand)．得到了一些抗性转化苗， 转化苗在生：长发育一些特性上已显示出与未转化植株的不同，如侧芽多及不易生根等．进一步的分析检测工作：如在复制、转录以及翻译水平上的检测，外源ipt基因的表达以及表达强度对植物生长发育的影响等有待于继续进行。

低能N+诱导拟南芥突变体DNA���异的研究

低能离子束的诱变效应首先由我国科学家发现并将其广泛应用于育种实践，但是离子注入诱导DNA���异的研究结果主要是以微生物离体质粒DNA���材料获得的，以活体高等生物为材料的研究尚未见报道。 我们以30 keV N+（注入剂量80×1015 ions/cm2）注入拟南芥后获得的稳定突变体T80II为实验材料，对突变体植株进行了RAPD标记，并将T80II和对照部分RAPD特异条带进行克隆测序和DNA���列分析。结果显示，在可分辨的总计397个RAPD条带中，T80II株系中有52个条带表现出差异，包括条带的缺失和增加，条带变异率为13.1%;克隆的T80II序列中，平均每16.8个碱基出现一个碱基变异位点，表现出较高频率的碱基突变。碱基突变的类型包括碱基的颠换、转换、缺失、插入等。在检测到的275个碱基突变中，主要是单碱基置换（97.09%），碱基缺失或者插入的比例较小（2.91%）。在碱基置换中，转换的频率（66.55%）高于颠换的频率（(30.55%)。此外，构成DNA���四种碱基均可以被离子束辐照诱发变异，而且每一种碱基都可以被其它三种碱基所替换，但是胸腺嘧啶（T）的辐射敏感性要高于其它三种碱基。通过分析突变碱基周边序列，对低能N+离子注入拟南芥突变体引发的碱基突变热点进行了讨论。 另外，低能离子注入诱变获得的突变体特异表达基因的克隆方面也没有报道。我们以突变体T80II作为实验材料，用PCR增效的减法杂交技术构建了T80II特异表达的cDNA���法文库，克隆特异表达的cDNA���段，并对其中1个与14-3-3 protein GF14 nu (GRF7) gene有部分同源性、长712 bp的cDNA���段进行了讨论。我们的研究证明通过减法杂交技术克隆低能离子诱发的突变体特异表达的cDNA���可能的，这为低能离子注入技术在分子生物学上的应用开辟了一个新思路。

