纳米银体外抗HIV 活性的研究

［ 目的］ 制备纳米银颗粒并检测其抗人类免疫缺陷病毒（HIV） 活性及其体内外毒性， 探讨纳米银体外抗 HIV 的作用机制。［ 方法］ 在体外培养C8166 细胞中加入不同浓度的纳米银， 检测其体外细胞毒性CC50； 不同病毒株 感染细胞， 同时加入不同浓度的纳米银， 孵育后检测细胞病变及病毒抗原， 检测纳米银对HIV 的抑制作用。纳米银滴鼻 处理小鼠， 检测小鼠体重变化， 并进行病理切片， 观察纳米银滴鼻处理小鼠的肝、肾及肺组织的病理变化。［ 结果］ 纳米银颗粒对C8166 细胞毒性的CC50 为105.73 μg ／ ml， 抑制HIV 实验株HIV-1IIIB， HIV-2CBL-20 诱导细胞病变的 EC50 分别为26.56 μg ／ ml 和35.47 μg ／ ml； 抑制HIV-1IIIB p24 抗原产生的EC50 为9.80 μg ／ ml； 直接杀病毒作用的EC50 为 12.08 μg ／ ml。纳米银经滴鼻处理的小鼠， 其体重及肝、肾及肺组织切片与对照组比较， 均无明显改变。［ 结论］ 纳米 银有较好的抗HIV 活性， 作用机制可能主要通过直接杀病毒来抑制HIV 的复制； 纳米银在呼吸道黏膜局部应用无明显 的毒副作用， 作为黏膜表面抗病毒药物， 值得进一步深入研究。

缅甸HIV分子流行病学及与我国HIV流行的相关性

缅甸与我同毗邻，中缅困境线长，人员交往密切，缅甸HlV毒株可以通过各种途径传人 我国，有可能成为我国新型HIV毒株传播和流行的来源，使我国HIV病毒亚捌的流行更加复杂多样。 通过加强埘缅甸HIV感染人群的病毒弧型的分析研究，将有利于监测我闷HIV流行株的分布和流行 特点，从而采取有效的应对措施，为防止新的HIV亚型和重组型在我国的传播和扩大流行做好积极 的准备工作。

A switch-on mechanism to activate maize ribosome-inactivating protein for targeting HIV-infected cells

Maize ribosome-inactivating protein (RIP) is a plant toxin that inactivates eukaryotic ribosomes by depurinating a specific adenine residue at the a-sarcin/ricin loop of 28S rRNA. Maize RIP is first produced as a proenzyme with a 25-amino acid internal inactivation region on the protein surface. During germination, proteolytic removal of this internal inactivation region generates the active heterodimeric maize RIP with full N-glycosidase activity. This naturally occurring switch-on mechanism provides an opportunity for targeting the cytotoxin to pathogen-infected cells. Here, we report the addition of HIV-1 protease recognition sequences to the internal inactivation region and the activation of the maize RIP variants by HIV-1 protease in vitro and in HIV-infected cells. Among the variants generated, two were cleaved efficiently by HIV-1 protease. The HIV-1 protease-activated variants showed enhanced N-glycosidase activity in vivo as compared to their un-activated counterparts. They also possessed potent inhibitory effect on p24 antigen production in human T cells infected by two HIV-1 strains. This switch-on strategy for activating the enzymatic activity of maize RIP in target cells provides a platform for combating pathogens with a specific protease.

