Validação dos processos envolvidos na obtenção do polissacarídeo capsular de Haemophilus influenzae tipo b conjugado com toxóide tetânico utilizado para produção de vacina

Haemophilus influenzae tipo b (Hib) é a principal causa de pneumonia bacteriana e meningite em crianças com menos de 5 anos de idade. A doença pode ser prevenida através da vacinação com uma vacina conjugada polissacarídeo-proteína, uma vez que a vacina de polissacarídeo não é eficaz. Desde 1999, o Ministério da Saúde incluiu a vacina conjugada Hib na rotina do calendário de imunização para crianças rotineiramente. Sendo este um processo de grande importância para as pessoas e demanda de produção significativa para o governo brasileiro, é necessário que os processos estejam de acordo com as normas nacionais e internacionais de regulamentação e devem ser validados. Uma operação validada assegura a produção de lotes uniformes que atendem as especificações exigidas, consequentemente, garantindo ao fabricante a capacidade de proporcionar um produto de qualidade. O trabalho propõe o desenvolvimento de uma metodologia que evidencie e garanta o processo de produção de um conjugado de polissacarídeo-proteína pelo método de conjugação química e que será produzido de forma consistente e de acordo com as suas especificações pré-definidas. Os atributos de qualidade garantem o não desabastecimento da vacina Haemophilus influenzae tipo b por desvios de processo, o que contribui com aumento do valor agregado ao produto em questão. Portanto, a metodologia de validação foi aplicada ao estudo de validação. O estudo baseou-se em três etapas. A primeira foi baseada em análise de parâmetros do processo de conjugação química para mapear e estabelecer intervalos críticos de controle quanto a estes parâmetros, a segunda fase foi realizada com a produção de três lotes consecutivos, em escala industrial, com monitorização regular dos parâmetros críticos mapeados anteriormente. A fase final consistiu em amostras recolhidas, em tempo pré-determinado, durante o processo de produção e de controle do produto final em tamanho 50% a mais que na rotina de produção. Estas amostras foram analisadas utilizando os métodos de análise que foram anteriormente validados, a fim de garantir a reprodutibilidade dos resultados. A robustez do processo foi assegurada uma vez que todos os parâmetros do processo avaliados apresentaram resultados dentro do padrão de conformidade com os resultados de controle determinados durante o processo, e no produto final para a população de amostragem dentro de especificações definidas pelas metodologias analíticas validadas garantindo os resultados. O trabalho proposto assegura status de processo validado para o conjugado polissacarídeo-proteína com excepcionais rendimentos obtidos, combinado com características químicas bem definidas

Efeito do Sistema de Secreção do Tipo VI de Pseudomonas aeruginosa em modelo murino de pneumonia aguda