拟南芥有性生殖模式和叶片特性对大气CO2浓度变化的响应

预计到本世纪末，大气CO2浓度将会增加到540～970ppm，大气CO2浓度升高所引起的全球气候变化已经受到广泛的关注。植物生长依赖CO2，并且对大气CO2浓度升高在结构和生理上产生响应。目前已有大量报道，从生态系统、群落、种群、个体、器官、组织、生理以及生化等水平上研究高浓度CO2所对植物产生的影响。但是有关高浓度CO2对植物有性生殖影响的报道却很少，同时多数实验均建立在短期的生殖响应，忽视了植物在长期高CO2浓度下具有的反馈作用和CO2浓度变化对植物的驯化作用。植物有性生殖与其生态适应性和农作物籽粒产量的关系极为密切;同时，植物有性生殖特性的变化，也可作为预测植物对全球气候变化响应的重要指标之一。为此，利用高浓度CO2对植物进行长期选择实验将很有必要。研究结果将为预测未来大气CO2浓度增加的条件下陆地生态系统的演变趋势、全球变化对植物有性生殖响应的方式和机制提供新的思路和有效方法。 　　在本研究中，我们以模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)作为实验材料，利用370和700ppm CO2对其进行连续8个世代处理，首先研究高浓度CO2对每一个世代的拟南芥有性生殖特性的影响，然后比较各个世代中各种生殖特性指标变化的规律，从细胞、组织和个体尺度上揭示拟南芥有性生殖对全球变化的响应模式。此外，在700ppm CO2处理下，我们对拟南芥叶片生理、生化以及结构的变化进行了相关研究。两部分研究结果及主要结论如下： 　　首先，在每一个世代中，与370ppm CO2相比较，700ppm CO2处理显著促进了拟南芥开花，缩短生长周期，增加花、角果及种子等生殖的产量，降低种子N含量，提高种子C/N比、种子千粒重以及生殖生物量所占总生物量的比例等，而对种子萌发率、角果所含种子数目以及角果长度则无显著影响。但是， 通过对相同CO2浓度处理条件下，不同世代之间的研究结果比较发现，不同世代之间相关的生殖生物学指标并无显著差异。 　　其次，高浓度CO2显著降低叶片气孔密度、气孔指数、气孔导度以及蒸腾速率。在高浓度CO2处理下，叶肉细胞中叶绿体数目、叶绿体宽度和表观面积、淀粉粒大小和数量、叶片和细胞壁厚度等都显著增加，但是基粒内囊体膜的数量却显著下降。叶片中碳水化合物如可溶性总糖、淀粉以及纤维素含量在高浓度CO2下分别显著增加71.9%、78.7% 和 22.3%。此外，在高浓度CO2处理下，叶片中多数激素如如吲哚乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)、赤霉素(gibberellin, GA)、玉米素核苷(zeatin riboside, ZR)、二氢玉米素核苷(dihydrozeatin riboside, DHZR)和异戊烯基腺苷(isopentenyl adenosine, iPA)均都显著地增加，而脱落酸(abscisic acid, ABA)含量却有所下降。最后，叶片中各种矿物质元素含量如N、P、K、Ca���Mg等含量在高浓度CO2处理下也都显著下降，而C/N比增加24.8％。 　　以上结果表明： 　　(1) 在每一个世代中，700ppm CO2处理对拟南芥各种有性生殖特性具有显著的影响，但是高浓度CO2处理对植物所引起的效应在多个世代以内并不能够传递给后代，所以在多个有性生殖世代内，高浓度CO2处理对植物生长、生殖没有驯化作用。 　　(2) 在高浓度CO2处理下，拟南芥叶片中叶绿体超微结构的变化，可能主要是由于叶绿体中淀粉粒数量和体积大小显著增加而引起。 　　(3) 在高浓度CO2处理下，由于拟南芥叶片内与促进细胞分裂与伸长的激素含量显著增加，从而对拟南芥植株生长发育速率的提高起了重要的作用。 　　(4) 拟南芥生长在高浓度CO2条件下，其叶片中各种矿质元素含量（如N、P、K、Ca���Mg）均显著降低，究其原因可能是，第一由于叶片中碳水化合物含量的显著增加而对矿物质元素具有稀释作用;第二由于蒸腾速率下降，引起矿质元素从根部随着蒸腾流运输到地上部分的含量相应减少。 　　

