Tipología de Replicaciones para la Síntesis de Experimentos en Ingeniería del Software

La Ingenieria del Software Experimental (ISE) traslada a la Ingenieria del Software (IS) el paradigma experimental que se ha aplicado con exito en diversas disciplinas cientificas. El objetivo de la ISE es hacer de la construccion del software una actividad predecible gracias al conocimiento de las relaciones entre los procesos de produccion del software y los productos que se obtienen. Para avanzar en el paradigma experimental en IS no es suficiente aplicar las tecnicas de diseno experimental y el analisis estadistico de datos, sino que es necesario construir una metodologia (bien desde cero o adaptada de otras disciplinas) basada en los principios generales del experimentalismo. La motivacion principal de esta investigacion es trabajar en la adaptacion de un aspecto particular del paradigma experimental a la experimentacion en IS: la replicación. En ISE se han realizado varias replicaciones de experimentos, sin embargo, aun existe discusion sobre el modo mas adecuado de llevarlas a cabo. Algunas preguntas que surgen de esta discusion son: .se deben reutilizar los materiales del experimento base?, .la replicacion debe realizarse de forma independiente, o puede existir algun tipo de comunicacion entre experimentadores y replicadores?, .que elementos de la estructura del experimento a replicar pueden variarse y aun considerarse una replicacion? En esta investigacion se estudia el concepto de replicacion desde una perspectiva teorico-practica para su incorporacion a la ISE. En concreto, se persiguen los siguientes objetivos: 1) estudio del concepto de replicacion en distintas disciplinas cientificas para tener mayor comprension de su importacion a la ISE, 2) desarrollo de una tipologia de replicaciones que ayude a comprender tanto los diferentes tipos de replicacion que pueden llevarse a cabo en ISE, asi como el papel que cada uno de estos tipos desempena en la verificacion de resultados experimentales y 3) desarrollo de un marco conceptual con ideas clave para comparar conjuntos de replicaciones y obtener conocimiento de ellas que sea de utilidad tanto para el profesional como para el investigador. Para la evaluacion de las propuestas de esta tesis se usa un conjunto de 20 replicaciones de diversos autores donde entre otros aspectos se evalua la efectividad de tres tecnicas de evaluacion de software.

Migración e invernada de la gaviota sombría(Larus fuscus) en la Península Ibérica. Evolución de la especie en la Comunidad de Madrid. Propuestas de gestión.

El presente trabajo se pretende dar respuesta a algunas de las cuestiones que se plantean con la gaviota sombría (Larus fuscus) durante su estancia en la Península Ibérica y, más concretamente en la Comunidad de Madrid, donde en la actualidad se producen grandes concentraciones invernales que merecen un seguimiento detenido por las posibles implicaciones de gestión que pudieran derivarse de ello. Aspectos tan actuales como el control de las zoonosis en una especie que, actualmente, puede considerarse como periurbana, o el posible efecto que decenas de miles de gaviotas puedan tener sobre la calidad de las aguas de los embalses de agua potable, hacían imprescindible la realización de un estudio exhaustivo sobre la biología de la gaviota sombría en España y en la Comunidad Autónoma de Madrid. De esta forma, será posible establecer las medidas de gestión necesarias para controlar o corregir los problemas que de forma eventual pudieran aparecer con esta especie.

Estudio de la Efectividad de Tres Técnicas de Evaluación de Código: Resultados de una Serie de Experimentos.

Hasta la fecha se han evaluado distintas técnicas de verificación y validación teórica y empíricamente. La mayoría de las evaluaciones empíricas se han llevado a cabo sin sujetos, abstrayendo el efecto del sujeto sobre la técnica a la hora de aplicarla. Hemos evaluado mediante un experimento con sujetos la efectividad de tres técnicas de verificación y validación de código: partición en clases de equivalencia, cobertura de decisión y lectura de código mediante abstracciones sucesivas, estudiando la capacidad de las técnicas para la detección de fallos en tres programas distintos. Hemos replicado el experimento ocho veces en cuatro entornos distintos. Los resultados arrojan diferencias entre las técnicas y señalan variables contextuales del proyecto software que deberían considerarse cuando se quiera elegir o aplicar una técnica de verificación y validación.