O Sistema de Secreção do Tipo VI (SST6), o mais recente maquinário de secreção descrito em bactérias Gram-negativas, é amplamente distribuído entre as diversas espécies deste grupo de microrganismos. Esse aparato de secreção é capaz de injetar efetores proteicos em células alvo, eucarióticas e procarióticas. Estudos sobre o papel do SST6 na virulência microbiana revelaram que este sistema secretório participa ativamente do estabelecimento de infecções, contribuindo para a sobrevivência das bactérias no interior de fagócitos. O genoma da cepa PAO1 de Pseudomonas aeruginosa apresenta três loci que codificam aparatos de SST6, denominados de H1-SST6, H2-SST6 e H3-SST6, Porém, pouco se sabe sobre a participação do SST6 na patogênese de infecções por P. aeruginosa. Assim, o presente estudo investigou o papel de H1-SST6, H2-SST6 e H3-SST6 durante a infecção pulmonar aguda de camundongos. Para isso, camundongos C57/BL6 foram infectados com diferentes doses de bactérias da cepa selvagem PAO1 ou das cepas mutantes PAO1∆H1, PAO1∆H2, PAO1∆H3 ou PAO1∆H1∆H2∆H3. Após 24 horas, os lavados broncoalveolares (LBAs) de animais controle e infectados foram recuperados para a contagem de leucócitos totais e polimorfonucleares e para a quantificação, por ELISA, da quimiocina para neutrófilos, KC, e das citocinas pró-inflamatórias IL-1β e TNF-α. Em outros experimentos, os pulmões, fígados, baços e rins dos animais foram macerados para a pesquisa da carga bacteriana e da disseminação sistêmica das bactérias. A citotoxicidade do SST6 foi determinada, in vitro, em neutrófilos humanos, pela marcação com iodeto de propídeo (PI) e anexina-V seguida da análise em citometria de fluxo. Os resultados mostraram que a inativação dos três SST6 reduziu significativamente a concentração de neutrófilos nos LBAs quando os animais foram infectados com 10⁷ Unidades Formadoras de Colônias de P. aeruginosa. Nesta dose, foi observado que as medianas do número de bactérias detectadas nos animais infectados com as mutantes no SST6 foram menores do que as detectadas nos animais infectados com a cepa parental PAO1. As mutações no SST6 não afetaram a disseminação sistêmica da bactéria. A pesquisa da secreção de citocinas pró-inflamatórias mostrou que, embora tenha sido observada uma redução nas medianas das concentrações de TNF-α nos LBAs de camundongos infectados com a cepa PAO1∆H1∆H2∆H3, em relação aos LBAs de camundongos infectados com a cepa parental, essa diferença não foi significativa. Como a pesquisa de IL-1β e KC não contribuiu para a elucidação dos mecanismos envolvidos na redução da concentração de neutrófilos nos LBAs dos camundongos infectados pela cepa tripla mutante, foi pesquisado o possível efeito do SST6 na morte de neutrófilos humanos. Os resultados mostraram que não houve diferenças significativas quando as diferentes amostras de células infectadas foram comparedas entre si. Em conclusão, os resultados do presente estudo mostraram que o SST6 pode interferir na resposta de neutrófilos durante a pneumonia aguda, mas estudos adicionais são necessários para determinar o papel deste mecanismo de secreção na patogênese de P. aeruginosa.

Avaliação de ligações tubulares tipo T entre CHS com reforço tipo chapa.

Os perfis tubulares sem costura são utilizados em diversos países, principalmente devido às vantagens associadas à estética a sua elevada resistência à torção, cargas axiais e efeitos combinados. Canadá, Inglaterra, Alemanha e Holanda utilizam de forma veemente estas estruturas e possuem produção contínua e industrializada com alto nível de desenvolvimento tecnológico. O Brasil, porém, se limitava praticamente ao uso destes perfis nas coberturas espaciais. Devido ao aumento da utilização desses tipos de estruturas, fez-se necessário o aprofundamento dos estudos com métodos de análise coerentes para utilização de perfis tubulares, principalmente em relação às ligações, pois são consideradas regiões vulneráveis neste tipo de estrutura. Para atender a necessidade de normatização deste procedimento desenvolveu-se uma norma brasileira específica para o dimensionamento de estruturas em perfis tubulares. Considerando esta perspectiva, este trabalho apresenta uma análise de ligações tipo T com reforço tipo chapa com perfis tubulares circulares (CHS) para o banzo e para o montante efetuada com base na norma europeia, Eurocode 3, no CIDECT, na NBR 16239:2013 e ISO 14346. Desenvolveu-se no programa Ansys um modelo de elementos finitos para cada tipo de ligação analisada, calibrado e validado com resultados experimentais e numéricos existentes na literatura. Verificou-se a influência da compressão atuante no montante no comportamento global das ligações. As não-linearidades físicas e geométricas foram incorporadas aos modelos a fim de se mobilizar totalmente a capacidade resistente desta ligação. A nãolinearidade do material foi considerada através do critério de plastificação de von Mises através da lei constitutiva tensão versus deformação bilinear de forma a exibir um comportamento elasto-plástico com encruamento. A não-linearidade geométrica foi introduzida no modelo através da Formulação de Lagrange Atualizada. A análise dos esforços resistentes obtidos em comparação com os resultados do modelo numérico, apresentaram valores a favor da segurança no cálculo utilizando as equações de dimensionamento. Por fim um estudo para fatores de correção das equações de dimensionamento foi também proposto.

