木根麦冬rRNA基因进化的研究

木根麦冬（Ophiopogon xylorrhizus Wang et Dai）属于铃兰科（Convallariaceae）或广义百合科（Liliaceae s.l.）沿阶草族（Ophiopogoneae）沿阶草属（Ophiopogon Ker-Gawl.），属于典型的濒危植物。前人已从细胞学、种群生态学、生殖生物学和遗传结构与多样性等方面对木根麦冬进行了研究，但在分子进化和分子细胞遗传学水平上的研究近为空白。本文运用染色体的荧光原位杂交(FISH)、PCR扩增和克隆、DNA测序、系统发育重建等方法，对18S rDNA作了染色体原位定位，研究了木根麦冬的Ss rRNA基因结构特点，并重建了该基因的系统发育树，探讨了5S rRNA多基因家族的分子进化模式和木根麦冬的濒危机制。主要结果如下： 1．对木根麦冬三个居群七个个体、及其最近姐妹种林生麦冬（Ophiopogon svlvicola Wang et Tang）一个个体的5S rRNA基因进行了PCR扩增和TA克隆，在两个种中共得到1085个具有插入片段的阳性克隆。 2．对木根麦冬三个居群六个个体的294个SS rRNA基因克隆，及林生麦冬一个个体的45个克隆，总计339个克隆进行了DNA序列测定，这是目前已完成的最大的单个物种的5S rRNA数据。结果表明：两个种的序列高度多样化，在339个拷贝中仅仅有13对(3.8%)是相同的，序列长度变化在307bp-548bp之间，长度变异主要发生在间隔区，单个碱基的插入和缺失(indel)频率很高，5bp以上片段的插入，缺失有11个，插入的序列通常是其两侧序列的重复和倒位。术根麦冬序列的分化指数（sequence differentiation index，SDI）是0.078，林生麦冬是0.032，两个物种间是0.149，木根麦冬的序列之间的分化明显大于林生麦冬。 3．以PAUP程序对339个5S rRNA基因拷贝的DNA序列（包括编码区和间隔区）作了系统发育分析，结果如下：在得到一个唯一的最俭约树中，所有木根麦冬的拷贝被聚成一支，而林生麦冬的则被聚到另一支，统计支持率(bootstrap)达到lOO%，表明这两个物种所有的的5S rRNA基因拷贝分别来自各自的一个祖先拷贝（建立者拷贝），而其共同祖先的其它拷贝则在物种形成中或之后丢失：在多基因家族中如此长期而单一的拷贝偏选( sorting)过程尚未有前人报道;由此基因系统发育树可以看出，在这两个物种形成之后，“建立者拷贝”经历了多次扩增过程而形成了一个直系的（orthologous）多基因家族。 4．在木根麦冬分支中，很少有亚分支是全部由一个居群或一个个体的拷贝组成的，不同居群、不同个体的拷贝混合在同一个亚分支中;对基因系统发育树、序列多样性和序列分化指数分析表明，5S rRNA基因家族内一致化（homogeruzation）过程很弱，不同拷贝是独立进化的，这在串联．重复的多拷贝基因家族中是不寻常的;由上述分析我们推测，在术根麦冬的进化历史上，居群间的基因交流远远比今天频繁，可能是某些外在因素在近期发生变化，导致自交和自交衰退，并进而导致濒危。 5．利用荧光原位杂交技术，成功地将18S rRNA基因定位在木根麦冬减数分裂期的染色体上，两对强信号和一对弱信号分别位于三对二价体染色体上。

