Sviluppo e applicazione di nuovi criteri per la verifica a fatica multiassiale di componenti strutturali in leghe di acciaio e alluminio

La presente Tesi ha per oggetto lo sviluppo e la validazione di nuovi criteri per la verifica a fatica multiassiale di componenti strutturali metallici . In particolare, i nuovi criteri formulati risultano applicabili a componenti metallici, soggetti ad un’ampia gamma di configurazioni di carico: carichi multiassiali variabili nel tempo, in modo ciclico e random, per alto e basso/medio numero di cicli di carico. Tali criteri costituiscono un utile strumento nell’ambito della valutazione della resistenza/vita a fatica di elementi strutturali metallici, essendo di semplice implementazione, e richiedendo tempi di calcolo piuttosto modesti. Nel primo Capitolo vengono presentate le problematiche relative alla fatica multiassiale, introducendo alcuni aspetti teorici utili a descrivere il meccanismo di danneggiamento a fatica (propagazione della fessura e frattura finale) di componenti strutturali metallici soggetti a carichi variabili nel tempo. Vengono poi presentati i diversi approcci disponibili in letteratura per la verifica a fatica multiassiale di tali componenti, con particolare attenzione all'approccio del piano critico. Infine, vengono definite le grandezze ingegneristiche correlate al piano critico, utilizzate nella progettazione a fatica in presenza di carichi multiassiali ciclici per alto e basso/medio numero di cicli di carico. Il secondo Capitolo è dedicato allo sviluppo di un nuovo criterio per la valutazione della resistenza a fatica di elementi strutturali metallici soggetti a carichi multiassiali ciclici e alto numero di cicli. Il criterio risulta basato sull'approccio del piano critico ed è formulato in termini di tensioni. Lo sviluppo del criterio viene affrontato intervenendo in modo significativo su una precedente formulazione proposta da Carpinteri e collaboratori nel 2011. In particolare, il primo intervento riguarda la determinazione della giacitura del piano critico: nuove espressioni dell'angolo che lega la giacitura del piano critico a quella del piano di frattura vengono implementate nell'algoritmo del criterio. Il secondo intervento è relativo alla definizione dell'ampiezza della tensione tangenziale e un nuovo metodo, noto come Prismatic Hull (PH) method (di Araújo e collaboratori), viene implementato nell'algoritmo. L'affidabilità del criterio viene poi verificata impiegando numerosi dati di prove sperimentali disponibili in letteratura. Nel terzo Capitolo viene proposto un criterio di nuova formulazione per la valutazione della vita a fatica di elementi strutturali metallici soggetti a carichi multiassiali ciclici e basso/medio numero di cicli. Il criterio risulta basato sull'approccio del piano critico, ed è formulato in termini di deformazioni. In particolare, la formulazione proposta trae spunto, come impostazione generale, dal criterio di fatica multiassiale in regime di alto numero di cicli discusso nel secondo Capitolo. Poiché in presenza di deformazioni plastiche significative (come quelle caratterizzanti la fatica per basso/medio numero di cicli di carico) è necessario conoscere il valore del coefficiente efficace di Poisson del materiale, vengono impiegate tre differenti strategie. In particolare, tale coefficiente viene calcolato sia per via analitica, che per via numerica, che impiegando un valore costante frequentemente adottato in letteratura. Successivamente, per validarne l'affidabilità vengono impiegati numerosi dati di prove sperimentali disponibili in letteratura; i risultati numerici sono ottenuti al variare del valore del coefficiente efficace di Poisson. Inoltre, al fine di considerare i significativi gradienti tensionali che si verificano in presenza di discontinuità geometriche, come gli intagli, il criterio viene anche esteso al caso dei componenti strutturali intagliati. Il criterio, riformulato implementando il concetto del volume di controllo proposto da Lazzarin e collaboratori, viene utilizzato per stimare la vita a fatica di provini con un severo intaglio a V, realizzati in lega di titanio grado 5. Il quarto Capitolo è rivolto allo sviluppo di un nuovo criterio per la valutazione del danno a fatica di elementi strutturali metallici soggetti a carichi multiassiali random e alto numero di cicli. Il criterio risulta basato sull'approccio del piano critico ed è formulato nel dominio della frequenza. Lo sviluppo del criterio viene affrontato intervenendo in modo significativo su una precedente formulazione proposta da Carpinteri e collaboratori nel 2014. In particolare, l’intervento riguarda la determinazione della giacitura del piano critico, e nuove espressioni dell'angolo che lega la giacitura del piano critico con quella del piano di frattura vengono implementate nell'algoritmo del criterio. Infine, l’affidabilità del criterio viene verificata impiegando numerosi dati di prove sperimentali disponibili in letteratura.