Contribuição à confiabilidade de estacas tipo raiz através de um estudo de provas de carga estáticas com aplicação da teoria bayesiana.

Atualmente, o assunto de segurança em fundações tem despertado a atenção de diversos pesquisadores. Muitos entendem ser ultrapassada a utilização, pura e simples, de fatores de segurança em obras geotécnicas. O tratamento determinístico nos projetos de fundações não corresponde às variações e incertezas geradas em todo o processo de investigação do subsolo e processo executivo da fundação, sendo ainda o projeto de fundações um fim de linha de uma longa fila de disciplinas que a precedem e que geram também incertezas nas informações de esforços de suas estruturas e solicitações nas fundações. Porém, são as fundações as primeiras a serem executadas em qualquer obra civil. Este aspecto tem levado à necessidade crescente de verificar também a probabilidade de ruína da fundação por meio da chamada análise de confiabilidade. Com o objetivo de contribuir com a discussão sobre o emprego da análise de confiabilidade, as orientações da norma e o aprimoramento de modelos de cálculo, esta dissertação apresenta, através da aplicação em um estudo de caso, os diferentes aspectos de segurança abordados em projetos de fundações. Procura-se destacar dois tipos básicos de incertezas: aquelas inerentes à variabilidade espacial das propriedades do solo e as decorrentes do modelo de cálculo. Nesta pesquisa são procedidas inicialmente as extrapolações das curvas das provas de carga, que resultarão nos valores da função de Verossimilhança, para a atualização por Bayes. Numa segunda etapa se procede à estimativa da capacidade de carga a priori por alguns métodos consagrados e amplamente utilizados no Brasil. A atualização da estimativa da capacidade de carga é, a seguir, realizada através da metodologia de Bayes, sendo esta uma aplicação de conceitos da probabilidade condicional. A ideia de se proceder a estas duas alternativas de análise à priori foi norteada por duas motivações distintas: i) contribuir para a prática, pelo procedimento de combinação de informações num caso real bem documentado, conforme proposto por Vrouwenvelder (1992) e ii) motivar discussão de opiniões polêmicas de engenheiros de fundações brasileiros em relação à adoção de um fator de segurança inferior a 2 no caso de provas de carga especificadas na fase de projeto.

O peptídeo natriurético tipo B (BNP) como preditor de mortalidade a longo prazo em pacientes com síndrome coronariana aguda sem supradesnível do segmento ST

Fundamentos: Apesar dos conhecimentos adquiridos sobre marcadores preditores de mortalidade na síndrome coronariana aguda (SCA), a capacidade de avaliação a longo prazo permanece desconhecida. O peptídeo natriurético tipo B (BNP) tem sido extensamente utilizado, porém as evidências existentes se restringem ao seguimento de curto e médio prazos. Objetivos: Determinar se o BNP é um preditor independente de mortalidade por todas as causas a longo prazo em pacientes com síndrome coronariana aguda sem supradesnível do segmento ST (SCASSST). Métodos: No período de 1o de Janeiro de 2002 a 31 de Dezembro de 2003, foram selecionados 224 pacientes consecutivos atendidos na sala de emergência com SCASSST. A dosagem do BNP à admissão foi incorporada no protocolo diagnóstico, tendo o seu valor sido correlacionado com a mortalidade ao final do seguimento. Resultados: Os pacientes foram acompanhados por 9,34 anos (mediana), tinham 71,5 anos (intervalo IQ=60,5;79,0) e com predomínio do gênero masculino (62,9%). A hipertensão arterial esteve presente em 82,1% e o diabetes em 23,7%. A angina instável (AI) foi diagnosticada em 52,2% e o infarto agudo do miocárdio sem supradesnível do segmento ST (IAMSSST) em 47,8%. O BNP mediano foi de 81,9 pg/ml (intervalo IQ 22,2; 225). A mortalidade se correlacionou com os quartis crescentes do BNP: 14,3; 16,1; 48,2; e 73,2% (p<0,0001). A curva ROC determinou o BNP=100 pg/ml como o melhor ponto de corte, tendo apresentado área sobre a curva (AUC) de 0,79 (IC 95%=0,72-0,85) e sendo preditor de mortalidade ao final do seguimento: 17,3% vs. 65,0%, p<0,001, RR=3,76 (IC 95%=2,49-5,63). O BNP teve poder prognóstico tanto nos pacientes com (26,7 vs. 71,2%, p<0,001) como nos sem (12,9 vs. 56,8%, p<0,001) alteração da função ventricular, e também conforme o diagnóstico de AI (18,7 vs. 48,6%, p=0,001) e IAMSSST (14,9 vs. 75,0%, p<0,001). Na análise de regressão logística, a idade>72 anos (OR=3,79, IC 95%=1,62-8,86, p=0,002), o BNP≥100 pg/ml (OR=6,24, IC 95%=2,95-13,23, p<0,001) e a taxa de filtração glomerular estimada (TFGE)(OR=0,98, IC 95%=0,97-0,99, p=0.049) foram preditores independentes de mortalidade. Conclusões: O BNP dosado à admissão dos pacientes com SCASSST é um forte e independente preditor de mortalidade a longo prazo.