松属植物rRNA基因的变异模式及其进化生物学意义

被子植物的rRNA基因已经得到深入研究。二倍体被子植物一般拥有1-4对18S-5.8S-26S rDNA位点和1-2对5S rDNA位点。作为特殊的多基因家族成员，rDNA会受均一化力 (homogenizing forces) 的作用，通过基因转换、不等交换等机制，形成基因的致同进化 (concerted evolution)。长期以来，我们一直认为动植物rDNA致同进化水平很高，各种拷贝的序列几乎完全一致，因此可以直接应用PCR测序的方法进行分子系统学研究。但是在裸子植物中由于研究资料的匮乏，使我们对裸子植物rDNA的变异模式了解甚少。松属植物作为裸子植物的最大类群，它的rDNA变异和进化有何特点、与被子植物是否相同，是这个重要类群的进化研究中目前尚未解决的问题。本文的研究内容从三个方面进行： (1)rDNA的染色体定位 目前，松属的18S-5.8S-26S rDNA的染色体定位研究只包括5种植物，其中的3种同时涉及到5S rDNA定位。这些研究结果表明，不同种存在相异的rDNA位点数目，甚至不同的个体的rDNA位点均有变化。其共同点是，18S-5.8S-26S rDNA位点数平均较被子植物多，5S rDNA除Pinus radiata外，在其它种里则与被子植物相似。这种现象是松属或裸子植物的共同特征，亦或是特例呢？有限的研究限制了对裸子植物rDNA的了解。本研究的目的之一就是研究松属植物rDNA的染色体空间分布特征，希望借此了解松属植物间的关系，比较裸子植物和被子植物rDNA在染色体组水平的差异。 (2)5S rDNA的分子进化 5S rDNA的序列水平的进化研究在松属中尚属空白。5S rDNA在染色体数目上没有显示裸子植物与被子植物的差异，是否意味着松属乃至裸子植物的5S rDNA也同被子植物一样——致同进化完全，序列高度一致呢？利用克隆测序方法对松属植物5S rDNA的研究无疑是有开创性的工作，可以探讨裸子植物的5S rDNA的进化机制和种间关系。 (3)杂种基因组研究 杂交物种的起源演化是当前生物学研究的热点，通过杂种基因组的研究，可以了解杂种的的基因组构成，组织方式和进化历史，探讨杂交事件对成种过程的影响及意义。这项研究涉及到高山松、云南松和油松。之所以采用这三种植物，因为等位酶、cpDNA和mtDNA证据证明高山松为油松和云南松的自然杂交种。但这些证据不足以反映杂种核基因组的重组特征和构成及其进化规律。我们利用rDNA-FISH、5S rDNA和基因组原位杂交分析三种松树间的基因组关系，为揭示高山松的进化机制和历史提供新的依据。 本项研究得到以下结果： 一. rDNA荧光原位杂交 (FISH) 通过对华山松和白皮松两种单维管束亚属植物及油松、云南松、高山松、马尾松和南亚松等五种双维管束亚属植物的18S rDNA与5S rDNA的荧光原位杂交，结果表明： ⑴ 裸子植物的18S rDNA位点数目明显多于二倍体被子植物。其中主要位点数目，油松有7对，高山松5对，云南松8对，马尾松10对，南亚松6对，白皮松3对，华山松10对，平均在7对;另外，部分松树还存在弱位点。无论强弱位点都有部分存在于染色体的着丝粒区，除了赤松 (Pinus densiflora)，在其它松科植物中并没有发现这种现象。究竟是基因转移的结果或该位点是18S rDNA的原始起源位置还有待确证。 ⑵ 5S rDNA位点相对变异较小，与被子植物相当。除了华山松5S rDNA有4对位点，马尾松只有1对位点外，其它松树的5S rDNA位点数目均为2对，并且在双维管束亚属植物中有一对属于弱位点。 ⑶ 两种rDNA存在不同连锁模式。