Biochemical characterization and DNA binding properties of the MocR family member GabR, a PLP-dependent transcription factor

GabR è un fattore di trascrizione chimerico appartenente alla famiglia dei MocR/GabR, costituito da un dominio N-terminale elica-giro-elica di legame al DNA e un dominio effettore e/o di oligomerizzazione al C-terminale. I due domini sono connessi da un linker flessibile di 29 aminoacidi. Il dominio C-terminale è strutturalmente omologo agli enzimi aminotransferasici fold-type I, i quali, utilizzando il piridossal-5’-fosfato (PLP) come cofattore, sono direttamente coinvolti nel metabolismo degli aminoacidi. L’interazione contemporanea di PLP e acido γ-aminobutirrico (GABA) a GabR fa sì che questa promuova la trascrizione di due geni, gabT e gabD, implicati nel metabolismo del GABA. GabR cristallizza come un omodimero con una configurazione testa-coda. Il legame con la regione promotrice gabTD avviene attraverso il riconoscimento specifico di due sequenze dirette e ripetute (ATACCA), separate da uno spacer di 34 bp. In questo studio sono state indagate le proprietà biochimiche, strutturali e di legame al DNA della proteina GabR di Bacillus subtilis. L’analisi spettroscopica dimostra che GabR interagisce con il PLP formando l’aldimina interna, mentre in presenza di GABA si ottiene l’aldimina esterna. L’interazione fra il promotore gabTD e le forme holo e apo di GabR è stata monitorata mediante Microscopia a Forza atomica (AFM). In queste due condizioni di legame è stata stimata una Kd di circa 40 ηM. La presenza di GABA invece, determinava un incremento di circa due volte della Kd, variazioni strutturali nei complessi GabR-DNA e una riduzione del compattamento del DNA alla proteina, indipendentemente dalla sequenza del promotore in esame. Al fine di valutare il ruolo delle caratteristiche topologiche del promotore, sono state inserite cinque e dieci bp all’interno della regione spacer che separa le due sequenze ripetute dirette riconosciute da GabR. I significativi cambiamenti topologici riscontrati nel frammento aggiunto di cinque bp si riflettono anche sulla forte riduzione dell’affinità di legame verso la proteina. Al contrario, l’inserzione di 10 bp provoca solamente l’allontanamento delle sequenze ripetute dirette. L’assenza quindi di cambiamenti significativi nella topologia di questo promotore fa sì che l’affinità di legame per GabR rimanga pressoché inalterata rispetto al promotore non mutato. L’analisi del potenziale elettrostatico superficiale di GabR mostra la presenza di una fascia carica positivamente che si estende lungo un’intera faccia della proteina. Per verificare l’importanza di questa caratteristica di GabR nel meccanismo di interazione al DNA, sono stati preparati ed indagati i mutanti R129Q e K362-366Q, in cui la carica positiva superficiale risultava indebolita. L’affinità di legame dei mutanti di GabR per il DNA era inferiore rispetto alla proteina non mutata, in particolar modo nel mutante K362-366Q. Le evidenze acquisite suggeriscono che la curvatura intrinseca del promotore ed il corretto orientamento delle sequenze sulla doppia elica, più della distanza che le separa, siano critici per sostenere l’interazione con GabR. Oltre a questo, la superficie positiva di GabR è richiesta per accomodare la curvatura del DNA sul corpo della proteina. Alla luce di questo, l’interazione GabR-gabTD è un esempio di come il riconoscimento specifico di sequenze, la topologia del DNA e le caratteristiche strutturali della proteina siano contemporaneamente necessarie per sostenere un’interazione proteina-DNA stabile.