Modulação por Sucupira (Pterodon polygalaeflorus, Benth) da distribuição de Linfócitos T ativados e T de memória em linfonodos (LN) de camundongos com Artrite Induzida por Colágeno tipo II (CIA) e da mielopoiese em baços de camundongos primados com Adjuvante Completo de Freund (AFC)

Sementes de árvores do gênero Pterodon, conhecidas principalmente pelo nome Sucupira, são utilizadas popularmente para o tratamento de doenças reumáticas. Na presente dissertação, temos como objetivo estudar a possível ação do extrato hidroalcoólico de sementes de Pterodon polygalaeflorus (EHPp) no tratamento de Artrite Induzida por Colágeno tipo II (CIA) em camundongos DBA/1J. Verificou-se a distribuição de Linfócitos T CD4+ com fenótipo de memória em linfonodos de animais com CIA; a possível interferência do tratamento no segundo aumento de células mielóides (Mac-1+) esplênicas gerado pela segunda injeção de colágeno tipo II (CII) para indução da CIA e confirmou-se o fenótipo granulocítico dessas células mielóides. Além disso, através de outro modelo experimental de 10 dias de duração, objetivou-se estudar as células mielóides Mac-1+: se o tratamento com EHPp interfere na mielopoese esplênica induzida somente pela injeção de Adjuvante de Freund Completo (AFC) em camundongos DBA1/J e avaliar uma eventual diferença entre o grau de ativação dessas células em animais primados com AFC tratados ou não com EHPp. A CIA foi induzida em camundongos DBA/1J machos, por injeção intradérmica (i.d.) de CII em AFC com reforço intraperitonial de CII três semanas após a primeira injeção. O tratamento oral, diário, com EHPp por cerca de 30 dias foi iniciado no dia do reforço com CII. No modelo de curta duração, com o intuito de verificar o possível aumento de células Mac-1+ no baço, os animais foram tratados oralmente com EHPp, por 9 dias, sendo o AFC injetado, i.d., no 5o dia do tratamento e os animais sacrificados no 10o. Os resultados obtidos foram: o tratamento com EHPp interfere na distribuição de Linfócitos T com fenótipo de memória em animais com indução de CIA; resultados preliminares sugerem que o tratamento com EHPp não interfere no segundo aumento de células mielóides no baço no modelo CIA; a maioria das células mielóides presentes no baço de animais sadios ou de animais com CIA apresenta fenótipo granulocítico (GR.1+); o tratamento com EHPp reduz significantemente a mielopoese esplênica induzida pela injeção de AFC; a fração significante de células Mac-1+ no baço de animais primados com AFC apresenta aumento de produção de Espécies Reativas de Oxigênio em relação aos animais sadios ou tratados com EHPp. Em conjunto, estes resultados permitem identificar uma possível ação anti-inflamatória do EHPp ao impedir o aumento de células inflamatórias no baço de animais primados com AFC, bem como uma atividade imunossupressora, evidenciada pela redução de Linfócitos com perfil de recém ativação e de Linfócitos com perfil de memória nos LNs em relação aos animais com CIA, sugerindo o seu envolvimento nos processos de ativação e de migração linfocitários.