Diseño de una Nueva Replicación de Experimentos sobre Entrevistas en Elicitación de Requisitos Utilizando Datos de las Amenazas a la Validez

Las entrevistas son las técnicas de elicitación más utilizadas en la Ingeniería de Requisitos (IR). Sin embargo, existen pocos trabajos de investigación centrados en estas técnicas y aún menos estudios experimentales. Recientemente hemos experimentado para analizar la efectividad de las entrevistas estructuradas y no estructuradas. Los resultados se combinaron con otros de estudios experimentales realizados en el campo de Sistemas de Información. Para ello se aplicó el meta-­análisis, con el objetivo de desarrollar directrices para usar las entrevistas en IR. Sin embargo, se han obtenido pocas debido a la diversidad, en términos de variables respuesta, de los estudios primarios. Aunque los estudios meta-analizados parecen similares según sus diseños, fijándonos en las amenazas a la validez se identifican más diferencias que similitudes. El análisis de estas amenazas puede ser un medio para comprender cómo mejorar el diseño de futuras replicaciones, ejecutadas para generar nuevas evidencias y mejorar resultados de los meta­análisis.

Podredumbre parda del melocotonero (Monilinia spp.) : detección, identificación de especies y contribución a la epidemiología de la enfermedad

Monilinia spp. (M. laxa, M. fructigena y M. fructicola) causa marchitez en brotes y flores, chancros en ramas y podredumbre de la fruta de hueso provocando pérdidas económicas importantes en años con climatología favorable para el desarrollo de la enfermedad, particularmente en variedades tardías de melocotonero y nectarino. En estos huéspedes en España, hasta el momento, la especie predominante es M. laxa y, en menor proporción, M. fructigena. La reciente introducción en Europa de la especie de cuarentena M. fructicola hace necesaria una detección e identificación rápida de cada una de las especies. Además, hay diversos aspectos de la etiología y epidemiología de la enfermedad que no se conocen en las condiciones de cultivo españolas. En un primer objetivo de esta Tesis se ha abordado la detección e identificación de las especies de Monilinia spp. causantes de podredumbre parda. El estudio de las bases epidemiológicas para el control de la enfermedad constituye el fin del segundo objetivo. Para la detección del género Monilinia en material vegetal por PCR, diferenciándolo de otros hongos presentes en la superficie del melocotonero, se diseñaron una pareja de cebadores siguiendo un análisis del ADN ribosomal. La discriminación entre especies de Monilinia se consiguió utilizando marcadores SCAR (región amplificada de secuencia caracterizada), obtenidos después de un estudio de marcadores polimórficos de ADN amplificados al azar (RAPDs). También fue diseñado un control interno de amplificación (CI) basado en la utilización de un plásmido con secuencias de los cebadores diferenciadores del género, para ser utilizado en el protocolo de diagnóstico de la podredumbre parda con el fin de reconocer falsos negativos debidos a la inhibición de PCR por componentes celulares del material vegetal. Se disponía de un kit comercial que permitía distinguir Monilinia de otros géneros y M. fructicola del resto de especies mediante anticuerpos monoclonales utilizando la técnica DAS-ELISA. En esta Tesis se probaron diferentes fuentes de material como micelio ó conidias procedentes de cultivos en APD, o el micelio de la superficie de frutas o de momias frescas, como formas de antígeno. Los resultados obtenidos con ELISA se compararon con la identificación por métodos morfológico-culturales y por PCR con los cebadores desarrollados en esta Tesis. Los resultados demostraron la posibilidad de una detección temprana en frutas frescas por este método, realzando las posibilidades de una diagnosis temprana para una prevención más eficaz de M. fructicola en fruta de hueso. El estudio epidemiológico de la enfermedad comenzó con la determinación de las principales fuentes de inóculo primario y su importancia relativa en melocotoneros y nectarinos del valle del Ebro. Para ello se muestrearon 9 huertos durante los años 2003 a 2005 recogiendo todas las momias, frutos abortados, gomas, chancros, y brotes necróticos en los árboles. También se recogieron brotes aparentemente sanos y muestras de material vegetal situados en el suelo. En estas muestras se determinó la presencia de Monilinia spp. Los resultados mostraron que la fuente principal de inóculo son las momias que se quedan en los árboles en las que la supervivencia del hongo tras el invierno es muy alta. También son fuentes de inóculo las momias del suelo y los brotes necróticos. De aquí se deriva que una recomendación importante para los agricultores es que deben eliminar este material de los huertos. Un aspecto no estudiado en melocotonero o nectarino en España es la posible relación que puede darse entre la incidencia de infecciones latentes en los frutos inmaduros a lo largo del cultivo y la incidencia de podredumbre en los frutos en el momento de la recolección y en postcosecha. Esta relación se había observado previamente en otros frutales de hueso infectados con M. fructicola en diversos países del mundo. Para estudiar esta relación se realizaron ensayos en cinco huertos comerciales de melocotonero y nectarino situados en el Valle del Ebro en cuatro estados fenológicos durante los años 2000-2002. No se observaron infecciones latentes en botón rosa, dándose la máxima incidencia en precosecha, aunque en algunos huertos se daba otro pico en el endurecimiento del embrión. La especie prevaleciente fue M. laxa. Se obtuvo una correlación positiva significativa entre la incidencia de infecciones latentes y la incidencia de podredumbre en