盐角草（Salicornia europaea L.）SePSY和SeLCY基因克隆及功能分析

盐角草（Salicornia europaea L.）是一种叶片退化而茎肉质化，不具有盐腺和盐囊泡的真盐生植物，可以在1020 mM NaCl下生存。其特殊的形态适应特点使其成为研究植物抗盐性的良好实验材料。但目前与盐角草抗盐机理相关的生理和分子方面的研究还非常有限。本文以盐角草为材料，首先探讨了盐分和渗透胁迫对其光合作用和渗透平衡的影响，在此基础上进一步克隆了盐角草类胡萝卜素合成途径中的两个关键酶，八氢番茄红素合成酶（SePSY）和番茄红素β-环化酶（SeLCY）基因，并进行了功能分析。该研究对于了解类胡萝卜素在植物抗盐性中所起的作用具有重要意义。 盐分和渗透胁迫对其光合作用和渗透平衡影响的实验结果表明：200 mM NaCl是盐生植物盐角草生长的最适盐浓度，在该盐度下盐角草中叶绿素a/b的比值和光饱和点升高，植株的光合作用表现出增强的效应，植株生长最佳。而27％ PEG-6000所模拟的渗透胁迫显著降低了盐角草中叶绿色a/b的比值，抑制其光合作用和生长。200 mM NaCl下，Na+的含量显著增加，但脯氨酸含量保持不变，说明Na+对盐角草渗透平衡的作用要强于脯氨酸。同时盐角草中液泡H+-ATPase（V-H+-ATPase）活性增强，而盐角草Na+/H+逆向转运蛋白基因（SeNHX1）在盐分和渗透胁迫下却表现为组成型表达;我们因此推断在盐分胁迫下，Na+的吸收是由于液泡H+-ATPase活性的增强，而不是诱导SeNHX1基因的表达。同时Na+的吸收可能进一步诱导了与光合作用相关基因的表达。 盐分对植物的影响涉及植物体内包括光合作用和活性氧代谢在内的多个代谢过程。在植物中，类胡萝卜素是植物捕光天线复合体（LHC）和光系统反应中心叶绿素结合蛋白的重要组成部分。植物体内类胡萝卜素能够清除植物叶绿体，线粒体和过氧化物体在电子传递过程中产生的活性氧。同时类胡萝卜素是植物激素ABA���前体。200 mM NaCl虽然增加了盐角草细胞的渗透势，但并没有对其造成氧化胁迫和离子毒害，相反提高了其光合能力。类胡萝卜素作为植物活性氧的淬灭剂和光系统的组成成分，可能在盐角草抗盐机理中发挥着比较重要的作用。在过去的十年中，类胡萝卜素研究大多集中在其生物合成和提高作物中类胡萝卜素含量方面，可是，在植物对非生物逆境（如氧化和盐分胁迫）的适应机制中，类胡萝卜素合成途径究竟发挥什么作用目前还不是很清楚。为了了解盐角草中类胡萝卜素合成途径在植物逆境的适应机制中所发挥的作用，本文采用RACE的方法克隆了盐角草类胡萝卜素合成途径中的两个关键酶基因 SePSY和SeLCY，将它们构建到植物表达载体SN1301中，转化拟南芥，并对它们进行了初步的功能分析。 研究发现盐角草SePSY基因全长1655 bp，编码419个氨基酸，推测分子量为47.2 kDa���等电点为8.92。其蛋白在1-65个氨基酸处有一个信号肽。在1-19和242-264氨基酸处有2个跨膜区。盐角草SeLCY基因全长1937 bp，编码498个氨基酸，推测分子量为56.1 kDa���等电点为8.41。其蛋白在1-37个氨基酸处有一个信号肽。在79-96，367-385和454-474氨基酸处有3个跨膜区。SePSY和SeLCY基因过量表达均促进转基因拟南芥的生长，转SePSY基因拟南芥次生根数目比野生型拟南芥明显增多。SePSY和SeLCY基因的过量表达还使转基因拟南芥对百草枯的抗性得到提高;SePSY基 因的过量表达增强了植株体内抗氧化保护酶过氧化物酶（POD），超氧化物歧化酶（SOD）活性，但过氧化氢酶 （CAT）的变化不显著;转SeLCY基因株系POD，SOD，CAT的活性都有所增强，但转SePSY基因株系中POD活性明显高于 转SeLCY基因株系。转SePSY和SeLCY基因拟南芥叶片中丙二醛（MDA���和H2O2含量均降低，但转SePSY基因株系中MDA���H2O2含量明显低于转SeLCY基因株系。说明转基因拟南芥对氧化胁迫的抗性得到了提高，同时使得光系统II（PSII）和细胞膜的结构和功能不被破坏。而转SePSY基因株系对盐分和氧化胁迫的抗性明显高于转SeLCY基因株系。SePSY和SeLCY基因的过量表达还提高了转基因拟南芥的光合效率，气孔导度和Fv/Fm比值。 SePSY和SeLCY基因转化拟南芥及其功能分析的初步结果表明，SePSY和SeLCY基因的过量表达提高了转基因拟南芥对体内活性氧（ROS）的清除能力，增强了拟南芥的光合能力，进而提高了拟南芥的抗盐性。

