Segmentación automática de ramificaciones y espinas dendríticas a través de muestras obtenidas mediante microscopía confocal.

Este documento está organizado en cuatro grandes bloques. Tras este primer bloque introductorio, con un enfoque global, está el bloque II, dedicado al estado de la cuestión. En ella se desarrollarán, en dos capítulos, temas fuertemente relacionados con este proyecto. Por un lado, se ha realiza una introducción a la Neurociencia y a toda la parte biológica que se tratará durante el documento. Se explicarán herramientas informáticas que actualmente se usan en la biología, y se presentarán trabajos previos similares a los de este trabajo, y sobre todo la forma actual de recuperación de los datos biológicos necesarios. La parte III se corresponde con el estudio del problema y las posibles propuestas para su resolución. Se tratarán todos los algoritmos estudiados y se mostrarán los resultados obtenidos de la ejecución de alguno de ellos. En la última parte y para terminar, se expondrán las conclusiones del trabajo realizado, así como las líneas futuras en este campo.

3D segmentations of neuronal nuclei from confocal microscope image stacks

In this paper, we present an algorithm to create 3D segmentations of neuronal cells from stacks of previously segmented 2D images. The idea behind this proposal is to provide a general method to reconstruct 3D structures from 2D stacks, regardless of how these 2D stacks have been obtained. The algorithm not only reuses the information obtained in the 2D segmentation, but also attempts to correct some typical mistakes made by the 2D segmentation algorithms (for example, under segmentation of tightly-coupled clusters of cells). We have tested our algorithm in a real scenario?the segmentation of the neuronal nuclei in different layers of the rat cerebral cortex. Several representative images from different layers of the cerebral cortex have been considered and several 2D segmentation algorithms have been compared. Furthermore, the algorithm has also been compared with the traditional 3D Watershed algorithm and the results obtained here show better performance in terms of correctly identified neuronal nuclei.

Resolución estructural en 3D de electrocerámicas mediante microscopía Raman confocal

Las propiedades de los materiales cerámicos son una combinación entre las propiedades intrínsecas, definidas por los granos cristalinos, y las propiedades extrínsecas, como son bordes de grano y fases secundarias. La relación entre estos dos elementos produce en muchas ocasiones, la presencia de propiedades inusuales que son la base de muchos materiales electrocerámicos. Sirvan como ejemplo algunos materiales tipo como son: varistores cerámicos, termistores, materiales con coeficiente de resistividad positivo, sensores de borde de grano, etc. En un material electrocerámico con respuesta funcional la correlación entre estructura-microestructura -propiedades es una constante, tanto en la etapa de diseño en laboratorio como en la etapa de producción industrial. El empleo de Microscopía Raman Confocal (MRC) se propone como una metodología relevante para el estudio de los factores que afectan a dichas correlaciones en materiales electrocerámicos. La técnica de MRC constituye una potente herramienta que permite determinar no solo la estructura sino las interacciones entre los elementos microestructurales. La correlación entre estas variables con las propiedades funcionales y la posibilidad de determinar las mismas en condiciones de operación, abren unas posibilidades que hasta la fecha solo estaban en la imaginación de los científicos. En esta presentación se resumen brevemente algunos de los principios relacionados con la técnica de Microscopía Raman Confocal, que junto con ejemplos seleccionados permiten visualizar aspectos relacionados con: la orientación de cristales, identificación fases cristalinas; resolución de nanoestructuras e interfases; determinación y dinámica de dominios ferroeléctricos; presencia de tensiones mecánicas; fenómenos de conducción,... sobre diferentes materiales cerámicos. Los trabajos mostrados son ejemplos de alta resolución en 3D de materiales funcionales como son los materiales electrocerámicos.

Mejora de la segmentación de espinas en imágenes de microscopía confocal

La reconstrucción y caracterización de las espinas dendríticas es hoy en día un área de trabajo de gran interés en la investigación neurobiológica. Las dendritas son prolongaciones en forma de ramas de la neurona. Las espinas dendríticas se encuentran a lo largo de las dendritas y son las encargadas de transmitir los impulsos electroquímicos al cuerpo de la neurona. El objetivo de este trabajo es desarrollar un algoritmo con el objetivo de mejorar las reconstrucciones 3D de las espinas dendríticas. Se ha utilizado un algoritmo de segmentación basado en los contornos activos morfológicos para analizar las imágenes de partida y conseguir nuevas reconstrucciones 3D fieles a estas imágenes. En este documento presentamos todo el desarrollo necesario para llevar a cabo los objetivos del proyecto. Por último también se presentarán los resultados obtenidos con este método comparándolo con las reconstrucciones de partida. ABSTRACT The reconstruction and characterization of dendritic spines is a hot topic in modern neurobiology research. Dendrites are the branched ramifications of a neuron. Dendritic spines are found along the dendrites and are responsible for transmitting electrochemical signals to the neuron’s main body. The purpose of this work is to develop an algorithm to improve the 3D reconstruction of dendritic spines. We use a segmentation algorithm based on morphological active contours to analyze the images and get new faithful 3D reconstructions of these images. In this document we present all the development necessary to accomplish the project goals. Finally, we will compare present results obtained by this method with the starting reconstructions.