postcosecha. Se desarrolló también un modelo de predicción de las infecciones latentes en función de la temperatura (T) y el periodo de humectación (W). Este modelo indicaba que T y W explicaban el 83% de la variación en la incidencia de infecciones latentes causadas por Monilinia spp. Por debajo de 8ºC no se predecían latentes, necesitándose más de 22h de W para predecir la ocurrencia de latentes con T = 8ºC, mientras que solo se necesitaban 5h de W a 25ºC. Se hicieron también ensayos en condiciones controladas para determinar la relación entre la incidencia de las infecciones latentes, las condiciones ambientales (T y W), la concentración de inóculo del patógeno (I) y el estado de desarrollo del huésped (S) y para validar el modelo de predicción desarrollado con los experimentos de campo. Estos ensayos se llevaron cabo con flores y frutos de nectarino procedentes de un huerto comercial en seis estados fenológicos en los años 2004 y 2005, demostrándose que la incidencia de podredumbre en postcosecha y de infecciones latentes estaba afectada por T, W, I y S. En los frutos se producían infecciones latentes cuando la T no era adecuada para el desarrollo de podredumbre. Una vez desarrollado el embrión eran necesarias más de 4-5h de W al día y un inóculo superior a 104 conidias ml-1 para que se desarrollase o podredumbre o infección latente. La ecuación del modelo obtenido con los datos de campo era capaz de predecir los datos observados en estos experimentos. Para evaluar el efecto del inóculo de Monilinia spp. en la incidencia de infecciones latentes y de podredumbre de frutos en postcosecha se hicieron 11 experimentos en huertos comerciales de melocotonero y nectarino del Valle del Ebro durante 2002 a 2005. Se observó una correlación positiva entre los números de conidias de Monilinia spp. en la superficie de los frutos y la incidencia de infecciones latentes De los estudios anteriores se deducen otras dos recomendaciones importantes para los agricultores: las estrategias de control deben tener en cuenta las infecciones latentes y estimar el riesgo potencial de las mismas basándose en la T y W. Deben tener también en cuenta la concentración de esporas de Monilinia spp. en la superficie de los frutos para disminuir el riesgo de podredumbre parda. El conocimiento de la estructura poblacional de los patógenos sienta las bases para establecer métodos más eficaces de manejo de las enfermedades. Por ello en esta Tesis se ha estudiado el grado de diversidad genética entre distintas poblaciones de M. laxa en diferentes localidades españolas utilizando 144 marcadores RAPDs (59 polimórficos y 85 monomórficos) y 21 aislados. El análisis de la estructura de la población reveló que la diversidad genética dentro de las subpoblaciones (huertos) (HS) representaba el 97% de la diversidad genética (HT), mientras que la diversidad genética entre subpoblaciones (DST) sólo representaba un 3% del total de esta diversidad. La magnitud relativa de la diferenciación génica entre subpoblaciones (GST) alcanzaba 0,032 y el número estimado de migrantes por generación (Nm) fue de 15,1. Los resultados obtenidos en los dendrogramas estaban de acuerdo con el análisis de diversidad génica. Las agrupaciones obtenidas eran independientes del huerto de procedencia, año o huésped. En la Tesis se discute la importancia relativa de las diferentes fuentes evolutivas en las poblaciones de M. laxa. Finalmente se realizó un muestreo en distintos huertos de melocotonero y nectarino del Valle del Ebro para determinar la existencia o no de aislados resistentes a los fungicidas del grupo de los benzimidazoles y las dicarboximidas, fungicidas utilizados habitualmente para el control de la podredumbre parda y con alto riesgo de desarrollar resistencia en las poblaciones patógenas. El análisis de 114 aislados de M. laxa con los fungicidas Benomilo (bencimidazol) (1Bg m.a ml-1), e Iprodiona (dicarboximida) (5Bg m.a ml-1), mostró que ninguno era resistente en las dosis ensayadas. Monilinia spp. (M. laxa, M. fructigena and M. fructicola) cause bud and flower wilt, canker in branches and stone fruit rot giving rise important economic losses in years with appropriate environmental conditions, it is particularly important in late varieties of peach and nectarine. Right now, M. laxa is the major species for peach and nectarine in Spain followed by M. fructigena, in a smaller proportion. The recent introduction of the quarantine organism M. fructicola in Europe makes detection and identification of each one of the species necessary. In addition, there are different aspects of disease etiology and epidemiology that are not well known in Spain conditions. The first goal of this Thesis was the detection and identification of Monilinia spp. causing brown rot. Study of the epidemiology basis for disease control was the second objective. A pair of primers for PCR detection was designed based on the ribosomal DNA sequence in order to detect Monilinia spp. in plant material and to discriminate it from other fungi colonizing peach tree surface. Discrimination among Monilinia spp. was successful by SCAR markers (Sequence Characterized Amplified Region), obtained after a random amplified polymorphic DNA markers (RAPDs) study. An internal control for the PCR (CI) based on the use of a mimic plasmid designed on the primers specific for Monilinia was constructed to be used in diagnosis protocol for brown rot in order to avoid false negatives due to the inhibition of PCR as consequence of remained plant material. A commercial kit based on DAS-ELISA and monoclonals antibodies was successfully tested to distinguish Monilinia from other fungus genera and M. fructicola from other Monilinia species. Different materials such as micelium or conidias from