水母雪莲DFR基因的克隆及其正义和反义植物表达载体的构建

水母雪莲（Saussurea medusa Maxim.）为多年生菊科植物，是我国珍稀药用资源。所含的主要生物活性成分是黄酮类物质，具有抗炎、镇痛、免疫抑制及抗氧化等功效。但由于水母雪莲生长环境特殊，生长缓慢，人工引种困难;加上长期掠夺性采挖，造成其野生药用资源短缺，已经不能满足市场的需求。近年来,世界上掀起了植物药开发的热潮,植物药以其天然低毒的特点倍受关注,而黄酮类化合物更是以其广谱的药理作用引人瞩目。 黄酮类化合物的合成代谢途径在植物界进化过程中很保守，黄酮类生物合成途径中的相关酶也已得到确证并进行了系统的研究。二氢黄酮醇-4-还原酶（Dihydroflavonol-4-reductase, DFR）是一个处于花色素或者原花色素合成途径中的关键酶，它与黄酮合成途径中的黄酮醇合成酶（flavonol synthase）竞争底物。本研究以水母雪莲为研究对象，根据近缘物种DFR基因的保守核苷酸序列设计兼并引物，通过PCR技术，从已经建立的水母雪莲红色愈伤组织cDNA���库中筛选到一个编码该酶的cDNA���列，该序列全长1166个碱基对。根据生物信息学分析，此cDNA���码342个氨基酸;Blastp分析结果显示，该氨基酸序列与同科植物翠菊（Callistephus chinensis）的相似性最高，达87%;SWISSMODEL软件预测其蛋白的三级结构与葡萄(Vitis vinifera)的十分相似，活性中心的关键氨基酸残基也完全一致。据此可以断定，我们所得到的cDNA���编码二氢黄酮醇还原酶的基因，并命名为水母雪莲二氢黄酮醇还原酶基因(SmDFR）。为了得到SmDFR的DNA���列，我们又设计特异引物，从水母雪莲的基因组中扩增出了由1871个碱基对组成的DNA���列，该序列包含五个内含子和六个外显子。 为了提高水母雪莲和大苞雪莲中黄酮类物质的含量，我们构建了SmDFR的反义植物表达载体，利用根癌农杆菌介导进行基因转化。通过改变影响农杆菌转化的实验条件包括外植体来源、农杆菌菌株、细菌浓度、外植体预培养时间、侵染时间和乙酰丁香酮的浓度进行转基因试验，目前尚未得到转基因植株。另外，我们构建了SmDFR正义植物表达载体，通过对拟南芥(Arabidopsis thaliana) DFR基因突变体和矮牵牛(Petunia hybrida)进行基因转化，来验证SmDFR的功能;目前，此实验尚在进行之中。

近零磁场对拟南芥生长发育影响初探及趋磁细菌(Magnetospirillum magneticum）铁还原酶基因 MmFre 的克隆和功能分析

地磁场伴随着生命的起源、发生和进化，地球上的一切生命无时无刻不处于地球磁场中。地球自诞生以来，地磁场的强度一直在细微变化，但地磁场强度减弱会对植物产生什么样的直接影响尚知之甚少。随着对太空探索的不断发展，人类越来越需要了解处于零磁场环境的太空中生物的适应性。近零磁场是地磁场的恒定组分降低为零或者接近零的空间。本论文利用近零磁场环境探索了地磁场减弱对拟南芥整个生长周期的影响，开展了近零磁场下拟南芥短期生长试验，主要包括种子的萌发、暗培养、根生长、幼苗鲜重和根向重性分析，以及对近零磁场下拟南芥整个生长周期的表型进行了观察统计分析。结果发现(1)无论在光照还是暗培养的环境中，近零磁场对拟南芥种子的萌发、幼苗根的伸长、鲜重变化以及根向重性等的影响较小。(2)对拟南芥整个生长周期过程中表型变化进行的观察和统计分析发现：近零磁场环境中，拟南芥可以完成正常的生活史;但植株开花时间推迟、开花持续时间延长、枝条数减少、植株高度受到了抑制，种子千粒重降低。表明近零磁场对拟南芥营养生长的影响较小，而对生殖生长的影响较明显，暗示地磁场作为环境因子可能参与影响植物的生殖生长。 趋磁细菌(Magnetospirillum magneticum)是一种可以沿磁力线方向运动的特殊的细菌，其胞内铁含量是菌体干重的3％，是非磁性细菌的数百倍，其中的铁主要以Fe3O4/Fe3S4 形式存在于磁小体(magnetosome) 中。趋磁细菌主要通过分泌转铁载体吸收环境中的三价铁。在磁小体合成过程中，三价铁还原为二价是一个必需的过程，因而铁还原酶在趋磁细菌的铁还原过程中可能起着重要的作用。我们以趋磁细菌AMB-1 为材料，克隆了预测的铁还原酶基因，命名为MmFre ，并在内源铁还原酶活性较低的酵母突变株S288C fre1 fre2 中进行异源超表达，对其铁还原活性进行了初步分析;同时结合GFP 融合蛋白技术对该基因的表达产物进行了酵母的亚细胞定位。结果表明：(1)利用生物信息学分析发现，MmFre 基因编码区含有1335 bp，编码444 个氨基酸残基;氨基酸序列中含有一个FAD 结合位点，并具有6 个跨膜结构域;(2)该基因在酵母表达后利用酵母活体进行酶活性检测发现，其铁还原酶活性是对照组的4 倍，暗示该基因在真核生物中的表达产物可以执行铁还原的功能;(3)利用激光共聚焦显微镜观察发现该基因的表达产物与GFP 构成的融合蛋白广泛的定位在细胞的膜上。因而，MmFre 基因的表达产物确实具有铁还原酶活性，且没有膜特异性分布，其对趋磁细菌磁小体生物合成中铁的还原可能起着重要作用。