Indagine modellistica sulla tenuta idraulica delle difese arginali deputate alla protezione idraulica del territorio

La prima parte di questo lavoro di tesi tratta dell’interazione tra un bacino di laminazione e il sottostante acquifero: è in fase di progetto, infatti, la costruzione di una cassa di espansione sul torrente Baganza, a monte della città di Parma. L’obiettivo di tale intervento è di ridurre il rischio di esondazione immagazzinando temporaneamente, in un serbatoio artificiale, la parte più pericolosa del volume di piena che verrebbe rilasciata successivamente con portate che possono essere agevolmente contenute nel tratto cittadino del torrente. L’acquifero è stato preliminarmente indagato e monitorato permettendone la caratterizzazione litostratigrafica. La stratigrafia si può riassumere in una sequenza di strati ghiaioso-sabbiosi con successione di lenti d’argilla più o meno spesse e continue, distinguendo due acquiferi differenti (uno freatico ed uno confinato). Nel presente studio si fa riferimento al solo acquifero superficiale che è stato modellato numericamente, alle differenze finite, per mezzo del software MODFLOW_2005. L'obiettivo del presente lavoro è di rappresentare il sistema acquifero nelle condizioni attuali (in assenza di alcuna opera) e di progetto. La calibrazione è stata condotta in condizioni stazionarie utilizzando i livelli piezometrici raccolti nei punti d’osservazione durante la primavera del 2013. I valori di conducibilità idraulica sono stati stimati per mezzo di un approccio geostatistico Bayesiano. Il codice utilizzato per la stima è il bgaPEST, un software gratuito per la soluzione di problemi inversi fortemente parametrizzati, sviluppato sulla base dei protocolli del software PEST. La metodologia inversa stima il campo di conducibilità idraulica combinando osservazioni sullo stato del sistema (livelli piezometrici nel caso in esame) e informazioni a-priori sulla struttura dei parametri incogniti. La procedura inversa richiede il calcolo della sensitività di ciascuna osservazione a ciascuno dei parametri stimati; questa è stata valutata in maniera efficiente facendo ricorso ad una formulazione agli stati aggiunti del codice in avanti MODFLOW_2005_Adjoint. I risultati della metodologia sono coerenti con la natura alluvionale dell'acquifero indagato e con le informazioni raccolte nei punti di osservazione. Il modello calibrato può quindi essere utilizzato come supporto alla progettazione e gestione dell’opera di laminazione. La seconda parte di questa tesi tratta l'analisi delle sollecitazioni indotte dai percorsi di flusso preferenziali causati da fenomeni di piping all’interno dei rilevati arginali. Tali percorsi preferenziali possono essere dovuti alla presenza di gallerie scavate da animali selvatici. Questo studio è stato ispirato dal crollo del rilevato arginale del Fiume Secchia (Modena), che si è verificato in gennaio 2014 a seguito di un evento alluvionale, durante il quale il livello dell'acqua non ha mai raggiunto la sommità arginale. La commissione scientifica, la cui relazione finale fornisce i dati utilizzati per questo studio, ha attribuito, con molta probabilità, il crollo del rilevato alla presenza di tane di animali. Con lo scopo di analizzare il comportamento del rilevato in condizioni integre e in condizioni modificate dall'esistenza di un tunnel che attraversa il manufatto arginale, è stato realizzato un modello numerico 3D dell’argine mediante i noti software Femwater e Feflow. I modelli descrivono le infiltrazioni all'interno del rilevato considerando il terreno in entrambe le porzioni sature ed insature, adottando la tecnica agli elementi finiti. La tana è stata rappresentata da elementi con elevata permeabilità e porosità, i cui valori sono stati modificati al fine di valutare le diverse influenze sui flussi e sui contenuti idrici. Per valutare se le situazioni analizzate presentino o meno il verificarsi del fenomeno di erosione, sono stati calcolati i valori del fattore di sicurezza. Questo è stato valutato in differenti modi, tra cui quello recentemente proposto da Richards e Reddy (2014), che si riferisce al criterio di energia cinetica critica. In ultima analisi è stato utilizzato il modello di Bonelli (2007) per calcolare il tempo di erosione ed il tempo rimanente al collasso del rilevato.