APD cultures, or micelium from fresh fruit surfaces or mummies were tested in this Thesis, as antigens. Results obtained by ELISA were compared to classical identification by morphologic methods and PCR with the primers developed in this Thesis. Results demonstrated the possibility of an early detection in fresh fruits by this method for a more effective prevention of M. fructicola in stone fruit. The epidemiology study of the disease started with the determination of the main sources of primary inoculum and its relative importance in peach trees and nectarines in the Ebro valley. Nine orchards were evaluated during years 2003 to 2005 collecting all mummies, aborted fruits, rubbers, cankers, and necrotic buds from the trees. Apparently healthy buds and plant material located in the ground were also collected. In these samples presence of Monilinia spp. was determined. Results showed that the main inoculum sources are mummies that stay in the trees and where fungus survival after the winter is very high. Mummies on the ground and the necrotics buds are also sources of inoculum. As consequence of this an important recommendation for the growers is the removal of this material of the orchards. An important issue not well studied in peach or nectarine in Spain is the possible relationship between the incidence of latent infections in the immature fruits and the incidence of fruit rot at harvesting and postharvesting. This relationship had been previously shown in other stone fruit trees infected with M. fructicola in different countries over the world. In order to study this relationship experiments were run in five commercial peach and nectarine orchards located in the Ebro Valley in four phenologic states from 2000 to 2002. Latent infections were not observed in pink button, the maxima incidence arise in preharvest, although in some orchards another increase occurred in the embryo hardening. The most prevalence species was M. laxa. A significant positive correlation between the incidence of latent infections and the incidence of rot in postharvest was obtained. A prediction model of the latent infections based on the temperature (T) and the wetness duration (W) was also developed. This model showed that T and W explained 83% of the variation in latent infection incidence caused by Monilinia spp. Below 8ºC latent infection was not predicted, more than 22h of W with T = 8ºC were needed to predict latent infection occurrence of, whereas at 25ºC just 5h of W were enough. Tests under controlled conditions were also made to determine the relationship among latent infections incidence, environmental conditions (T and W), inoculum concentration of the pathogen (I) and development state of the host (S) to validate the prediction model developed on the field experiments. These tests were made with flowers and fruits of nectarine coming from a commercial orchard, in six phenologic states in 2004 and 2005, showing that incidence of rot in postharvest and latent infections were affected by T, W, I and S. In fruits latent infections took place when the T was not suitable for rot development. Once developed the embryo, more than 4-5h of W per day and higher inoculums (104 conidia ml-1) were necessary for rot or latent infection development. The equation of the model obtained with the field data was able to predict the data observed in these experiments. In order to evaluate the effect of inoculum of Monilinia spp. in the incidence of latent infections and of rot of fruits in postharvest, 11 experiments in commercial orchards of peach and nectarine of the Ebro Valley were performed from 2002 to 2005. A positive correlation between the conidial numbers of Monilinia spp. in the surface of the fruits and the incidence of latent infections was observed. Based on those studies other two important recommendations for the agriculturists are deduced: control strategies must consider the latent infections and potential risk based on the T and W. Spores concentration of Monilinia spp. in the surface of fruits must be also taken in concern to reduce the brown rot risk. The knowledge of the population structure of the pathogens determines the bases to establish more effective methods of diseases handling. For that reason in this Thesis the degree of genetic diversity among different M. laxa populations has been studied in different Spanish locations using 144 RAPDs markers (59 polymorphic and 85 monomorphics) on 21 fungal isolates. The analysis of the structure of the population revealed that the genetic diversity within the subpopulations (orchards) (HS) represented 97% of the genetic diversity (HT), whereas the genetic diversity between subpopulations (DST) only represented a 3% of the total of this diversity. The relative magnitude of the genic differentiation between subpopulations (GST) reached 0.032 and the considered number of migrantes by generation (Nm) was of 15.1. The results obtained in dendrograms were in agreement with the analysis of genic diversity. The obtained groupings were independent of the orchard of origin, year or host. In the Thesis the relative importance of the different evolutionary sources in the populations from M. laxa is discussed. Finally a sampling of resistant isolates in different orchards from peach and nectarine of Ebro Valley was made to determine the existence of fungicide resistance of the group of benzimidazoles and the dicarboximidas, fungicides used habitually for the control of rot brown and with high risk of resistance developing in the pathogenic populations. The analysis of 114 isolated ones of M. laxa with the fungicides Benomilo (bencimidazol) (1Bg m.a ml-1), and Iprodiona (dicarboximida) (5Bg m.a ml-1), showed no resistant in the doses evaluated.