双维管束亚属植物中，5S与18S rDNA连锁在同一染色体的同一臂或两条臂上。在同一染色体臂时，18S rDNA在臂的远端。单维管束亚属植物的5S与18S rDNA或连锁于同一染色体的同一臂上，或分别处于不同染色体。前一情况，5S rDNA位于臂的远端。据此可以说明两个亚属的rDNA结构在染色体组水平的很大分化。 ⑷ 松属植物的关系及高山松核型特征。由于5S与18S rDNA连锁关系的不同，可以将单维管束亚属和双维管束亚属分开。各亚属的不同物种可以依据杂交位点的多少、位置、信号强弱构成的核型图加以区分，并且构成一定的系统关系。杂交起源的高山松在染色体组上，表现出对油松和云南松两亲本不同染色体特征的分别继承与重组，并产生独有的特征。其II同源染色体之一18S rDNA位点的缺失，可能是染色体重组的痕迹。 二. 5S rDNA的序列变异与分子进化 利用分子克隆和DNA测序分析了油松、云南松、马尾松、白皮松和不同遗传背景的高山松居群的5S rRNA基因序列变异及基因进化规律，得到以下主要结果： ⑴ 5S rDNA的结构特征。双维管束亚属植物长度在658-728 bp，白皮松则为499-521 bp。长度差异体现在基因间隔区，而基因区极端保守，基本为120 bp。基因转录区内部存在着转录控制区，决定了5S rRNA的转录起始与转录效率。5S rRNA基因能够折叠成正常的二级结构，其中，相对于干区来说，环区要保守，但环E却表现出异乎寻常的变异，转换/颠换比值高达7.1，这种突变可能是假基因的产物。基因间隔区存在一定的保守单元，其中一些与转录的起始和终止调控相关，有些是裸子植物未知功能的特异保守区。 ⑵ 松属植物5S rDNA存在着基因组内与种间的异质性。基因组内的各个克隆中有超过80%的特异的，彼此不相同。整个5S rDNA分化距离为0.042 - 0.051，其中，间隔区的分化比基因区高，其速度约是基因区的3-7倍。比较种间5S rDNA序列发现：在122个克隆中，基因区只有50个特异的序列。基因组间的序列变异度与基因组内 (个体内) 没有明显差别。白皮松的间隔区与双维管束亚属松树的5S rDNA间隔区差异极大，几乎不能排序，而四种双维管束亚属植物的5S rDNA间隔区种间种内差异不大。 ⑶ 松属植物5S rDNA进化。PAUP分析建立的5S rRNA基因树显示，5S rRNA基因在基因组内是多系的 (polyphyletic)，表明成种事件以前，祖先种就已经存在序列的分化。观测到的5S rRNA基因序列变异状况，并非完全是致同进化或独立进化的单一因素造成的，而是二者的相互作用的结果。致同进化确实存在，只是速度较慢而已。 ⑷ 高山松5S rDNA 组成。高山松拥有最高的基因组内的序列多样性，高山松的5S rDNA拷贝既有亲本类型，又有重组类型，并且不同地理及遗传来源的高山松显示一定的分化趋势，有更多的拷贝来自母系亲本。 三. 基因组原位杂交 以油松和云南松总DNA作为探针，相互进行基因组原位杂交，结果显示云南松和油松的染色体组可以完全被对方探针标记，在现有基因组原位杂交的分辨率下不能将两个基因组区分开。说明云南松和油松基因组之间存在高比例的同源序列，两种松树的基因组组成十分相似。利用油松和云南松总DNA作为探针，对高山松的染色体组进行双探针基因组原位杂交。结果表明，高山松全部基因组都能与两亲本探针完全杂交，说明三者间有着异乎寻常的亲缘关系。但在PH失调影响下，高山松只有部分基因组被杂交，并且两种探针的杂交信号有轻微差异。这可能是高度重复序列优先杂交的结果。这些情况表明，高山松虽然在基因组构成上与两个亲本基本一致，但基因在染色体组的空间排布上是存在差异的，这一点可以从rDNA-FISH中证明。