植物分子伴侣热休克蛋白90（Hsp90）的分子作用机理及抗逆基因工程研究

热激蛋白90是广泛存在于各类细菌和真核生物中的一类高度保守的分子伴侣，它对维持细胞生命是绝对必需的。对Hsp90的相关认知主要来源于对动物和酵母细胞的研究，植物Hsp90的研究甚少。由于植物的特殊性，因此对植物Hsp90的研究是对Hsp90未知功能的有力补充。拟南芥中有7个Hsp90蛋白，其中AtHsp90-1、AtHsp90-2、AtHsp90-3和AtHsp90-4定位在细胞质中，AtHsp90-5、AtHsp90-6和AtHsp90-7分别定位在叶绿体、线粒体和内质网中。本文对拟南芥中的AtHsp90-1、AtHsp90-2、AtHsp90-5、AtHsp90-6和AtHsp90-7五个基因进行了克隆，并分别利用酵母互补、双杂交和拟南芥过表达体系几个层面进行了功能分析。 我们利用酵母穿梭载体p416GPD构建了五个AtHsp90基因的酵母表达载体，将其转入Hsp90基因点突变和条件型缺失的酵母菌株iG170D和R0005中。酵母功能互补实验表明细胞质定位的AtHsp90-1和AtHsp90-2可以在各种胁迫条件下互补酵母Hsp90的功能，而定位于细胞器中的AtHsp90-5、 AtHsp90-6和AtHsp90- 7则在任何条件下都不能互补酵母Hsp90的功能。我们还对转基因酵母进行了液体培养的动态观测和细胞膜完整性检测，其结果和固体培养的结果一致。这说明细胞质Hsp90的功能具有一定的保守性，细胞器Hsp90的功能有其特殊性。 热激蛋白90在执行其生物功能时，需要和大量的辅助因子相互作用，因此我们利用酵母双杂交体系检测了AtHsp90-1、AtHsp90-2、AtHsp90-5、AtHsp90-6和AtHsp90-7五个Hsp90蛋白和Hsp70、p23、Cyp40、NOS等几个辅助因子之间的相互作用情况。双杂交结果显示AtHsp90-1和AtHsp90-2几乎不和所选的这几个辅助因子相互作用，AtHsp90-5可以和所有的辅助因子相互作用、AtHsp90-6可以和除Hsp70以外的辅助因子相互作用，AtHsp90-7也可以和所有的辅助因子相互作用但和Hsp70及Hsp70t-2和互作较其他辅助因子弱一些。可以看出胞质Hsp90和细胞器Hsp90在和辅助因子相互作用时有一定的差异。 为了进一步了解拟南芥个Hsp90基因在抗非生物逆境中的作用，我们又将AtHsp90-2、AtHsp90-5、AtHsp90-7基因插入植物表达载体pBI121，用农杆菌介导的浸蕾法将这三个基因转入拟南芥并在其中过量表达，并研究了这些基因的过表达植株的种子和幼苗对多种模拟非生物逆境的响应。结果显示，转基因种子和幼苗对ABA���盐(NaCl)、干旱(甘露醇)、高温、氧化、高钙等非生物逆境都表现出了敏感，转细胞器Hsp90的种子和幼苗比转细胞质Hsp90的更为敏感。但在高浓度钙离子胁迫下，幼苗表现情况与盐、旱和氧化等非生物逆境处理下的情况正好相反，转细胞器Hsp90的幼苗比转细胞质Hsp90的长得健壮。这些结果表明Hsp90参与了植物抵抗非生物逆境的反应，其作用可能是通过ABA���Ca2+途径实现的，然而体内Hsp90的动态平衡可能才是植物抵抗非生物逆境的关键。