Estudios de especiación de arsénico y acumulación de metales en muestras de interés medioambiental : Arsenic speciation and metal accumulation studies in environmental samples

Se ha estudiado la determinación de especies de arsénico y de contenidos totales de arsénico y metales pesados, específicamente cadmio, cromo, cobre, níquel, plomo y cinc, en muestras de interés medioambiental por su elevada capacidad acumuladora de metales, concretamente algas marinas comestibles y plantas terrestres procedentes de suelos contaminados por la actividad minera. La determinación de contenidos totales se ha llevado a cabo mediante espectrometría de emisión atómica con plasma de acoplamiento inductivo (ICP‐AES), así como por espectrometría de fluorescencia atómica con generación de hidruros (HG‐AFS), para bajos contenidos de arsénico. Las muestras fueron mineralizadas en medio ácido y calentamiento en horno de microondas. Los métodos fueron validados a través de su aplicación a materiales de referencia de matriz similar a la de las muestras, certificados en contenidos totales de los elementos seleccionados. Los resultados obtenidos mostraron su elevada capacidad de bioabsorción, especialmente en relación a los elevados contenidos de arsénico encontrados en algunas especies de algas pardas (Phaeophytas). En las plantas, se calcularon los factores de translocación, acumulación y biodisponibilidad de los elementos estudiados, permitiendo identificar a la especie Corrigiola telephiifolia como posible acumuladora de plomo e hiperacumuladora de arsénico. La determinación de especies de arsénico hidrosolubles en las muestras objeto de estudio, se llevó a cabo por cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) acoplado a ICP‐AES, HG‐ICP‐AES y HG‐AFS, incluyendo una etapa previa de foto‐oxidación. Los métodos desarrollados, mediante intercambio aniónico y catiónico, permitieron la diferenciación de hasta once especies de arsénico. Para el análisis de las muestras, fue necesaria la optimización de métodos de extracción, seleccionándose la extracción asistida por microondas (MAE) con agua desionizada. Asimismo, se realizaron estudios de estabilidad de arsénico total y de las especies hidrosolubles presentes en las algas, tanto sobre la muestra sólida como en sus extractos acuosos, evaluando las condiciones de almacenamiento adecuadas. En el caso de las plantas, la aplicación del diseño factorial de experimentos permitió optimizar el método de extracción y diferenciar entre las especies de arsénico presentes en forma de iones sencillos de mayor movilidad y el arsénico más fuertemente enlazado a componentes estructurales. Los resultados obtenidos permitieron identificar la presencia de arseniato (As(V)) y arsenito (As(III)) en las plantas, así como de ácido monometilarsónico (MMA) y óxido de trimetilarsina (TMAO) en algunas especies. En la mayoría de las algas se encontraron especies tóxicas, tanto mayoritarias (arseniato) como minoritarias (ácido dimetilarsínico (DMA)), así como hasta cuatro arsenoazúcares. Los resultados obtenidos y su estudio a través de la legislación vigente, mostraron la necesidad de desarrollar una reglamentación específica para el control de este tipo de alimentos. La determinación de especies de arsénico liposolubles en las muestras de algas se llevó a cabo mediante HPLC, en modo fase inversa, acoplado a espectrometría de masas con plasma de acoplamiento inductivo (ICP‐MS) y con ionización por electrospray (ESI‐MS), permitiendo la elucidación estructural de estos compuestos a través de la determinación de sus masas moleculares. Para ello, fue necesaria la puesta a punto de métodos extracción y purificación de los extractos. La metodología desarrollada permitió identificar hasta catorce especies de arsénico liposolubles en las algas, tres de ellas correspondientes a hidrocarburos que contienen arsénico, y once a arsenofosfolípidos, además de dos especies desconocidas. Las masas moleculares de las especies identificadas fueron confirmadas mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC‐MS) y espectrometría de masas de alta resolución (HR‐MS). ABSTRACT The determination of arsenic species and total arsenic and heavy metal contents (cadmium, chromium, cooper, nickel, lead and zinc) in environmental samples, with high metal accumulator capacity, has been studied. The samples studied were edible marine algae and terrestrial plants from soils polluted by mining activities. The determination of total element contents was performed by inductively coupled plasma atomic emission spectrometry (ICP‐AES), as well as by hydride generation atomic fluorescence spectrometry (HG‐AFS) for low arsenic contents. The samples studied were digested in an acidic medium by heating in a microwave oven. The digestion methods were validated against reference materials, with matrix similar to sample matrix and certified in total contents of the elements studied. The results showed the high biosorption capacity of the samples studied, especially regarding the high arsenic contents in some species of brown algae (Phaeophyta division). In terrestrial plants, the translocation, accumulation and bioavailability factors of the elements studied were calculated. Thus, the plant species Corrigiola telephiifolia was identified as possible lead accumulator and arsenic hyperaccumulator. The determination of water‐soluble arsenic species in the samples studied was carried out by high performance liquid chromatography (HPLC) coupled to ICP‐AES, HG‐ICP‐AES and HG‐AFS, including a prior photo‐oxidation step. The chromatographic methods developed, by anion and cation exchange, allowed us to differentiate up to eleven arsenic species. The sample analysis required the optimization of extraction methods, choosing the microwave assisted extraction (MAE) with deionized water. On the other hand, the stability of total arsenic and water‐soluble arsenic species in algae, both in the solid samples and in the water extracts, was studied, assessing the suitable storage conditions. In the case of plant samples, the application of a multivariate experimental design allowed us to optimize the extraction method and differentiate between the arsenic species present as simple ions of higher mobility and the arsenic more strongly bound to structural components. The presence of arsenite (As(III)) and arsenate (As(V)) was identified in plant samples, as well as monomethylarsonic acid (MMA) and trimethylarsine oxide (TMAO) in some cases. Regarding algae, toxic arsenic species were found in most of them, both As(V) and dimethylarsinic acid (DMA), as well as up to four arsenosugars. These results were discussed according to the current legislation, showing the need to develop specific regulations to control this kind of food products. The determination of lipid‐soluble arsenic species in alga samples was performed by reversed‐phase HPLC coupled to inductively coupled plasma and electrospray mass spectrometry (ICP‐MS and ESI‐MS), in order to establish the structure of these compounds by determining the corresponding molecular masses. For this purpose, it was necessary to develop an extraction method, as well as a clean‐up method of the extracts. The method developed permitted the identification of fourteen lipid‐soluble arsenic compounds in algae, corresponding to three arsenic‐hydrocarbons and eleven arsenosugarphospholipids, as well as two unknown compounds. Accurate mass measurements of the identified compounds were performed by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC‐MS) and high resolution mass spectrometry (HR‐MS).