Efficacia della formazione alla salute e sicurezza sul lavoro: fattori di successo e criticità

Background: sulla base delle evidenze emerse dalle rassegne sistematiche in materia (Johnstone, 1994; Cohen et al.,1998; Robson et al., 2012; Burke et al., 2006; Ricci et al., 2015) si è ipotizzato che la formazione alla salute e sicurezza sul lavoro sia maggiormente efficace quando non è presentata come obbligatoria e venga articolata su più livelli di apprendimento, attraverso metodologie adeguate per ogni livello, con docenti che abbiano caratteristiche corrispondenti allo specifico obiettivo di apprendimento e la cui durata sia parametrata all’obiettivo stesso. Obiettivo di questa ricerca è valutare se esista e quanto sia intensa la relazione causale tra la formazione alla sicurezza sul lavoro e i suoi effetti sul miglioramento delle conoscenze, degli atteggiamenti, dei comportamenti, degli esiti per la salute, del clima di sicurezza aziendale, del controllo comportamentale percepito dai lavoratori, delle condizioni operative e procedure interne, oltre l’eventuale effetto di moderazione determinato da caratteristiche socio-demografiche dei partecipanti e dal gradimento della formazione. Metodo: la variabile indipendente è costituita dell’intervento formativo erogato, articolato in tre condizioni: formazione obbligatoria, formazione non obbligatoria, gruppo di controllo: sono stati posti a confronto due interventi di pari durata (16 settimane, per 10h complessive), realizzati con identiche modalità (step1 audio-visivo; step2 affiancamento su lavoro da parte del preposto; step3 discussione di auto-casi), ma differenziati rispetto all’essere presentati uno come formazione obbligatoria, l’altro come non obbligatoria. I due gruppi sono anche stati confrontati con un gruppo di controllo per il quale la formazione è prevista successivamente. I partecipanti sono stati assegnati in modo casuale al gruppo con obbligo formativo, senza obbligo formativo, di controllo. Sono stati presi come indicatori (variabili dipendenti) per valutare l’effetto della formazione: I livello – conoscenze: riconoscimento o produzione di un maggior numero di risposte corrette. II livello – atteggiamenti e credenze: maggiore propensione a mettere in atto comportamenti auto ed etero protettivi. III livello – comportamenti: comportamenti osservati più adeguati per la tutela della salute propria e altrui. IV livello – salute: maggior grado di benessere bio-psico-sociale auto-riferito. Le misure di esito consistono nella variazione tra la rilevazione iniziale e ogni rilevazione successiva, sulla base delle diverse misure registrate per ognuno dei quattro livelli dell’intervento formativo. Lo stesso confronto del tempo è stato realizzato per le misure del clima di sicurezza aziendale, del controllo comportamentale percepito dai lavoratori, delle condizioni operative e procedure interne, oltre l’eventuale effetto di moderazione determinato da caratteristiche socio-demografiche dei partecipanti e dal gradimento della formazione, quest’ultimo misurato solo immediatamente al termine dell’intervento. Risultati: le condizioni di intervento non differiscono in termini di efficacia, la formazione determina infatti gli stessi risultati per i partecipanti del gruppo obbligo formativo e di quello non obbligo, con una significativa differenza post-intervento rispetto al gruppo di controllo. La formazione ha un effetto forte nel miglioramento delle conoscenze che solo parzialmente decade nel tempo, ma comunque mantenendo un livello maggiore rispetto ai valori iniziali. In relazione al miglioramento di atteggiamenti e comportamenti