Relação dos sistemas de reparo de DNA em Escherichia coli K-12 com resistência a antibióticos, características adesivas e formação de biofilme

As espécies reativas de oxigênio (ERO) são geradas durante o metabolismo celular normal e podem produzir vários danos oxidativos no DNA, tais como lesões nas bases nitrogenadas ou sítios apurínico/apirimidínico (AP). Essas lesões podem acarretar acúmulo de sítios de mutações, caso esses danos não sejam reparados. Entretanto, as bactérias possuem vários mecanismos de defesa contra as ERO que desempenham um importante papel na manutenção da fisiologia. O objetivo deste trabalho foi o de avaliar se sistemas enzimáticos, como o reparo por excisão de bases (BER), sistema SOS e SoxRS, interferem em respostas como a sensibilidade aos antibióticos, aderência das células bacterianas a superfícies bióticas ou abióticas e formação de biofilme. Os mutantes utilizados no presente estudo são todos derivados de Escherichia coli K-12 e os resultados obtidos mostraram que, dos mutantes BER testados, o único que apresentou diferença no perfil de sensibilidade aos antimicrobiamos em relação à cepa selvagem (AB1157) foi o mutante xthA- (BW9091), deficiente em exonuclease III. No teste de aderência qualitativo realizado com linhagem de células HEp-2 (originária de carcinoma de laringe humana) foi observado que onze cepas da nossa coleção, apresentaram um padrão denominando like-AA, contrastando com o que era esperado para as cepas de E. coli utilizadas como controle negativo, que apresentam aderência discreta sem padrão típico. A aderência manose-sensível via fímbria do tipo I avaliada nesse estudo mostrou que essa fimbria, possui um papel relevante na intensidade da aderência e filamentação nessas cepas estudas. A filamentação é uma resposta SOS importante para que o genoma seja reparado antes de ser partilhado pelas células filhas. Além disso, com relação à formação de biofilme, oito cepas apresentaram um biofilme forte sendo que essa resposta não foi acompanhada pelo aumento da intensidade de filamentação. Nossos resultados em conjunto sugerem o envolvimento de estresse oxidativo na definição de parâmetros como sensibilidade a antimicrobianos, padrão e intensidade de aderência, filamentação e formação de biofilme nas amostras de E. coli K-12 avaliadas neste trabalho. Sugerimos que a aderência gera estresse oxidativo causando danos no DNA, o que leva a indução do sistema SOS resultando na resposta de filamentação observada.

Reprodução de peixes de riachos: uma abordagem comparativa entre as estratégias r e K

No presente trabalho, objetivou-se caracterizar a estratégia reprodutiva, enfatizando o investimento energético, de duas espécies de peixe do rio Ubatiba, Maricá, Rio de Janeiro: Parotocinclus maculicauda (K-estrategista) e Astyanax hastatus (r-estrategista). Foram realizadas coletas bimestrais de Junho de 2010 a Abril de 2011 totalizando 236 exemplares amostrados de A. hastatus e 234 de P. maculicauda. Para cada exemplar foram registrados os dados de comprimento padrão (Cp, cm), peso total (Pt, g), peso gonadal (Pg, g), sexo e estádio de maturação. Através da estrutura de tamanho, observamos que as fêmeas atingem maior comprimento, em relação aos machos, para as duas espécies. A relação peso/ comprimento evidenciou para ambas as espécies, crescimento alométrico negativo (inferior a 3), demonstrando crescimento mais longelíneo. Para a proporção sexual, o teste χ2 foi aplicado e indicou que, para as duas espécies, há significativamente mais fêmeas. A distribuição sexual no ano mostrou que as fêmeas se mantêm em maioria durante todo o ano para P. maculicauda. Para A. hastatus este padrão também se mantém, porém com exceção do bimestre Novembro/Dezembro, quando o número de machos torna-se um pouco maior. O tamanho de primeira maturação mostrou-se o mesmo para ambas as espécies (2,5 a 3,0 cm). A variação temporal da freqüência de indivíduos reprodutivos e não reprodutivos juntamente com a distribuição temporal dos valores individuais de IGS mostrou que P. maculicauda se reproduz com maior intensidade nas estações chuvosas (Setembro a Abril), reduzindo sua atividade reprodutiva de maneira significativa nas estações secas (Maio a Agosto). Já A. hastatus demonstrou regular atividade reprodutiva durante todo o ano com pequeno pico no bimestre Novembro/ Dezembro. Desova do tipo total foi registrada para Astyanax, enquanto que para Parotocinclus registrou-se desova parcelada em três lotes. Em ambas as espécies foi observada relação inversa entre volume e a quantidade de ovócitos produzidos, com A. hastatus produzindo muitos ovócitos (fecundidade: 463 + 213 ovócitos/grama de peixe) de reduzido volume (diâmetro = 800 μm e volume = 0,26 mm3) e P. maculicauda produzindo número bem inferior (fecundidade: 47 + 13 ovócitos/grama de peixe), porém com volume superior (diâmetro = 1.600 μm e volume = 2,14 mm3). Com isso o valor energético relativo também se mostrou superior, com A. hastaus produzindo ovócitos vitelogênicos com 0,4+ 0,08 cal/unidade e P. maculicauda produzindo os mesmos ovócitos com 1,8+ 1,1 cal/unidade. Para a produção energética total investida na produção de gametas, foi considerado o tipo de desova de cada espécie, com Astyanax investindo 50,5 + 24 calorias/grama/grama de peixe e Parotocinclus investindo 88,4 + 72,46 cal/grama/grama de peixe, porém sem diferenças significativas (Mann-Whitney; U =235,0, p=0,08), indicando, portanto que independente da estratégia adotada (r ou K), o gasto energético na produção de ovócitos é a mesma.