Uncertainty Estimation for Performance Evaluation of a Confocal Microscope as Metrology Equipment

Both in industry and research, the quality control of micrometric manufactured parts is based on the measurement of parameters whose traceability is sometimes difficult to guarantee. In some of these parts, the confocal microscopy shows great aptitudes to characterize a measurand qualitatively and quantitatively. The confocal microscopy allows the acquisition of 2D and 3D images that are easily manipulated. Nowadays, this equipment is manufactured by many different brands, each of them claiming a resolution probably not in accord to their real performance. The Laser Center (Technical University of Madrid) has a confocal microscope to verify the dimensions of the micro mechanizing in their own research projects. The present study pretends to confirm that the magnitudes obtained are true and reliable. To achieve this, a methodology for confocal microscope calibration is proposed, as well as an experimental phase for dimensionally valuing the equipment by 4 different standard positions, with its seven magnifications and the six objective lenses that the equipment currently has, in the x–y and z axis. From the results the uncertainty will be estimated along with an effect analysis of the different magnifications in each of the objective lenses.

Caracterización geométrica de huellas de dureza Brinell mediante equipos ópticos. Modelo con microscopía confocal

En esta tesis se desarrolla una metodología alternativa para la determinación de la dureza Brinell a partir de imágenes obtenidas mediante microscopía confocal, que se ha mostrado robusta para mejorar los resultados de medición del diámetro en condiciones de reproducibilidad. Las validaciones realizadas evidencian su posibilidad real de implementación, especialmente para la certificación de patrones de dureza. Los estudios experimentales realizados ponen de manifiesto que la medición del diámetro de una huella de dureza Brinell, siguiendo la metodología tradicional, depende de la posición del patrón, de las características del equipo empleado y del propio operador. Dicha medida resulta crítica y las dificultades para identificar el borde de la huella incorporan a menudo una fuente adicional de incertidumbre difícil de soslayar. En esta investigación se han desarrollado dos modelos matemáticos que permiten identificar de forma unívoca el diámetro de la huella en el punto donde se produce el límite de contacto entre el indentador y el material de la probeta durante la realización del ensayo. Ambos modelos han sido implementados en Matlab® y se ha verificado su validez mediante datos sintéticos. Asimismo, se ha realizado una validación experimental sobre patrones de dureza certificados, empleando un microscopio confocal marca Leica, modelo DCM 3D disponible en el Laboratorio de Investigación de Materiales de Interés Tecnológico (LIMIT) de la Escuela Técnica Superior de Ingeniería y Diseño Industrial de la Universidad Politécnica de Madrid (ETSIDI – UPM). Dicha validación ha puesto de manifiesto la utilidad de esta nueva metodología por cuanto permite caracterizar las huellas, estimar las incertidumbres de medida y garantizar la trazabilidad metrológica de los resultados. ABSTRACT This PhD thesis presents an alternative methodology to determine the Brinell hardness from the images obtained by confocal microscopy that has proved to be robust to improve the results of indentation diameter measurements in reproducibility conditions. The validations carried out show the real possibility of its implementation, especially for calibration of hardness reference blocks. Experimental studies performed worldwide show that the measurement of the indentation diameter in a Brinell hardness test depends, when the traditional methodology is applied, on the position of the test block, the equipment characteristics and the operator. This measurement is critical and the difficulties to identify the edge of the indentation often bring an additional source of uncertainty with them that is hard to avoid. In this research two specific mathematical models have been developed to identify unambiguously the indentation diameter at the point where the edge of the boundary between the indenter and the test block is found during the test. Both models have been implemented on Matlab® and their validity has been verified by synthetic data An additional experimental validation with calibrated hardness reference blocks has been carried out using a Leica-brand confocal microscope, model DCM 3D, available in the Laboratory for Research on Materials of Technological Interest (LIMIT in its Spanish acronym) of the Escuela Técnica Superior de Ingeniería y Diseño Industrial de la Universidad Politécnica de Madrid (ETSIDI-UPM). This validation has shown the utility of this new methodology since it allows to characterize the indentation, to estimate the measurement uncertainties and to ensure the metrological traceability of the results.