sicuri nel lavoro al Videoterminale, l’effetto della formazione è modesto: per gli atteggiamenti si registra solo un miglioramento verso l’applicazione delle procedure come utili realmente e non come mero adempimento, ma tale effetto decade entro quattro mesi riportando i partecipanti su valori iniziali; i comportamenti invece migliorano nel tempo, ma con deboli differenze tra partecipanti alla formazione e gruppo di controllo, tuttavia tale miglioramento non decade in seguito. Non si registrano invece effetti della formazione nella direzione attesa in termini di esiti per la salute, per il miglioramento del clima di sicurezza e come maggior controllo comportamentale percepito, non risultano nemmeno dati evidenti di moderazione degli effetti dovuti a caratteristiche socio-demografiche dei partecipanti. Inoltre emerge che il gradimento per la formazione è correlato con migliori atteggiamenti (strumento audio-visivo), il miglioramento del clima di sicurezza e un maggior controllo comportamentale percepito (studio di auto-casi), ovvero gli step che hanno visto l’intervento di formatori qualificati. Infine, la formazione ha determinato migliori condizioni operative e l’adeguamento delle procedure interne. Conclusioni: la presente ricerca ci consente di affermare che la formazione erogata è stata efficace, oltre che molto gradita dai partecipanti, in particolare quando il formatore è qualificato per questa attività (step1 e 3). L’apprendimento prodotto è tanto più stabile nel tempo quanto più i contenuti sono in stretta relazione con l’esperienza lavorativa quotidiana dei partecipanti, mentre negli altri casi il decremento degli effetti è alquanto rapido, di conseguenza ribadiamo la necessità di erogare la formazione con continuità nel tempo. E’ risultato comunque modesto l’effetto della formazione per migliorare gli atteggiamenti e i comportamenti nel lavoro al VDT, ma, al di là di alcuni limiti metodologici, sono obiettivi ambiziosi che richiedono più tempo di quanto abbiamo potuto disporre in questa occasione e il cui conseguimento risente molto delle prassi reali adottate nel contesto lavorativo dopo il termine della formazione. Le evidenze finora prodotte non hanno poi chiarito in modo definitivo se attraverso la formazione si possano determinare effetti significativi nel miglioramento di esiti per la salute, anche eventualmente attraverso interventi di supporto individuale. Inoltre l’assenza di differenze significative negli effetti tra i partecipanti assegnati alla condizione di obbligo e quelli di non obbligo, eccezion fatta in direzione opposta alle attese per la misura del danno da lavoro, suggeriscono che nell’erogare la formazione, occorre sottolineare in misura molto rilevante l’importanza dell’intervento che viene realizzato, anche qualora esistesse una prescrizione normativa cogente. Infine, la ricerca ci ha fornito anche indicazioni metodologiche e misure valide che invitano ad estendere questa formazione, e la sua valutazione di efficacia, a diversi comparti economici e svariate mansioni. Nel fare questo è possibile fare riferimento, e testare nuovamente, un modello che indica la corretta percezione del rischio (conoscenza) come fattore necessario, ma non sufficiente per ottenere, con la mediazione di atteggiamenti favorevoli allo specifico comportamento, azioni sicure, attraverso le quali si rinforza l’atteggiamento e migliorano le conoscenze. La formazione, per raggiungere i propri obiettivi, deve tuttavia agire anche sui meccanismi di conformismo sociale favorevoli alla safety, questi originano da conoscenze e azioni sicure e reciprocamente le rinforzano.