Chromosomal mapping of 5S ribosomal RNA genes in the eastern oyster, Crassostrea virginica gmelin by fluorescence in situ hybridization

Chromosomal location of the 5S ribosomal RNA gene was studied in the eastern oyster, Crassostrea virginica Gmelin. using fluorescence in situ hybridization (FISH). Metaphase chromosomes were obtained from early embryos, and the FISH probe was made by PCR (polymerase chain reaction) amplification of the 5S rRNA gene and labeled by incorporation of digoxigenin-1 1-dUTP during PCR. Hybridization was detected with fluorescein-labeled antidigoxigenin antibodies. Two pairs of FISH signals were observed on metaphase chromosomes. Karyotypic analysis showed that the 5S rRNA gene cluster is interstitially located on short arms of chromosomes 5 and 6. On chromosome 5, the 5S rRNA genes were located immediately next to the centromere, whereas on chromosome 6, they were located approximately half way between the telomere and the centromere. Chromosomes of C. virginica are difficult to identify because of their similarities in size and arm ratio, and the chromosomal location of 5S rRNA genes provides unambiguous identification of chromosomes 5 and 6. Previous studies have mapped the major rRNA gene cluster (18S-5.8S-28S) to chromosome 2. and this study shows that the 5S rRNA gene cluster is not linked to the major rRNA genes and duplicated during evolution.