Avaliação da concentração de Cl, K e Ca na urina, hemolinfa e túbulos de Malpighi de Rhodnius prolixus usando a técnica de fluorescência de raios X por reflexão total por radiação síncrotron (SR-TXRF)

Neste trabalho utilizou-se a técnica fluorescência de raios X usando radiação síncrotron (SR-TXRF) para estudar, quantitativamente, o transporte de cloro, potássio e cálcio na hemolinfa, urina e túbulos de Malpighi (TM) em ninfas de quinto estágio do Rhodnius prolixus (R. prolixus), considerando a excreção destes elementos em diferentes dias após o repasto sanguíneo. R. prolixus é um dos principais vetores do Trypanosoma cruzi, agente causador da doença de Chagas. R. prolixus fornece um sistema modelo particularmente útil porque seus TMs tanto secretam quanto reabsorvem íons a taxas elevadas. Os TMs filtram a hemolinfa e secretam um líquido que é muitas vezes comparado com a urina primária em vertebrados. Os resultados obtidos mostram que a concentração de potássio na urina é substancialmente maior do que na hemolinfa. A concentração de cloro na hemolinfa é menor do que na urina, mas a diferença não é tão marcada como no caso do potássio. No caso do Rhodnius é razoável interpretar a elevada concentração de potássio na urina como adaptativo para o problema de excreção imediato do inseto. A concentração de cálcio nos TMs é substancialmente maior em comparação com os valores encontrados na hemolinfa e urina. Este resultado mostra que o cálcio é retido no corpo do R. prolixus e pouco eliminado. Os resultados obtidos estão coerentes com a literatura. Avaliou-se também o efeito no transporte de Cl, K e Ca após um repasto de sangue de coelho contaminado com HgCl2 de modo a avaliar o efeito da presença deste metal tóxico no balanço iônico nos fluidos de excreção urina e hemolinfa e também pelo principal órgão de transporte, os túbulos de Malpighi. As excreções de Cl e K pela urina são afetadas pela ingestão. Este resultado é esperado levando-se em consideração a ingestão de excesso de Cl através do HgCl2. O transporte de Cl, K e Ca na hemolinfa do Rhodnius prolixus não é afetada pela ingestão de HgCl2. Nos túbulos de Malpighi, as altas concentrações de Ca obtidas foram comparáveis àquelas encontradas nos insetos controle. Pode-se concluir que SR-TXRF é um método muito promissor para análises diretas, rápidas e confiáveis para a quantificação simultânea de elementos envolvidos na regulação do transporte e em todo o sistema excretor de insetos. Além disso, o estudo do transporte e a excreção de elementos no inseto Rhodnius prolixus abrem oportunidade para a maior compreensão de efeitos da poluição em espécies de invertebrados.

Avaliação de ligações K e T entre perfis estruturais tubulares circulares.