Estrategias de proyectos: experimentos

DICCIONARIO MUTANTE Las palabras mutantes constituyen un tipo de neologismo. El ejercicio de la crítica permite el empleo de nuevos términos que facilitan la comprensión de aquellos nuevos conceptos e ideas que, necesariamente, tienen que aparecer acompañando a la nueva arquitectura. La necesidad u oportunidad de recurrir a la utilización de palabras de nuevo cuño se debe, la mayoría de las veces, a la inexistencia de un término que exprese de forma simple aquello que se quiere denominar sin recurrir a descripciones complejas. Hay neologismos que se imponen y caracterizan por su enorme fuerza expresiva. Toda disciplina que esté viva, está expuesta y deberá estar abierta a la aparición de neologismos. Puede afirmarse que una disciplina que no tenga la necesidad de incorporar nueva terminología está condenada a la decadencia. Las razones por las que se tiende a emplear un nuevo término residen en la necesidad expresar de forma específi ca aquello para lo que no existe palabra. En el Laboratorio de Crítica ARKRIT_LAB se propicia la adulteración de palabras con términos foráneos o inventados, buscando y defi niendo nuevas imágenes o nuevos enfoques. En nuestro mundo globalizado, y en permanente transformación, se debería favorecer y potenciar la aparición de términos mutantes, como parte de una experiencia permanente de redefi nición disciplinar.

Molecular basis of salt tolerance in Physcomitrella Patens model plant: potassium homeostasis and physiological roles of chx transporters