APOBEC3G抗HIV一1作用机制研究进展

】APOBEC3G是细胞内新的广谱抗病毒蛋白。它具有胞苷脱氨酶活性，能使病毒负链 DNA产生dC--·dU高发突变，造成正链DNA G---A突变，使得病毒DNA变成无功能或降解。APO— BEC3G具有广泛的生物学功能，可以限制HIV-1等病毒复制，但HIV-1病毒感染因子Vii能拮抗 APOBEC3G抑制病毒活性作用。本文简要综述了APOBEC3G抑制病毒HIV-1作用机制的最新进 展。

Recombinant protein of heptad-repeat HR212, a stable fusion inhibitor with potent anti-HIV action in vitro

HR212, a recombinant protein expressed in Escherichia coli, has been previously reported to inhibit HIV-1 membrane fusion at low nanomolar level. Here we report that HR212 is effective in blocking laboratory strain HIV-1IIIB entry and replication with EC50 values of 3.92±0.62 and 6.59±1.74 nM, respectively, and inhibiting infection by clinic isolate HIV-1KM018 with EC50 values of 44.44±10.20 nM, as well as suppressing HIV-1- induced cytopathic effect with an EC50 value of 3.04±1.20 nM. It also inhibited HIV-2ROD and HIV-2CBL-20 entry and replication in the μM range. Notably, HR212 was highly effective against T20-resistant strains with EC50 values ranging from 5.09 to 7.75 nM. Unlike T20, HR212 showed stability sufficient to inhibit syncytia formation in a time-of-addition assay, and was insensitive to proteinase K digestion. These results suggest that HR212 has great potential to be further developed as novel HIV-1 fusion inhibitor for treatment of HIV/ AIDS patients, particularly for those infected by T20-resistant variants.

HIV抗原抗体联合检测试剂盒适用于体外病毒感染p24抗原检测

比较Vironostika HIV UniformⅡAg/Ab抗原抗体联合检测试剂盒、Vironostika HIV-1 p24抗原检测试剂盒和自制p24单克隆抗体在实验室检测不同HIV毒株体外细胞感染复制的灵敏度。比较3种检测方法在抗HIV药物筛选研究中的应用。方法：HIV抗原抗体联合检测试剂盒和p24抗原检测试剂盒检测严格按说明书操作。自制p24单克隆抗体检测HIV-1 p24抗原采用Fc抗体捕捉双抗夹心法。结果: 3种检测方法检测病毒谱相同，p24抗原检测试剂盒灵敏度最高，HIV抗原抗体联合检测试剂盒其次，自制p24抗原检测法灵敏度最低。检测抗HIV药物AZT 和 IDV抑制病毒复制的剂量曲线，HIV抗原抗体联合检测试剂盒与自制p24抗原检测法均可呈现很好的“S”型剂量曲线，检测IC50一致。HIV抗原抗体联合检测试剂盒灵敏度比自制p24抗原检测法高20倍。p24抗原检测试剂盒灵敏度高但检测范围窄(5-80pg/mL)，导致剂量曲线不明显。 结论: HIV抗原抗体联合检测试剂盒适用于实验室体外病毒感染复制的p24抗原检测。