LPA3蛋白参与调控PSII组装的功能研究

PSII是一个叶绿体类囊体膜的蛋白复合体，它由20多个蛋白亚基组成，这些蛋白由核基因和叶绿体基因共同编码。由于PSII结构的复杂性，PSII的组装是多步骤的，并得到辅因子和调控蛋白的协助。但我们对参与调控步骤的蛋白因子还了解不多。鉴于叶绿体有限的编码能力，推测参与叶绿体组装调控的因子主要是由核基因来编码的。辨定这些核编码的叶绿体蛋白并深入研究其作用的分子机制将有助于我们了解PSII生物发生的分子机理。为此，我们利用叶绿素荧光成像系统对pER16 T-DNA���入突变体库进行了筛选，并对高荧光突变体lpa3进行了研究。主要研究结果如下： 突变体lpa3生长较为缓慢，叶色黄绿，叶绿素含量低。在突变体中，最大荧光量子产率Fv/Fm降低到0.514，表明PSII光合功能受到了损伤。突变体lpa3叶绿素荧光慢诱导曲线的正常下降表明PSII后的电子传递正常。突变体P700氧化还原动力学与野生型一致，则进一步表明PSI在突变体中是具有功能的。77K发射荧光光谱显示PSII的特征峰在突变体中较高，而PSI的特征荧光峰没有变化，则进一步显示突变体lpa3是一个PSII突变体。 通过Tail-PCR，发现突变体中T-DNA���入导致基因lpa3缺失表达，并且lpa3基因的互补可以使突变体的性状得到恢复。该基因表达的蛋白LPA3含有一个跨膜区域，是一个类囊体膜蛋白。该蛋白不是PSII的蛋白组成成分，可能与自身或者其它的蛋白组成一个复合体而起作用。 在突变体lpa3中PSII蛋白质尤其是核心蛋白D1、D2，含量下降。并且突变体中PSII蛋白复合体含量下降。但是突变体中PSII基因的表达并没有在转录水平受到调节，并且蛋白D1和D2的翻译起始也没有受到影响。体外标记实验表明，PSII中D1蛋白的合成明显降低，而其它蛋白的合成没有改变。进一步实验表明，突变体中PSII的组装效率降低。推测D1蛋白由于不能有效组装而反馈调节自身的合成。 酵母双杂交实验表明LPA3蛋白可以与D1蛋白相互作用，并且也与参与PSII组装的蛋白Alb3相互作用。因此，LPA3蛋白可能和蛋白Alb3形成一个复合体，该复合体与D1蛋白直接相互作用而参与调控PSII的组装。