El suelo salino impone un estrés abiótico importante que causa graves problemas en la agricultura ya que la mayoría de los cultivos se ven afectados por la salinidad debido a efectos osmóticos y tóxicos. Por ello, la contaminación y la escasez de agua dulce, la salinización progresiva de tierras y el aumento exponencial de la población humana representan un grave problema que amenaza la seguridad alimentaria mundial para las generaciones futuras. Por lo tanto, aumentar la tolerancia a la salinidad de los cultivos es un objetivo estratégico e ineludible para garantizar el suministro de alimentos en el futuro. Mantener una óptima homeostasis de K+ en plantas que sufren estrés salino es un objetivo importante en el proceso de obtención de plantas tolerantes a la salinidad. Aunque el modelo de la homeostasis de K+ en las plantas está razonablemente bien descrito en términos de entrada de K+, muy poco se sabe acerca de los genes implicados en la salida de K+ o de su liberación desde la vacuola. En este trabajo se pretende aclarar algunos de los mecanismos implicados en la homeostasis de K+ en plantas. Para ello se eligió la briofita Physcomitrella patens, una planta no vascular de estructura simple y de fase haploide dominante que, entre muchas otras cualidades, hacen que sea un modelo ideal. Lo más importante es que no sólo P. patens es muy tolerante a altas concentraciones de Na+, sino que también su posición filogenética en la evolución de las plantas abre la posibilidad de estudiar los cambios claves que, durante el curso de la evolución, se produjeron en las diversas familias de los transportadores de K+. Se han propuesto varios transportadores de cationes como candidatos que podrían tener un papel en la salida de K+ o su liberación desde la vacuola, especialmente miembros de la familia CPA2 que contienen las familias de transportadores KEA y CHX. En este estudio se intenta aumentar nuestra comprensión de las funciones de los transportadores de CHX en las células de las plantas usando P. patens, como ya se ha dicho. En esta especie, se han identificado cuatro genes CHX, PpCHX1-4. Dos de estos genes, PpCHX1 y PpCHX2, se expresan aproximadamente al mismo nivel que el gen PpACT5, y los otros dos genes muestran una expresión muy baja. La expresión de PpCHX1 y PpCHX2 en mutantes de Escherichia coli defectivos en el transporte de K+ restauraron el crecimiento de esta cepa en medios con bajo contenido de K+, lo que viii sugiere que la entrada de K+ es energizada por un mecanismo de simporte con H+. Por otra parte, estos transportadores suprimieron el defecto asociado a la mutación kha1 en Saccharomyces cerevisiae, lo que sugiere que podrían mediar un antiporte en K+/H+. La proteína PpCHX1-GFP expresada transitoriamente en protoplastos de P. patens co-localizó con un marcador de Golgi. En experimentos similares, la proteína PpCHX2-GFP localizó aparentemente en la membrana plasmática y tonoplasto. Se construyeron las líneas mutantes simples de P. patens ΔPpchx1 y ΔPpchx2, y también el mutante doble ΔPpchx2 ΔPphak1. Los mutantes simples crecieron normalmente en todas las condiciones ensayadas y mostraron flujos de entrada normales de K+ y Rb+; la mutación ΔPpchx2 no aumentó el defecto de las plantas ΔPphak1. En experimentos a largo plazo, las plantas ΔPpchx2 mostraron una retención de Rb+ ligeramente superior que las plantas silvestres, lo que sugiere que PpCHX2 promueve la transferencia de Rb+ desde la vacuola al citosol o desde el citosol al medio externo, actuando en paralelo con otros transportadores. Sugerimos que transportadores de K+ de varias familias están involucrados en la homeostasis de pH de orgánulos ya sea mediante antiporte K+/H+ o simporte K+-H+.ix ABSTRACT Soil salinity is a major abiotic stress causing serious problems in agriculture as most crops are affected by it. Moreover, the contamination and shortage of freshwater, progressive land salinization and exponential increase of human population aggravates the problem implying that world food security may not be ensured for the next generations. Thus, a strategic and an unavoidable goal would be increasing salinity tolerance of plant crops to secure future food supply. Maintaining an optimum K+ homeostasis in plants under salinity stress is an important trait to pursue in the process of engineering salt tolerant plants. Although the model of K+ homeostasis in plants is reasonably well described in terms of K+ influx, very little is known about the genes implicated in K+ efflux or release from the vacuole. In this work, we aim to clarify some of the mechanisms involved in K+ homeostasis in plants. For this purpose, we chose the bryophyte plant Physcomitrella patens, a nonvascular plant of simple structure and dominant haploid phase that, among many other characteristics, makes it an ideal model. Most importantly, not only P. patens is very tolerant to high concentrations of Na+, but also its phylogenetic position in land plant evolution opens the possibility to study the key changes that occurred in K+ transporter families during the course of evolution. Several cation transporter candidates have been proposed to have a role in K+ efflux or release from the vacuole especially members of the CPA2 family which contains the KEA and CHX transporter families. We intended in this study to increase our understanding of the functions of CHX transporters in plant cells using P. patens, in which four CHX genes have been identified, PpCHX1-4. Two of these genes, PpCHX1 and PpCHX2, are expressed at approximately the same level as the PpACT5 gene, but the other two genes show an extremely low expression. PpCHX1 and PpCHX2 restored growth of Escherichia coli mutants on low K+-containing media, suggesting they mediated K+ uptake that may be energized by symport with H+. In contrast, these genes suppressed the defect associated to the kha1 mutation in Saccharomyces cerevisiae, which suggest that they might mediate K+/H+ antiport. PpCHX1-GFP protein transiently expressed in P. patens protoplasts co-localized with a Golgi marker. In similar experiments, the PpCHX2-GFP protein appeared to localize to tonoplast and plasma x membrane. We constructed the ΔPpchx1 and ΔPpchx2 single mutant lines, and the ΔPpchx2 ΔPphak1 double mutant. Single mutant plants grew normally under all the conditions tested and exhibited normal K+ and Rb+ influxes; the ΔPpchx2 mutation did not increase the defect of ΔPphak1 plants. In long-term experiments, ΔPpchx2 plants showed a slightly higher Rb+ retention than wild type plants, which suggests that PpCHX2 mediates the transfer of Rb+ from either the vacuole to the cytosol or from the cytosol to the external medium in parallel with other transporters. We suggest that K+ transporters of several families are involved in the pH homeostasis of organelles by mediating either K+/H+ antiport or K+-H+ symport.