中国部分地区未经治疗HIV-1 感染者耐药基因研究

高效抗逆转录病毒治疗(HAART)的应用，极大的降低了AIDS发病率和死亡 率，延长了HIV感染者的生命。但HIV耐药在很大程度上影响了HAART的疗效， 耐药株的产生成为影响抗病毒治疗效果的主要因素。欧洲、美国的耐药监测技术 规范均推荐在新感染未经抗病毒药物治疗的患者中进行原发耐药检测。我国政府 于2003年底出台了艾滋病治疗的“四免一关怀”政策，陆续在全国范围内开展了大 规模的免费抗病毒治疗，监测我国未经抗病毒药物治疗HIV-1感染者中的耐药情 况可以为制定合理的用药方案和减少耐药毒株出现提供科学依据。 根据世界卫生组织(WHO)的“HIV 耐药监测指南”，无偿献血者中的HIV-1 感染者，可以认定为HIV 新诊断未治疗人群。分析了云南无偿献血者的血浆和 外周血单核细胞(PBMC)，研究云南无偿献血人群的耐药状况。 已有实验室血清学方法识别HIV-1 新近感染和长期感染，用BED-CEIA 方 法，在河南、安徽、山西自愿咨询检测(VCT)人群中检出新近感染人群，进行耐 药基因研究, 对照研究了部分长期感染人群。 样品提取核酸后，巢式聚合酶链反应(nested-PCR)扩增pol 基因区(含蛋白酶 区1～99 氨基酸全长和逆转录酶区1～242 氨基酸)。PCR 产物双脱氧法测序，所 得序列与洛斯阿拉莫斯HIV 核酸序列库(Los Alamos HIV Database)标准株构建系 统进化树分析亚型；用斯坦福大学耐药数据库(Standford HIV Drug Resistance Database)分析耐药。 研究发现，云南省2005～2006 年无偿献血者中，有52 例为HIV-1 阳性，其 中49 例血浆和相应的PBMC 样品病毒基因扩增成功。序列分析表明，HIV 病毒 的亚型分布为CRF08_BC (51.0%), CRF07_BC (24.5%), CRF01_AE (20.4%)和B (4.1%)；所有样品均未发现蛋白酶抑制剂（PI）耐药基因位点主要突变，只在6 例(11.7%)样品中发现7 例次PI 次要耐药位点突变；另外，在9 例(18.4%)样品中发现10 例次核苷类逆转录酶抑制剂(NRTI) 耐药突变，1 例(2.0%)发生非核苷类 逆转录酶抑制剂(NNRTI) 耐药突变；针对具体药物PI/NRTI/NNRTI 均只有1 例 有潜在的低度耐药，临床仍对药物敏感。PBMC 和血浆的病毒耐药没有显著差异。 从河南、安徽、山西27 个VCT 检测点2006～2007 年采集的10310 例样品 中，通过WB 和BED-CEIA 检测出新近感染人群63 例，分析成功50 例血浆样 品；河南VCT 长期感染样品中随机抽样，分析成功19 例样品。分析成功的69 例VCT 样品中，HIV 病毒株的亚型分布分别为B’ (95.7%)，CRF01_AE(2.9%)和 C(1.4%)。上诉样品均未检出PI 主要耐药相关突变，只在26 例(37.7%)样品中存 在27 例次PI 次要耐药相关突变；3 例(4.3%)样品出现6 例次NRTI 耐药相关突 变，7 例(10.1%)样品出现8 例次NNRTI 耐药相关突变。通过与斯坦福大学耐药 数据库比对，没有发现针对PI 类药物的临床耐药；但有2 例(2.8%)针对NRTI 类 药物耐药，1 例有M184V 突变导致对拉米夫定(3TC)和氟代拉米夫定(FTC)高度 耐药；1 例样品存在T215Y、M41L、L210W 三重突变位点，对阿巴卡韦(ABC)、 去羟肌苷(ddI)和坦那夫韦(TDF)中度耐药，对齐多夫定(AZT)和司他夫定(d4T)高 度耐药；针对NNRTI 类药物，有3 例(4.3%)毒株有耐药，1 例有K103N 突变导 致对奈韦拉平(NVP)、地拉韦啶(DLV)和依菲韦伦(EFV)的高度耐药；1 例有Y188L 突变导致对NVP 和EFV 的高度耐药；1 例存在K101E 和G190A 双重突变，导 致对NVP 的高度耐药，对DLV、EFV 和依曲韦林(ETR)中度耐药。 比较长期感染和新近感染者之间的亚型和耐药，未发现显著差异。 研究结果表明，云南、河南和安徽未经治疗HIV-1 感染者中耐药处于低流行 状态。亚型分布云南无偿献血者以CRF_BC 为主，河南、安徽VCT 人群以B’ 为主。应持续在未经治疗人群中进行耐药监测。