Chromosomal rearrangement in Pectinidae revealed by rRNA loci and implications for bivalve evolution

Karyotype and chromosomal localization of major (18-5.8-28S) and minor (5S) ribosomal RNA genes were studied in two species of Pectinidae, zhikong (Chlamys farreri) and bay (Argopecten irradians irradians) scallops. using fluorescence in situ hybridization (FISH). C. farreri had a haploid number of 19 with a karyotype of 3m + 4sm + 7sm-st + 4st + 1st-t, and A. i. irradians had a haploid number of 16 with a karyotype of 5st + 11t. In C. farreri, the major and minor rRNA genes had one locus each and were mapped to the same chromosome-Chromosome 5. In A. i. irradians, the major rRNA genes had two loci, located on Chromosomes 4 and 8, and the 5S rRNA gene was found at a third chromosome-Chromosome 10. Results of this and other studies indicate that karyotype of A. i. irradians (n = 16, 21 arms) is secondary and derived from an ancestral karyotype similar to that of C. farreri (n = 19, 38 arms) through considerable chromosomal loss and rearrangements. The ability to tolerate significant chromosomal loss suggests that the modal karyotype of Pectinidae and possibly other bivalves with a haploid number of 19 is likely tetraploid; i.e., at least one genome duplication has occurred during the evolution of Bivalvia.

松科nrDNA 的进化研究Evolution of nuclear ribosomal DNA in Pinaceae

核核糖体DNA（nrDNA）已被作为一个重要的标记，用于推断很多分类等级上的系统发育关系。相对于在被子植物中的快速致同进化，nrDNA在裸子植物中的致同进化速率低，且ITS和5S-NTS区有着较大的长度变异，这种现象在松科植物中尤为明显。在本研究中，我们克隆并测定了银杉属的5S rDNA以及冷杉属、银杉属、雪松属、油杉属、长苞铁杉属、金钱松属与铁杉属的ITS序列。基于获得的新数据，再结合前人报导的其它属的数据，我们探讨了如下四个问题： （1）松科 nrDNA ITS1 亚重复单位的组成、分布及进化;（2）ITS1区的长度变异与亚重复单位数目的关系以及它们的系统学意义;（3）松科ITS1的二级结构特征;（4）银杉5S rDNA编码区及非转录间隔区的结构特征。主要研究结果如下： 1. ITS区的序列分析ITS区的克隆及序列分析发现：（1） 松科ITS1的长度变异范围为 944-3271 bp, 这是目前已报导的真核生物中属间ITS变异最大的类群之一;（2） 所有松科植物的ITS区域都包含亚重复单位，亚重复单位的数目从2到9，并且这些亚重复单位可分为两种类型，即不含保守核心序列（5’-GGCCACCCTAGTC ） 的长亚重复单位（LSR）和含上述保守核心序列的短亚重复单位（SSR）;（3） ITS1区的巨大长度变异主要归因于亚重复单位的数量变异; （4） ITS1区的GC含量与 它的序列长度和亚重复单位的数目有一定关系，并能够提供一些系统发育信息，特别是支持云杉属、松属和银杉属三者具有很近的亲缘关系。 2. ITS1亚重复单位的系统发育分析为了研究亚重复单位的进化关系，我们用最大似然法和最大简约法构建了松科ITS1亚重复单位的系统发育树。结果表明：（1）在ML和MP树中可发现有共同的五个分支; （2） 银杉比松科其它属拥有更多的SSR，且该属的所有9个SSR在系统树中构成一个单系支，表明它们是在银杉属内发生重复的;（3）一些SSR在属间和种间具有同源性，可为nrDNA ITS 的进化历史以及松科的系统发育 研究提供重要信息;（4）亚重复单位的多次重复以及伴随的重组可能是导致LSR 和SSR在松科不同属中分布式样不同的原因。 3. 松科ITS1的二级结构 用 Mfold 3.2 软件对松科所有11个属的ITS1区进行了二级结构预测，共获得了563个最低自由能折叠。结合以前关于松科二级结构的报导，我们分析的结果表明：（1） 松科ITS1的二级结构主要由几个延展的发夹结构组成;（2） 构象的复杂性与亚重复的数目呈正相关;（3）配对的亚重复单位通常在保守核心区（5’-GGCCACCCTAGTC ） 处有部分重叠，并且构成一个长茎，而其它的亚重复单位通常会自身折叠，且保守核心区的部分出现在发夹结构的环中。 4. 银杉5S rDNA 序列分析 我们对来自银杉不同群体的3个个体的5S rDNA进行了克隆，共获得 45 条序列，分析结果表明：（1） 绝大多数银杉5S rDNA编码区长度为120 bp, 以GGG 开头，以CTC结尾，编码区出现的碱基替代主要为转换;（2） 银杉与其它裸子植物相比，5S rDNA基因编码区具很高的相似性（90-99%）; （3）间隔区含有一个poly-C和一个poly-T结构、两个TC丰富区以及五个GC丰富区。根据长度和序列特征，银杉的5S rDNA间隔区可分为三种类型：Type A 长751-764 bp，Type B 长770-807 bp （含一个32 bp的插入），Type C 长581-594 bp; （5）长间隔区（Type A，Type B ）中含有两个148-175 bp的串联亚重复单位，该亚重复单位与短间隔区（Type C ）中的一段143 bp的序列具有较高的相似性（56.0-66.8%）。 5. 银杉5S rRNA的二级结构 Mfold 3.2 预测结果表明：（1）银杉5S rRNA二级结构包括5个双螺旋区（干区）（Ⅰ-Ⅴ）、2个发夹结构环区（C和D）、3个中间环区（B1、B2 和 E）和1个铰链区（A）, 铰链区为三个双螺旋的结合处;（2） 二级结构中的环区通常比双螺旋区更加保守;（3）在5个双螺旋中，I 和 IV 区有较高的碱基替代率。