一氧化氮在磷酸盐调节拟南芥根系形态变化中的作用

磷缺乏已成为制约世界农业生产的重要因子。植物根系的大小和形态是决定植物吸收土壤磷能力的重要因素，而且根系的生长发育与磷素的分布及其有效性密切相关。关于磷酸盐调节植物根系生长研究已有很多报道，但其生理和分子机制仍不清楚。一氧化氮 (NO) 是一种重要的气体信号分子，参与调控植物的生长发育和对多种逆境胁迫的应答反应。本文选用拟南芥为实验材料，研究探讨了NO与缺磷诱导的拟南芥根系形态变化之间的关系，主要结果如下： 用正常磷水平 (1 mM) 和低磷水平 (1 µM) 处理拟南芥幼苗，发现低磷抑制主根伸长，刺激侧根发生。外源NO供体销普纳 (SNP) 也抑制主根、刺激侧根生长，与低磷诱导根系形态变化相似。NO清除剂c-PTIO和一氧化氮合成酶 （NOS）抑制剂L-NNA���可部分减缓由低磷引起的对主根生长的抑制和对侧根的刺激作用。暗示低磷诱导的拟南芥根系形态的变化可能与NO含量的降低有关。 利用NO荧光标记物DAF-FM和激光共聚焦显微成像技术，本研究发现缺磷6 h和24 h后根细胞内源NO含量显著增加，而且NOS 抑制剂能减少低磷诱导的根细胞NO含量的增加。与正常供磷处理相比，低磷处理6 h和24 h，拟南芥根中编码与NO合成相关的基因（AtNOA1）的表达量增加，缺磷24 h后根中NOS酶活性升高。为了明确低磷诱导的NO 增加是否与硝酸还原酶（NR）介导的NO合成有关，本论文进一步研究了低磷对拟南芥硝酸还原酶活性和编码NR基因 （AtNR1和AtNR2）表达的影响。研究发现低磷处理6 h和24 h后和AtNR1和AtNR2基因的表达均没有变化，且蛭石中生长的拟南芥缺磷1个月后NR活性也没有发生变化;拟南芥的NR双突变体nia1，nia2在低磷处理24 h后，其根中的内源NO含量表现出与野生型相同的增加。因此这些研究结果表明，缺磷后拟南芥根细胞NO的含量增加主要由于NOS的活性升高，而与NR介导的NO合成无关。 已有资料表明低磷诱导植物根细胞内源过氧化氢（H2O2）分布和含量的变化。本论文研究了低磷处理对用H2O2标记物CM-H2DCFDA���记不同磷处理下的拟南芥根中的H2O2。研究发现，缺磷6 h根中H2O2的分布无明显变化，缺磷24 h后H2O2呈斑块状分布，且多集中在根尖伸长区。缺磷24 h后，叶片中的抗氧化保护酶—超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性没有明显变化。说明缺磷24 h 后产生的H2O2没有引起氧化胁迫，而是作为一种信号分子，与NO相互作用共同介导低磷胁迫的应答反应。关于NO与H2O2在低磷诱导的根形态变化中的信号转导过程还有待进一步研究。

LPA2蛋白调控PSII组装的分子机理研究

光系统II（PSII）是叶绿体类囊体膜上电子传递链中第一个色素蛋白复合体，由20多个蛋白亚基组成。它催化光驱动的水的裂解和醌的氧化。由于其结构的复杂性，PSII的生物发生和组装是核基因与叶绿体基因编码的蛋白以一定次序多步骤合成、组装的复杂过程，并需要大量的核基因编码的调节组装因子的参与。分离、鉴定拟南芥中这些核基因编码的叶绿体蛋白并研究它们的作用机制有助于我们认识高等植物PSII复合物组装和功能调控的分子机理。因此，我们从T-DNA���入的拟南芥突变体库中筛选到PSII突变体lpa2（low photosystemII accumulation），对LPA2蛋白调控光系统II复合物组装的功能进行了研究，并进一步探讨了LPA2和其他调节因子协同作用参与PSII组装的模式。 突变体lpa2具有高叶绿素荧光表型，与野生型相比生长量、色素含量均显著降低。蛋白免疫印记发现在lpa2突变体中光系统II复合物的累积量明显降低，仅有野生型的30%左右，而其他复合物的含量变化不大。核酸杂交和与多聚核糖体结合的检测表明光系统II亚基在转录及翻译启始水平没有受到影响。拟南芥叶片蛋白标记实验证明在突变体中CP43的合成量明显降低而其他光系统II主要蛋白CP47, D1 和 D2的合成正常，但相对于野生型这些蛋白的周转速率加快。在突变体中，新合成的蛋白亚基可以组装进入光系统II复合物，但新合成的CP43蛋白组装效率降低。以上的结果表明LPA2对光系统II的正常组装起着重要的作用，LPA2的缺失导致CP43不能有效组装进入光系统II，从而引起其他核心蛋白周转加快，光系统 II复合物累积量降低，最终植株光合效率降低。 基因克隆和蛋白定位分析表明LPA2基因编码一个内在的类囊体膜蛋白，但并不是光系统II的亚基组分。进一步采用酵母双杂分析证实了LPA2蛋白与光系统II核心蛋白CP43有相互作用，而与中心蛋白D1和D2没有相互作用。此外实验还表明LPA2蛋白与参与类囊体膜生物发生有关的Alb3蛋白有相互作用。因此LPA2可能是与Alb3形成复合物来协助CP43有效的整合进入光系统II。 另外，我们实验室已鉴定，LPA3，LPA4也是分别特异地参与CP43和D1组装的光系统II分子伴侣。LPA2，LPA3基因共同缺失会使幼苗不能光合自养而致死，因而LPA2和LPA3共同相互作用促进CP43的组装。体内和体外实验证明LPA2，LPA3和LPA4都和Alb3相互作用，而参与D1组装的分子伴侣LPA1不和Alb3以及上述这些伴侣因子作用。因此，Alb3 很有可能与LPA2、LPA3和LPA4形成多蛋白复合物在D1蛋白合成之后的组装过程中起作用。这些结果表明光系统II多亚基复合物组装是多步骤的，并通过一个精确复杂的调控网络确保复合物的有效组装以及功能行使。