天花粉蛋白诱导HIV-1 慢性感染细胞凋亡及机制研究

天花粉蛋白（Trichosanthin,TCS）是一种由247 个氨基酸组成的Ⅰ型核糖 体失活蛋白（Ribosome Inactivating Protein，RIP），从葫芦科植物栝楼 (Trichosanthes Kirilowii)球根中提纯获得。它具有广谱的生物学和药学活性， 包括抗肿瘤、免疫抑制、中期引产以及抗病毒活性。上世纪八十年代末， McGrath 等发现TCS 可以抑制HIV-1 在急性感染的T 淋巴细胞和慢性感染的 巨噬细胞中的复制，从而引起了研究者们极大的兴趣。但迄今为止，其抗HIV-1 的作用机制仍不清楚。 我们实验室对TCS 的免疫毒理作用和抗HIV-1 作用进行了多年的研究， 前期工作显示TCS 对HIV-1 的直接作用并不明显，但对于HIV-1 感染细胞却 具有很强的毒性作用。提示TCS 可能通过作用于宿主细胞来发挥其抗HIV-1 活性。在此基础上，我们从细胞方面着手，对TCS 选择性杀伤HIV-1 感染细 胞的作用及机制进行了探讨。首先，通过MTT 法检测发现，相同条件下，TCS 对于H9/HIV-1IIIB 细胞的毒性远远大于其对正常H9 细胞的毒性。其次，流式 细胞仪检测亚二倍体小峰和琼脂糖凝胶电泳检测片断化DNA 的实验证实了 TCS 对H9/HIV-1IIIB 的细胞杀伤作用是通过诱导细胞凋亡实现的。流式细胞仪 的结果显示TCS 以剂量依赖的方式诱导较多的H9/HIV-1IIIB 细胞凋亡，25μ g/mlTCS 作用24h 时，有8.4%的H9 细胞凋亡，而H9/HIV-1IIIB 细胞的凋亡率 则达到24.5%；随着作用浓度的降低，这种差异也在缩小。阳性对照D-Sorbitol 对两种细胞的凋亡率没有明显差别，约为25%。琼脂糖凝胶电泳的结果进一 步证实了这种推测，相同条件下，TCS 诱导H9/HIV-1IIIB 细胞出现更多的DNA 片断化。 TCS 可以选择性的诱导H9/HIV-1IIIB 细胞凋亡，为了进行更深入的机制研 究，我们建立了另外一株HIV-1 慢性感染细胞系，HIV-1 慢性感染的Jurkat 细胞系（Jurkat/HIV-1ⅢB）来验证TCS的作用。发现相同条件下，TCS可以诱 导同等程度的Jurkat/HIV-1ⅢB和Jurkat 细胞凋亡，25μg/mlTCS作用24h 时， 分别有21.08%的Jurkat 细胞和27.27%的Jurkat/HIV-1IIIB 细胞凋亡。以上的结 果说明HIV-1 感染H9 细胞后增强了感染细胞对TCS 的敏感性，而HIV-1 感 染Jurkat 细胞后并不影响其对TCS 的敏感性。根据细胞凋亡途径中是否依赖 线粒体的参与可以将细胞分成TypeⅠ和TypeⅡ两种类型，H9 细胞采取的是 线粒体非依赖性的TypeⅠ型凋亡途径，而Jurkat 细胞则采取线粒体依赖性的 TypeⅡ型凋亡途径。由于Jurkat 细胞对TCS 诱导的凋亡更加敏感，我们推测 HIV-1 感染H9 细胞后，诱导了细胞凋亡途径由TypeⅠ向TypeⅡ型转变。为 此，我们采用流式细胞仪检测了TCS 对凋亡细胞内的线粒体膜电位及 caspase-8 蛋白酶活性的影响，结果显示，H9/HIV-1IIIB、Jurkat 和Jurkat/HIV-1IIIB 细胞对TCS 诱导的凋亡具有相同程度的敏感性，并且伴随着细胞线粒体膜电 位的耗散和caspase-8 蛋白酶的活化；而相同情况下，TCS 对H9 细胞的影响 则很微弱。由此，进一步证实了我们的推测，即HIV-1 感染H9 细胞后，通过 改变细胞内的某些信号，使H9/HIV-1ⅢB细胞的性状更加倾向于Type Ⅱ型细 胞，从而增强其对于TCS 的敏感性.