ExoU, uma proteína do sistema de secreção do tipo III de Pseudomonas aeruginosa, induz a secreção de eicosanóides por células epiteliais respiratórias. Papel dos corpúsculos lipídicos neste processo

Para pesquisar o papel de ExoU no desencadeamento de resposta inflamatória nas vias aéreas, células epiteliais respiratórias humanas (CERs) da linhagem BEAS-2B foram tratadas com AA radiomarcado e infectadas com a cepa PA103 de P. aeruginosa, que secreta ExoU, e com os mutantes PA103exoU (com deleção do gene exoU), PA103ΔUT/exoU (com deleção de exoU e complementação com o gene funcional) e PA103UT/S142A (com deleção de exoU e complementação com gene com mutagênese sítio-específica no domínio catalítico da enzima). Após 1 hora, a liberação de AA pelas culturas infectadas com as cepas produtoras de ExoU foi significativamente superior à observada em culturas infectadas pelas cepas não-produtoras ou por células controle. O tratamento das bactérias com MAFP, um inibidor de PLA2, resultou em significativa redução na liberação de AA. Células infectadas pelas cepas PA103 e PA103ΔUT/exoU secretaram PGE2 e LTB4 em concentrações significativamente maiores que as secretadas por células infectadas pelas demais cepas ou não infectadas. O tratamento com o MAFP reduziu significativamente a secreção de PGE2. A análise, por citometria de fluxo, de células infectadas e não infectadas tratadas com anticorpo anti-COX-2 mostrou que o percentual de células infectadas por PA103 marcadas foi significativamente superior ao percentual encontrado em culturas controle. Nenhuma diferença foi observada quanto ao percentual de células marcadas em culturas infectadas por PA103ΔexoU. O tratamento das culturas com NS-398 (um inibidor seletivo de COX-2) resultou na diminuição significativa da concentração de PGE2, secretada por células infectadas com PA103, mas não por células infectadas com PA103ΔexoU ou por células controle. Corpúsculos lipídicos (CLs) são domínios citoplasmáticos ricos em COX-2 e outras enzimas responsáveis pelo metabolismo do AA, sede da produção de eicosanóides. Como células infectadas pelas cepas produtoras de ExoU liberam AA livre, formulamos a hipótese de que a maior produção de eicosanóides por estas células seria dependente da indução do aumento no número dos CLs. No entanto, a análise por citometria de fluxo de células tratadas com uma sonda lipofílica com afinidade com os CLs mostrou que o percentual de células marcadas em culturas infectadas pelas cepas produtoras de ExoU foi significativamente inferior ao percentual em culturas controle ou infectadas pelas outras 2 cepas bacterianas. O tratamento das células com MAFP inibiu significativamente a redução do percentual de células contendo CLs. A análise, por citometria de fluxo, de células controle ou infectadas tratadas simultaneamente com a sonda lipofílica e com o anticorpo anti-PGE2, mostrou, em células infectadas com PA103, a redução da mediana da intensidade de marcação com a sonda lipofílica e o aumento da mediana da intensidade de marcação com o anticorpo anti-PGE2. Nossa hipótese é que a presença de ExoU nas células infectadas com a cepa PA103 resulte no metabolismo de glicerofosfolipídios presente nos CLs levando à diminuição da afinidade dos CLs pela sonda lipofílica e à síntese local de PGE2.