O difundido uso de perfis estruturais tubulares, principalmente devido às vantagens associadas ao comportamento estrutural e estético, levou a uma intensa utilização nos países da Europa, Sudeste Asiático, América do Norte e na Austrália. Países como Canadá, Inglaterra, Alemanha e Holanda fazem uso intensivo dessas estruturas e contam com uma produção corrente, industrializada e contínua com alto grau de desenvolvimento tecnológico. O aumento da oferta deste tipo de perfis, aliado a recentes pesquisas nesta área, leva o Brasil a se inserir neste cenário mundial. Entretanto, as normas brasileiras que regem o dimensionamento destes perfis ainda não se encontram atualizadas, principalmente no que tange ao dimensionamento de ligações de perfis tubulares. Considerando esta perspectiva, este trabalho apresenta uma análise de ligações tipo K e T com perfis tubulares circulares (CHS). Propõe-se estabelecer um quadro comparativo entre as formulações analíticas de dimensionamento proposta pelo Eurocode 3 Parte 1.8, 2 edição do guia de projeto de ligações tubulares do CIDECT, projeto de norma brasileira PN 02.125.03-004 e critérios de deformação limite. Para cada um dos tipos de ligações analisadas, desenvolveu-se um modelo em elementos finitos no programa Ansys, calibrado e validado com resultados experimentais e numéricos existentes na literatura. As não-linearidades física e geométrica foram incorporadas aos modelos, a fim de se mobilizar totalmente a capacidade resistente da ligação. A não-linearidade do material foi considerada através do critério de plastificação de Von Mises através de uma lei constitutiva tensão versus deformação bilinear. A não-linearidade geométrica foi introduzida no modelo através da Formulação de Lagrange Atualizado considerando-se a previsão de grandes deformações de forma a permitir a redistribuição de carregamento na ligação após o escoamento inicial. Esta dissertação propõe ainda, a modelagem de uma treliça planar constituída de perfis tubulares, objetivando estabelecer uma comparação entre um nó isolado e um nó da treliça planar.

Efeitos genotóxicos e indução do SOS em mutantes derivados de Escherichia coli K-12 durante o processo de interação com superfícies bióticas e abióticas

A célula epitelial é o primeiro contato entre os micro-organismos e o hospedeiro. Essa interação pode levar a produção de diversas citocinas, quimiocinas, moléculas inflamatórias e também estimular a geração de espécies reativas de oxigênio (ERO). Neste trabalho avaliamos se a interação com as células HEp-2 poderia ser genotóxica para os mutantes derivados de Escherichia coli K-12 deficientes em algumas enzimas que fazem parte do sistema de reparo por excisão de base (BER). Além disto, avaliamos a expressão do sistema SOS, que é induzido pela presença de danos no genoma bacteriano. Os resultados obtidos mostraram a presença de filamentos, na interação com células HEp-2, principalmente, no mutante xthA (BW9091) e no triplo mutante xthA nfo nth (BW535). Quando a interação foi quantificada na ausência da D-manose, observamos um aumento das bactérias aderidas. Além disto, a quantidade e o tamanho dos filamentos também aumentaram, mostrando que as adesinas manose-sensíveis estavam envolvidas na filamentação bacteriana. Para comprovar se o aumento da filamentação observada neste ensaio foram uma consequência da indução do sistema SOS, desencadeada pela interação com as células HEp-2, quantificamos a expressão do SOS, na presença e na ausência da D-manose. De fato, observamos que a indução do SOS na ausência da D-manose foi maior, quando comparada, com o ensaio realizado na presença de D-manose. Além disto, observamos que a ausência de xthA foi importante para o aumento da filamentação observada na ausência de D-manose. Diante destes resultados, verificamos se a resposta de filamentação ocorreria quando as bactérias interagiam com uma superfície abiótica como o vidro. Observamos também inúmeros filamentos nos mutantes BER, BW9091 e BW535, quando comparados a cepa selvagem AB1157. Essa filamentação foi associada à indução do SOS, em resposta a interação das bactérias com o vidro. Em parte a filamentação e a indução do SOS observadas na interação ao vidro, foram associadas à produção de ERO. Quantificamos também o número de bactérias aderidas e observamos que as nossas cepas formavam biofilmes moderados. Contudo, a formação de biofilme dependia da capacidade da bactéria induzir o sistema SOS, tanto em aerobiose como em anaerobiose. A tensão do oxigênio foi importante para interação dos mutantes BER, uma vez que os mutantes BW9091 e BW535 apresentaram uma quantidade de bactérias aderidas menor em anaerobiose. Contudo, a diminuição observada não estava vinculada a morte dos mutantes BER. Também realizamos microscopia de varredura na cepa selvagem e nos mutantes, BW9091 e BW535 e confirmamos que as três cepas formavam biofilmes tanto em aerobiose como em anaerobiose. Observamos uma estrutura sugestiva de matriz extracelular envolvendo os biofilmes da cepa selvagem AB1157 e do mutante BW9091. No entanto, a formação desta estrutura por ambas as cepas dependia da tensão de oxigênio, pois nos biofilmes formados em anaerobiose essa estrutura estava ausente. Em conclusão, mostramos que na interação das bactérias com a superfície biótica e abiótica, ocorreu lesão no genoma, com indução do SOS e a resposta de filamentação associada.