Investigação da atividade toxicológica de análogos de estatinas em modelos experimentais in vitro

As estatinas são fármacos inibidores competitivos da enzima hidroxi-3-metil-glutaril Coenzima A (HMGCoA) redutase, amplamente utilizados para o controle da hipercolesterolemia total e, em especial, para a redução dos níveis séricos de LDLc (Low Density Lipoprotein cholesterol). Além do efeito primário, esses fármacos apresentam vários efeitos secundários, chamados de efeitos pleiotrópicos, envolvendo atividade anti-inflamatória, antitumoral e antiparasitária. Para o desenvolvimento de inovações na área de química medicinal é imprescindível avaliar o risco de efeitos adversos para saúde ou, em outras palavras, a segurança terapêutica do novo produto nas condições propostas de uso. Nesse sentido, o objetivo desse trabalho foi investigar a genotoxicidade de quatro análogos inibidores da biossíntese de lipídios, da classe das estatinas, em modelos experimentais in vitro, testados previamente contra o clone W2 de Plasmodium falciparum a fim de se obter o IC50 dessas moléculas frente ao patógeno. Foram desenvolvidas quatro novas moléculas (PCSR02.001, PCSR09.001, PCSR08.002 e PCSR10.002). Para a avaliação da toxicidade, foram realizados o teste de mutagenicidade bacteriana (teste de Ames), o ensaio de viabilidade celular utilizando o reagente WST-1 e o ensaio de indução de micronúcleos, ambos utilizando uma linhagem ovariana (CHO-K1) e uma linhagem hepática (HepG2). Levando em conta o fato de nenhuma das amostras ter induzido efeitos mutagênicos nas linhagens de S. enterica sorovar Typhimurium, e PCSR10.002 ter apresentado citotoxicidade sugere-se então que este composto seja o mais tóxico. Comparativamente, PCSR10.002 foi mais genotóxico e citotóxico para a linhagem CHO-K1 do que para a linhagem HepG2. PCSR02.001 apresentou elevado potencial genotóxico para células ovarianas, mas não foi capaz de induzir a formação de micronúcleos em células hepáticas, apresentando, portanto um perfil similar ao observado em PCSR10.002. Assim como a atorvastatina, PCSR09.001 apresentou elevado potencial pró-apoptótico para a linhagem de hepatócitos. Já PCSR08.002, apresentou aumento na apoptose de CHO-K1. A indução de apoptose não é necessariamente um evento negativo, já que é pouco lesiva e responsável pela eliminação de células danificadas. Porém, as respostas de apoptose induzidas por esse composto foram muito inferiores àquelas induzidas pela atorvastatina (cerca de 4 vezes menor que a atorvastatina). PCSR08.002 foi aquele se mostrou menos tóxico e essa amostra foi a que teve menor risco relativo, em uma análise global das respostas de citotoxicidade e não demonstrou ter potencial genotóxico para as linhagens utilizadas nesse estudo. Conclui-se, portanto, que a análise da atividade toxicológica utilizando modelos experimentais in vitro dessas estatinas constitui um importante passo para o estabelecimento de novos candidatos à fármacos com maior segurança.

Mapeamento de proteínas alvo para novos antifúngicos na fração microssomal e citosólica do patógeno humano Aspergillus fumigatus

A incidência de infecções fúngicas invasivas vem aumentando nos últimos anos. Estas infecções, em geral, apresentam altas taxas de mortalidade. A profilaxia com antifúngicos ainda é a estratégia mais comum na contenção da mortalidade e prevenção contra infecções fúngicas invasivas, porém, apresenta baixa eficiência, e relatos de resistência às drogas. Além disso, a terapia antifúngica é limitada a um pequeno grupo de drogas, como os polienos, azóis e equinocandinas. Desta forma, a busca de novos alvos de drogas é fundamental para o desenvolvimento de novos antifúngicos. Estudos in silico indicaram quatro genes como potenciais alvo de drogas em fungos patogênicos. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi verificar a expressão das proteínas codificadas por dois destes possíveis genes alvo, a proteína erg6, na fração microssomal, e trr1, na fração citosólica, em hifas de A. fumigatus. Visando alcançar este objetivo, foram primeiramente padronizadas todas as etapas de fracionamento celular visando isolar estas duas subfrações celulares de A. fumigatus. Posteriormente, foi otimizado o protocolo de extração e reidratação de proteínas microssomais bem como reidratação de proteínas citosólicas. Estes extratos foram submetidos a diferentes protocolos de fracionamento proteico em um sistema de eletroforese OFFGEL (OGE). Os resultados de Western immunoblot mostraram que estas duas proteínas, erg6 e trr1, são de fato expressas na fase filamentosa de A. fumigatus. O extrato proteico da fração microssomal submetido ao OGE em doze subfrações apresentou três subunidades da proteína erg6, reconhecidas pelo anticorpo monoclonal, com massas moleculares e pI distintos: uma subunidade de aproximadamente 79 kDa com pI entre 5,91 e 6,49, e outras duas subunidades de aproximadamente 35 kDa e 32 kDa, ambas com pI entre 6,49 e 7,08. A enzima erg6 foi descrita como um homotetrâmero em outros fungos. Porém, nossos resultados sugerem que, em A. fumigatus, a erg6 possui uma estrutura heterotetramérica. Quanto à proteína trr1, tanto no extrato total quanto nas frações resultantes do fracionamento em OGE, uma banda única de aproximadamente 40 kDa, com pI na faixa de 4,79 e 5,33, foi reconhecida pelo anticorpo policlonal. Desta forma, esta proteína parece ter uma estrutura homodimérica, assim como descrito em outros micro-organismos.