拟南芥光系统复合物组装调控因子的功能研究

光系统I与光系统II ( PSI和PSII ) 是由核基因与叶绿体基因共同编码的蛋白组成的多亚基色素蛋白复合体，其复合物组装过程中蛋白以一定地次序合成并组装。现有研究表明光合膜多亚基复合物形成的每一个过程都需要一个或多个调节因子的参与。发现这些调节因子，并研究它们的作用机制将有助于我们认识高等植物两个光系统复合物组装和功能调控的分子机理。因此，我们采用正向遗传学和反向遗传学方法去寻找这些调控因子。我们一方面应用Gateway技术构建拟南芥cDNA���达文库，采用酵母双杂交技术从中筛选与Alb3互作的蛋白，称为ALIP ( Albino3 Interacting Protein )；从ABRC订购编码这些互作蛋白的基因的T-DNA���入突变株系，其中发现了一个影响PSI功能的突变体alip1；另一方面，通过对拟南芥T-DNA���入突变体库进行筛选，发现了一批影响PSII功能的突变体 ( low photosystem II accumulation )，其中包括lpa1、lpa2和lpa66-1。本实验对alip1和lpa66-1突变体进行了深入研究，初步探讨了这两个基因编码的蛋白参与调控PSI以及PSII的组装机理。 突变体lpa66-1是一个高叶绿素荧光突变体，与野生型比较生长缓慢，叶色黄，叶绿素含量低。叶绿素荧光慢诱导曲线显示它是一个影响PSII功能的突变体。类囊体膜蛋白的免疫印迹发现lpa66-1突变体中PSII复合物的累积量降低到野生型的30%左右，其他复合物的含量变化不大。体内蛋白标记实验显示，PSII反应中心蛋白D1，D2的合成速率下降，PSII核心蛋白的周转加快。新合成的蛋白组装进PSII的效率比野生型显著降低。LPA66是一个定位于叶绿体的PPR蛋白。因为野生型拟南芥LPA66蛋白能够特异性的编辑psbF转录本，故野生型psbF转录本中第77C被编辑为77U，从而使相应的氨基酸序列中第26个氨基酸丝氨酸被编辑为苯丙氨酸，而lpa66-1突变体中，LPA66蛋白的缺失导致该位点不能被编辑，PSII复合体也不能有效组装。 Alb3/Oxa1p/YidC蛋白家族广泛的参与蛋白质转运和多亚基复合物组装，采用分裂泛素化酵母双杂交发现与Alb3相互作用蛋白ALIP1。突变体alip1也是一个高叶绿素荧光突变体，叶色黄，在土里生长极为缓慢，且不能开花，不育。叶绿素荧光慢诱导曲线显示，突变体中PSII功能基本没有受影响；而P700显示alip1是一个影响PSI功能的突变体。类囊体膜蛋白的免疫印迹发现突变体中PSI核心蛋白PsaA/B的累积量为野生型的40%左右，而PSII及其他复合物的含量无明显变化。Northern印迹结果显示PsaA/B在转录水平不受影响，而体内蛋白标记实验显示，PSI反应中心蛋白PsaA/B的合成速度下降。蔗糖密度梯度离心分析类囊体膜蛋白的组分显示ALIP1能够与Alb3共迁移。而Alb3对于类囊体膜上大分子复合体的组装有重要作用，我们推测，ALIP1可能与Alb3形成一个复合物，或者作为一个中间体介导Alb3参与PSI的组装。