Interazione di nanoparticelle metalliche con menbrane biologiche: risultati di studi in vitro su cute, mucosa del cavo orale e meningi ed implicazioni per la salute

L’utilizzo di nanomateriali, ovvero una nuova classe di sostanze composte da particelle ultrafini con dimensioni comprese fra 1 e 100 nm (American Society for Testing Materials - ASTM), è in costante aumento a livello globale. La particolarità di tali sostanze è rappresentata da un alto rapporto tra la superficie e il volume delle particelle, che determina caratteristiche chimico-fisiche completamente differenti rispetto alle omologhe macrosostanze di riferimento. Tali caratteristiche sono tali da imporre una loro classificazione come nuovi agenti chimici (Royal Society & Royal Academy of Engineering report 2004). Gli impieghi attuali dei nanomateriali risultano in continua evoluzione, spaziando in diversi ambiti, dall’industria farmaceutica e cosmetica, all’industria tessile, elettronica, aerospaziale ed informatica. Diversi sono anche gli impieghi in campo biomedico; tra questi la diagnostica e la farmacoterapia. È quindi prevedibile che in futuro una quota sempre maggiore di lavoratori e consumatori risulteranno esposti a tali sostanze. Allo stato attuale non vi è una completa conoscenza degli effetti tossicologici ed ambientali di queste sostanze, pertanto, al fine di un loro utilizzo in totale sicurezza, risulta necessario capirne meglio l’impatto sulla salute, le vie di penetrazione nel corpo umano e il rischio per i lavoratori conseguente al loro utilizzo o lavorazione. La cute rappresenta la prima barriera nei confronti delle sostanze tossiche che possono entrare in contatto con l’organismo umano. Successivamente agli anni ‘60, quando si riteneva che la cute rappresentasse una barriera totalmente impermeabile, è stato dimostrato come essa presenti differenti gradi di permeabilità nei confronti di alcuni xenobiotici, dipendente dalle caratteristiche delle sostanze in esame, dal sito anatomico di penetrazione, dal grado di integrità della barriera stessa e dall’eventuale presenza di patologie della cute. La mucosa del cavo orale funge da primo filtro nei confronti delle sostanze che entrano in contatto con il tratto digestivo e può venir coinvolta in contaminazioni di superficie determinate da esposizioni occupazionali e/o ambientali. È noto che, rispetto alla cute, presenti una permeabilità all’acqua quattro volte maggiore, e, per tale motivo, è stata studiata come via di somministrazione di farmaci, ma, ad oggi, pochi sono gli studi che ne hanno valutato le caratteristiche di permeazione nei confronti delle nanoparticelle (NPs). Una terza importante barriera biologica è quella che ricopre il sistema nervoso centrale, essa è rappresentata da tre foglietti di tessuto connettivo, che assieme costituiscono le meningi. Questi tre foglietti rivestono completamente l’encefalo permettendone un isolamento, tradizionalmente ritenuto completo, nei confronti degli xenobiotici. L’unica via di assorbimento diretto, in questo contesto, è rappresentata dalla via intranasale. Essa permette un passaggio diretto di sostanze dall’epitelio olfattivo all’encefalo, eludendo la selettiva barriera emato-encefalica. Negli ultimi anni la letteratura scientifica si è arricchita di studi che hanno indagato le caratteristiche di assorbimento di farmaci attraverso questa via, ma pochissimi sono gli studi che hanno indagato la possibile penetrazione di nanoparticelle attraverso questa via, e nessuno, in particolar modo, ha indagato le caratteristiche di permeazione delle meningi. L’attività di ricerca svolta nell’ambito del presente dottorato ha avuto per finalità l’indagine delle caratteristiche di permeabilità e di assorbimento della cute, della mucosa del cavo orale e delle meningi nei confronti di alcune nanoparticelle, scelte fra quelle più rappresentative in relazione alla diffusione d’utilizzo a livello globale. I risultati degli esperimenti condotti hanno dimostrato, in vitro, che l’esposizione cutanea a Pt, Rh, Co3O4 e Ni NPs determinano permeazione in tracce dei medesimi metalli attraverso la cute, mentre per le TiO2 NPs tale permeazione non è stata dimostrata. È stato riscontrato, inoltre, che la mucosa del cavo orale e le meningi sono permeabili nei confronti dell’Ag in forma nanoparticellare.