Materiais tipo hidrotalcita contendo Cu como precursores de catalisadores para a redução de NO pelo CO

Dentre os óxidos de nitrogênio, o N2O é um gás do efeito estufa altamente nocivo. Devido ao potencial contaminante que este possui, torna-se importante a implementação de processos capazes de reduzir a sua emissão, bem como a dos NOx. Tradicionalmente, têm-se empregado catalisadores baseados em metais nobres, porém estes apresentam como principal desvantagem o elevado custo. Desse modo, sempre houve o interesse pelo uso de outros tipos de catalisadores e metais neste sistema de reação. Nesse contexto, na presente dissertação procurou-se sintetizar precursores de catalisadores tipo hidrotalcita Cu-AlCO3 e avaliar o seu desempenho na reação de redução do NO pelo CO, visando melhorar a atividade e a seletividade a N2. Foram estudados diversos parâmetros de síntese e diferentes composições. Os parâmetros mais influentes na síntese foram a relação molar H2O/(Al+Cu) e a temperatura de secagem do sólido, cujos melhores valores foram 434 e 25C, respectivamente. Testaram-se dois sólidos, o primeiro composto pela fase hidrotalcita quase pura e o segundo com uma clara mistura entre fases hidrotalcita e malaquita. As análises térmica e química revelaram presença da fase malaquita em ambos os materiais com porcentagens de 14 e 40%, respectivamente. Os resultados de difração de raios X indicaram a presença da fase CuO para os catalisadores provenientes da calcinação dos materiais tipo hidrotalcita, porém a espectroscopia Raman evidenciou a presença de Cu2O no catalisador proveniente do material com maior mistura de fases. Os ciclos redox mostraram uma melhora na redutibilidade dos catalisadores após um ciclo de oxidação-redução. Além disso, foi estudado o impacto do envelhecimento térmico a 900C por 12 h no desempenho dos catalisadores. Pelos resultados de teste catalítico os melhores desempenhos foram alcançados pelos catalisadores envelhecidos, contudo o catalisador proveniente do precursor mais puro apresentou-se melhor tanto novo como envelhecido em termos de menor rendimento de N2O. Uma comparação com catalisadores à base de metal nobre mostrou um bom desempenho dos catalisadores à base de cobre, com a vantagem destes apresentarem menor emissão de N2O em temperaturas menores

Condições de contorno tipo albedo para cálculos globais de reatores nucleares com o modelo de dois grupos de energia na formulação de transporte SN em geometria bidimensional cartesiana

Os eventos de fissão nuclear, resultados da interação dos nêutrons com os núcleos dos átomos do meio hospedeiro multiplicativo, não estão presentes em algumas regiões dos reatores nucleares, e.g., moderador, refletor, e meios estruturais. Nesses domínios espaciais não há geração de potência nuclear térmica e, além disso, comprometem a eficiência computacional dos cálculos globais de reatores nucleares. Propomos nesta tese uma estratégia visando a aumentar a eficiência computacional dessas simulações eliminando os cálculos numéricos explícitos no interior das regiões não-multiplicativas (baffle e refletor) em torno do núcleo ativo. Apresentamos algumas modelagens e discutimos a eficiência da aplicação dessas condições de contorno aproximadas tipo albedo para uma e duas regiões nãomultiplicativas, na formulação de ordenadas discretas (SN) para problemas de autovalor a dois grupos de energia em geometria bidimensional cartesiana. A denominação Albedo, palavra de origem latina para alvura, foi originalmente definida como a fração da luz incidente que é refletida difusamente por uma superfície. Esta denominação latina permaneceu como o termo científico usual em astronomia e, nesta tese, este conceito é estendido para reflexão de nêutrons. Estas condições de contorno tipo albedo SN não-convencional substituem aproximadamente as regiões de baffle e refletor no em torno do núcleo ativo do reator, desprezando os termos de fuga transversal no interior dessas regiões. Se o problema, em particular, não possui termos de fuga transversal, i.e., trata-se de um problema unidimensional, então as condições de contorno albedo, como propostas nesta tese, são exatas. Por eficiência computacional entende-se a análise da precisão dos resultados numéricos em comparação com o tempo de execução computacional de cada simulação de um dado problema-modelo. Resultados numéricos considerando dois problemas-modelo com de simetria são considerados para ilustrar esta análise de eficiência.