Avaliação do custo-efetividade da incorporação do Espectômetro de Massa em Tandem no Programa Nacional de Triagem Neonatal no Brasil para diagnóstico da Fenilcetonúria e MCAD.

A Espectrometria de Massa em Tandem (MS/MS) é mundialmente considerada padrão ouro para a Triagem Neonatal (TN) de Erros Inatos do Metabolismo (IEM). Além de apresentar melhor sensibilidade e especificidade possibilita rastrear uma vasta gama de IEM usando um único teste. Atualmente o Programa Nacional de Triagem Neonatal (PNTN) rastreia cinco doenças (Fenilcetonúria, Hipotiroidismo Congênito, Fibrose Cística, Hemoglobinopatias e Deficiência da Biotinidase). Uma das metas do PNTN é o aprimoramento e a incorporação de novas doenças e/ou tecnologias. Com a recente recomendação da CONITEC (Comissão Nacional de Incorporação de Tecnologias) para aquisição do MS/MS para diagnóstico de doenças raras, vislumbra-se o incremento desta tecnologia para ampliação de doenças triadas, melhora da qualidade do teste diagnóstico, corroborando para melhorar qualidade de vida das crianças acometidas pelos EIM. Este trabalho teve como objetivo realizar uma análise de custo efetividade, para incorporação da tecnologia de tandem MS/MS na triagem neonatal, sob a perspectiva do SUS. Desta maneira buscou-se comparar diferentes cenários da TN com a tecnologia atualmente utilizada (Fluorimetria) somente para Fenilcetonúria (PKU), e com MS/MS para rastreio da PKU e da Deficiência de Cadeia Média Acyl-Coenzima Desidrogenase (MCAD). Para tanto construiu-se um modelo matemático de decisão baseados em cadeias de Markov que simulou a TN da PKU e da MCAD, bem como a história natural da MCAD. Foi acompanhada uma coorte hipotética de cem mil recém-nascidos. O horizonte temporal adotado foi a expectativa de vida da população brasileira de 78 anos de acordo com IBGE. Utilizou-se uma taxa de desconto de 5% para os custos e consequências clínicas para ambos os cenários propostos. Quando incorporado o MS/MS para triagem da PKU os ganhos em saúde continuaram os mesmos, pois o desempenho do MS/MS e da Fluorimetria foram praticamente iguais (efetividade), porém o custo incremental foi quatro vezes maior para a mesma efetividade, o que torna o MS/MS somente para PKU não custo efetiva (dominada). No entanto, quando analisado o cenário do MS/MS para triagem da PKU e da MCAD o custo incremental do MS/MS no PNTN foi menor por causa da economia feita uma vez que é possível realizar ambos os testes no mesmo o teste do pezinho atual.

Carboxilesterase na adaptação do metabolismo de lipídios do pacu à hipoxia

Os peixes são vertebrados que vivem em vários habitats. Adaptações de sua fisiologia e de sua bioquímica são estudadas para entender como conseguem sobreviver aos desafios presentes em cada ambiente. A diminuição da concentração de oxigênio dissolvido na água é um fenômeno natural cíclico em águas do Pantanal e da Amazônia. A crescente poluição antrópica dos rios da Amazônia e do Pantanal pode, somada à hipoxia, oferecer ameaça à permanência de muitas espécies de peixes. Ao estudarmos a carboxilesterase (CarbE), enzima importante para a biotransformação de xenobióticos, observamos que sua atividade diminuía em plasma de pacu, um peixe típico do Pantanal, mantido em hipoxia durante 42 horas. As carboxilesterases participam de inúmeras reações químicas no organismo, incluindo uma transesterificação capaz de produzir ésteres etílicos tóxicos de ácido graxo (FAEE, fatty acid ethyl esters) a partir de etanol e ésteres de ácidos graxos. Já que a diminuição da atividade de CarbE poderia ser uma vantagem, pois que o etanol (um produto da glicólise em peixes sob hipoxia) seria menos esterificado, resolvemos saber mais sobre a bioquímica da CarbE do plasma e do fígado de pacus. Os pacus foram submetidos à hipoxia por diminuição da concentração até 0,5 mg O2/L por meio de borbulhamento de nitrogênio na água. Os animais ficaram nessas condições por 42 horas, quando então coletamos sangue e retiramos seus fígados. A atividade de CarbE ensaiada foi 50% menor no soro e 25% menor nos microssomos de fígado se comparada com a de peixes sob 6 mg O2/L. A CarbE isolada do soro dos pacus em normoxia possui massa molecular relativa de 56.000. A eletroforese em gel desnaturante com a fração purificada rendeu três bandas, mas o gel nativo apresentou só duas bandas com atividades sobre α-naftil acetato. Inferimos que mais do que uma isoforma da enzima está no plasma dos pacus. A CarbE isolada do soro não possui atividade de lipase sobre o Tween 20, mas os microssomos dos fígados dos animais em normoxia e hipoxia possuem. No entanto, a CarbE possui atividade sobre acil-CoA assim como o microssomo de fígado. A enzima pura apresenta Vmáx três vezes maior e uma KM quatro vezes maior do que a atividade presente nos microssomos. Além disso, os microssomos do fígado dos pacus em normoxia podem hidrolisar acil-CoA com o dobro da velocidade daqueles em hipoxia. A atividade clássica de CarbE do soro foi inibida por 4-HNE a 4 mM. A atividade de acil-CoA dos microssomos de fígado também foi sensível a 4-HNE a 4 mM, enquanto 2 mM de 4-HNE inibiu metade desta atividade do soro.