Ruolo di Clusterina nella progressione del tumore prostatico

Clusterina (CLU) è una proteina ubiquitaria, presente nella maggior parte dei fluidi corporei e implicata in svariati processi fisiologici. Dalla sua scoperta fino ad oggi, CLU è risultata essere una proteina enigmatica, la cui funzione non è ancora stata compresa appieno. Il gene codifica per 3 varianti trascrizionali identificate nel database NCBI con i codici: NM_001831 (CLU 1 in questo lavoro di tesi), NR_038335 (CLU 2 in questo lavoro di tesi) e NR_045494 (CLU 3 in questo lavoro di tesi). Tutte le varianti sono trascritte come pre-mRNA contenenti 9 esoni e 8 introni e si differenziano per l’esone 1, la cui sequenza è unica e caratteristica di ogni variante. Sebbene in NCBI sia annotato che le varianti CLU 2 e CLU 3 non sono codificanti, tramite analisi bioinformatica è stato predetto che da tutti e tre i trascritti possono generarsi proteine di differente lunghezza e localizzazione cellulare. Tra tutte le forme proteiche ipotizzate, l’unica a essere stata isolata e sequenziata è quella tradotta dall’AUG presente sull’esone 2 che dà origine a una proteina di 449 aminoacidi. Il processo di maturazione prevede la formazione di un precursore citoplasmatico (psCLU) che subisce modificazioni post-traduzionali tra cui formazione di ponti disolfuro, glicosilazioni, taglio in due catene denominate β e α prima di essere secreta come eterodimero βα (sCLU) nell’ambiente extracellulare, dove esercita la sua funzione di chaperone ATP-indipendente. Oltre alla forma extracellulare, è possibile osservare una forma intracellulare con localizzazione citosolica la cui funzione non è stata ancora completamente chiarita. Questo lavoro di tesi si è prefissato lo scopo di incrementare le conoscenze in merito ai trascritti CLU 1 e CLU 2 e alla loro regolazione, oltre ad approfondire il ruolo della forma citosolica della proteina in relazione al signaling di NF-kB che svolge un ruolo importante nel processo di sviluppo e metastatizzazione del tumore. Nella prima parte, uno screening di differenti linee cellulari, quali cellule epiteliali di prostata e di mammella, sia normali sia tumorali, fibroblasti di origine polmonare e linfociti di tumore non-Hodgkin, ha permesso di caratterizzare i trascritti CLU 1 e CLU 2. Dall’analisi è emerso che la sequenza di CLU 1 è più corta al 5’ rispetto a quella depositata in NCBI con l’identificativo NM_001831 e il primo AUG disponibile per l’inizio della traduzione è localizzato sull’esone 2. È stato dimostrato che CLU 2, al contrario di quanto riportato in NCBI, è tradotto in proteina a partire dall’AUG presente sull’esone 2, allo stesso modo in cui viene tradotto CLU 1. Inoltre, è stato osservato che i livelli d’espressione dei trascritti variano notevolmente tra le diverse linee cellulari e nelle cellule epiteliali CLU 2 è espressa sempre a bassi livelli. In queste cellule, l’espressione di CLU 2 è silenziata per via epigenetica e la somministrazione di farmaci capaci di rendere la cromatina più accessibile, quali tricostatina A e 5-aza-2’-deossicitidina, è in grado di incrementarne l’espressione. Nella seconda parte, un’analisi bioinformatica seguita da saggi di attività in vitro in cellule epiteliali prostatiche trattate con farmaci epigenetici, hanno permesso di identificare, per la prima volta in uomo, una seconda regione regolatrice denominata P2, capace di controllare l’espressione di CLU 2. Rispetto a P1, il classico promotore di CLU già ampiamente studiato da altri gruppi di ricerca, P2 è un promotore debole, privo di TATA box, che nelle cellule epiteliali prostatiche è silente in condizioni basali e la cui attività incrementa in seguito alla somministrazione di farmaci epigenetici capaci di alterare le modificazioni post-traduzionali delle code istoniche nell’intorno di P2. Ne consegue un rilassamento della cromatina e un successivo aumento di trascrizione di CLU 2. La presenza di un’isola CpG differentemente metilata nell’intorno di P1 spiegherebbe, almeno in parte, i differenti livelli di espressione di CLU che si osservano tra le diverse linee cellulari. Nella terza parte, l’analisi del pathway di NF-kB in un modello sperimentale di tumore prostatico in cui CLU è stata silenziata o sovraespressa, ha permesso di capire come la forma citosolica di CLU abbia un ruolo inibitorio nei confronti dell’attività del fattore trascrizionale NF-kB. CLU inibisce la fosforilazione e l’attivazione di p65, il membro più rappresentativo della famiglia NF-kB, con conseguente riduzione della trascrizione di alcuni geni da esso regolati e coinvolti nel rimodellamento della matrice extracellulare, quali l’urochinasi attivatrice del plasminogeno, la catepsina B e la metallo proteinasi 9. È stato dimostrato che tale inibizione non è dovuta a un’interazione fisica diretta tra CLU e p65, per cui si suppone che CLU interagisca con uno dei componenti più a monte della via di segnalazione responsabile della fosforilazione ed attivazione di p65.