生物系统中的非线性问题

在简略介绍非线性空间及场方程的基础上, 以非线性科学中的孤子概念为例, 结合分子进化和生物大分子结构与功能研究中存在的一些问题, 着重讨论了生物系统在分子层次上的非线性问题, 并运用分形理论对80余种5S rRNA序列的分维进行了计算。参17

贾第虫rDNA的研究

典型的真核生物有四种rRNA（18S、5.8S、28S和5SrRNA）。一般18S、5.8S和28S的基因分别由转录间隔区（ITS）隔开而位于同一个转录单位上构成一个rRNA基因拷贝，多个rRNA基因拷贝串联形成rDNA。rDNA聚集在一起构成核仁组织区（NOR），成为核仁发生的位置。5SrRNA基因除在少数真核生物（如：酵母）中是和18S、28S rRNA基因位于同一个转录单位上外，一般是处在核仁以外的区域。贾第虫一度被认为是现存最原始的真核生物。支持这一观点的一个重要证据之一就是它还不具核仁结构。那么它的rDNA与典型真核生物的相比会有怎样的特点呢？本文在基因组的水平上对贾第虫的rDNA进行了全面调查分析，并对5S rRNA及其相关蛋白进行重点研究，得到如下结果和结论： 1）贾第虫的18S rRNA（1448bp）基因和28S rRNA（2300bp）基因比其他一些真核生物的（一般为1800bp和3400bp）要小的多，甚至比一些原核生物的相应的rRNA基因还要小。不仅如此，其5.8S rRNA基因和28SrRNA基因之间的转录间隔区（ITS2）比典型真核生物的对应区域也要短得多（只有54bp），且GC含量较高。结构预测表明该间隔区不能形成在许多真核生物中所能形成的保守的二级结构。更特别的是，贾第虫基因组中的rRNA基因序列大部分都是不完整的，并且不按照18S-5.8S-28S rRNA基因顺序排列，也没有多个完整拷贝顺序排列的区域。这提示贾第虫rRNA基因可能是以一种不同于典型真核生物的方式聚集的。因此本文认为以上这些特点可能与贾第虫不能形成典型核仁结构有关。 2）本文从贾第虫基因组中鉴定出了5S rRNA基因，并实验验证了其表达及其完整基因序列所编码的5S rRNA具有典型真核生物的T型二级结构，且具有绝大多数保守位点。RT-PCR表明该基因具有转录活性。该结果否定了前人的贾第虫没有5S rRNA的实验结果。并表明贾第虫尽管很原始，但其5S rRNA基因仍然是独立存在的和单独转录的。贾第虫基因组中总共有8个5S rRNA基因拷贝（且其中还有一个拷贝具有15个bp的异常插入）这大大低于一般真核生物的拷贝数。这些5S rRNA基因也不形成串联排列的区域。 我们还在贾第虫中鉴定出在真核生物中唯一与5S rRNA接触的核糖体蛋白L5蛋白并验证了其表达，该序列与其他真核生物的L5蛋白相似性很高，这提示贾第虫在5S rRNA基因转录出核后与L5蛋白结合形成5S RNP的过程可能与典型的真核生物是一致的。此外，我们从贾第虫中鉴定不出符合典型真核生物TFIIIA因子特征的蛋白，这提示贾第虫5S rRNA的转录起始以及转录后出核的机制可能与典型真核生物不同。过去对贾第虫的研究表明高等真核生物里RNA聚合酶III所独有的四个亚基在贾第虫中找不到同源物，而这样不完整的RNA聚合酶III已经可以在贾第虫中完成5S rRNA的转录了，这表明RNA聚合酶III所独有的这些亚基可能是为了完成其他功能而进化出来的。

大银鱼和小齿日本银鱼线粒体细胞色素b 和16S rRNA基因部分序列分析

　对大银鱼和小齿日本银鱼的线粒体细胞色素b 和16S rRNA 基因片段进行了扩增和序列测定,分析比较了2 种 间的序列差异。大银鱼2 个个体间细胞色素b 基因序列无差异,小齿日本银鱼3 个个体的序列出现了2 种单倍型;大银鱼 同小齿日本银鱼细胞色素b 序列(单倍型SB21) 之间存在86 个碱基差异(差异率21 %) ,变异较大。大银鱼、小齿日本银鱼 的16S rRNA 基因片段种内个体间无序列差异,两种间存在21 个碱基的差异(差异率5 %) ,有1 个碱基的插入/ 缺失。由 此可见,2 种银鱼间线粒体细胞色素b 基因的进化速率较快,约为16S rRNA 基因片段的4 倍。根据细胞色素b 序列数据, 推算出2 种银鱼大概在中新世晚期发生分化。

蝰科(Viperidae)蝮亚科(Crotalinae)线粒体12S rRNA基因序列分析及其系统发育

对蝮亚科(蛇岛蝮Gloydius shedaoensis Zhao、黑眉蝮Gloydius saxatilis Emelianov、乌苏里蝮Gloydius ussurriensis Emelianov、竹叶青Trimeresurus stejnegeri Schmidt和分别来自不同地区的尖吻蝮Deinagkistrodon acutus Guenther、短尾蝮Gloydius brevicaudus Stejneger各两条)6种蛇共8个个体测定、分析了约370bp线粒体12S rRNA基因序列,以游蛇科链蛇属半棱鳞链蛇Dinodon semicarinatus序列为外群构建分子系统树。

黄牛、水牛体内人肉孢子虫18S rRNA基因研究及虫种鉴定

对自然感染的水牛源的人肉孢子虫以及黄牛源人肉孢子虫DNA的18S rRNA基因的PCR扩增产物进行了测序。对所获的863 bp的18S rRNA基因分析比较表明，二者有较高的同源性，因此认为二者可能同是一种肉孢子虫——人肉孢子虫（Sarcocystis hominis Railliet and Lucet，1891）。由此推断，不仅黄牛可作为人肉孢子虫的中间宿主，水牛也可作为人肉孢子虫的中间宿主。