Biomarcatori per il monitoraggio biologico di soggetti esposti ad agenti cancerogeni per il polmone

Riassunto I biomarcatori o “marcatori biologici” svolgono un ruolo fondamentale nel monitoraggio biologico. In questo lavoro ci siamo soffermati sullo studio di biomarcatori di effetto e di esposizione a xenobiotici ambientali. Nel primo caso abbiamo valutato i micro RNA (miRNA) da utilizzare per la diagnosi precoce del tumore al polmone in matrici di facile accesso, quale il CAE e il plasma, utilizzando il miRNA-21, oncogeno, e il miRNA-486, oncosoppressore. I risultati evidenziano una loro capacità di distinguere correttamente i soggetti con tumore polmonare dai soggetti sani, ipotizzando un loro utilizzo a scopo diagnostico. Nella seconda parte del lavoro di tesi sono stati studiati i biomarcatori di esposizione a benzene per valutare gli effetti dell’esposizione a concentrazioni ambientali su bambini residenti in città e a diverso livello di urbanizzazione. Lo studio ha evidenziato una correlazione dose-effetto fra le concentrazioni di benzene e dei suoi metaboliti urinari e un danno ossidativo a livello degli acidi nucleici. Tuttavia, le concentrazioni di benzene urinario non sono influenzate dal grado di industrializzazione, a differenza dell’S-PMA e degli indicatori di stress ossidativo (8-oxodGuo e 8-oxoGuo) che sembrano risentire sia della residenza che del momento del campionamento. Infine abbiamo ricercato possibili biomarcatori di esposizione a vinilcicloesene (VCH), sottoprodotto industriale nella polimerizzazione del 1,3-butadiene, poiché non sono ancora stati proposti BEI di riferimento nonostante i bassi valori di TLV-TWA (0.1 ppm) proposti dall’ACGIH. Nella prima fase del lavoro abbiamo studiato i meccanismi di tossicità del VCH tramite modelli in vitro, testando varie linee cellulari. I risultati evidenziano come la dose reale di VCH sia di molto inferiore a quella nominale per effetto dell’evaporazione. Inoltre, nelle linee cellulari più sensibili si sono evidenziati effetti citostatici, con alterazioni del ciclo cellulare, a differenza dell’esposizione agli epossidi del VCH, il VCD e l’1,2-VCHME, che determinano lisi cellulare con IC50 di 3 ordini di grandezza inferiori a quelli del VCH. La quantificazione dei metaboliti di I fase e di II fase del VCH nelle linee cellulari epatiche ha evidenziato concentrazioni di circa 1000 volte inferiori a quelle del VCH confermando come la sua tossicità sia principalmente dovuta alla produzione degli intermedi epossidici. La trasformazione nei metaboliti di II fase conferma inoltre l’effetto detossificante del metabolismo. La trasferibilità dei risultati ottenuti in vitro su sistemi in vivo fornirà le basi per poter identificare possibili metaboliti da proporre per il monitoraggio biologico di lavoratori esposti a VCH. PAROLE CHIAVE: biomarcatori di effetto e di esposizione, tumore al polmone, miRNA, benzene, vinilcicloesene.

Nanotossicologia dei quantum dot di CdS in linee cellulari umane

Le nanotecnologie sono un settore emergente in rapida crescita, come dimostra l'esplosione del mercato dei prodotti ad esso collegati. I quantum dot di cadmio solfuro (CdS QD) sono ampiamente utilizzati per la produzione di materiali semiconduttori e dispositivi optoelettronici; tuttavia, non sono ancora completamente chiari gli effetti di questi nanomateriali sulla salute umana. Questo lavoro di dottorato si pone l'obbiettivo di definire il potenziale citotossico e genotossico dei CdS QD in linee cellulari umane e definirne il meccanismo implicato. A questo scopo, essendo il fegato uno dei principali organi di accumulo del cadmio e dei nanomateriali a base di cadmio, è stata utilizzata la linea cellulare HepG2 derivante da un epatocarcinoma umano. È stato evidenziato, in seguito all'assorbimento, da parte delle cellule, dei CdS QD, un effetto citotossico, con conseguente modulazione dell'espressione genica di una serie di geni coinvolti sia nei processi di rescue (autofagia, risposta allo stress) sia in quelli di morte cellulare programmata. È stato, inoltre, dimostrata l'assenza di un rilevante effetto genotossico dipendente da questi nanomateriali. Infine, è stato osservato che cellule esposte ai CdS QD presentano mitocondri con un potenziale di membrana alterato, con conseguente alterazione della funzionalità di tale organello, pur conservando l'integrità del DNA mitocondriale.