Resistance to malathion and lambda-cyhalothrin in Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae)

La mosca mediterránea de la fruta, Ceratitis capitata (Wiedemann, 1824) (Diptera: Tephritidae), es una de las plagas de mayor incidencia económica en cítricos y otros frutales a nivel mundial. En España las medidas de control de esta plaga en cítricos, desde mediados de los 90 hasta 2009, se basaron principalmente en el monitoreo de las poblaciones y en la aplicación de tratamientos aéreos y terrestres con malatión cebo. Sin embargo, desde la retirada en la Unión Europea en 2009 de los productos fitosanitarios que contienen malatión, los insecticidas más utilizados para el control de esta plaga han sido lambda-cihalotrina y spinosad. En 2004-2005 se detectaron poblaciones españolas de C. capitata resistentes a malatión. Esta resistencia se ha asociado a una mutación (G328A) en la acetilcolinesterasa (AChE), a una duplicación del gen de la AChE (Ccace2) (una de las copias lleva la mutación G328A) y a resistencia metabólica mediada por esterasas (posiblemente aliesterasas). Sin embargo, cuando se secuenció la aliesterasa CcE7 en individuos de una línea resistente a malatión, no se encontró ninguna de las mutaciones (G137D y/o W251L/S/G) asociadas a resistencia en otras especies, si bien se encontraron otras mutaciones al compararlos con individuos de una línea susceptible. Asimismo, mediante la selección en laboratorio de una línea resistente a malatión (W-4Km) con lambda-cihalotrina, se ha podido obtener una línea resistente a lambda-cihalotrina (W-1K). Finalmente, se ha demostrado la capacidad de esta especie para desarrollar resistencia a spinosad mediante selección en laboratorio. Los múltiples mecanismos de resistencia identificados evidencian el potencial de esta especie para desarrollar resistencia a insecticidas con diferentes modos de acción. Los objetivos de esta tesis doctoral son: 1) evaluar la susceptibilidad de poblaciones españolas de campo de C. capitata a lambda-cihalotrina y dilucidar los mecanismos de resistencia en la línea W-1Kλ; 2) comparar la herencia, el coste biológico y la estabilidad de la resistencia a malatión mediada por la mutación G328A y la duplicación del gen Ccace2 (una de las copias lleva la mutación G328A); y 3) investigar el papel de las mutaciones identificadas en la aliesterasa CcαE7 en la resistencia a malatión. Estos estudios son de utilidad para el desarrollo de estrategias de manejo de la resistencia que puedan prevenir o retrasar la aparición de resistencia y aumentar la sostenibilidad de los insecticidas disponibles para el control de esta plaga. Nuestros resultados indican que las poblaciones españolas de C. capitata analizadas han desarrollado resistencia a lambda-cihalotrina. Los valores de CL50 estimados para las poblaciones recogidas en la Comunidad Valenciana, Cataluña y Andalucía oscilaron entre 129 ppm y 287 ppm, igualando o sobrepasando la concentración recomendada para los tratamientos de campo (125 ppm). Estos resultados contrastan con los obtenidos con tres poblaciones de campo recogidas en Túnez, cuya susceptibilidad fue similar a la de la línea control (C). La línea resistente a lambda-cihalotrina W-1K se continuó seleccionando en el laboratorio alcanzándose unos niveles de resistencia de 205 veces con respecto a la línea C, siendo su CL50 (4224 ppm) más de 30 veces superior a la concentración recomendada para los tratamientos de campo. Esta línea resistente mostró altos niveles de resistencia cruzada a deltametrina (150 veces) y a etofenprox (240 veces), lo que sugiere que el desarrollo de resistencia a lambda-cihalotrina podría comprometer la eficacia de otros piretroides para el control de esta plaga. Hemos demostrado que la resistencia de la línea W-1K a lambda-cihalotrina fue casi completamente suprimida por el sinergista PBO, lo que indica que las enzimas P450 desempeñan un papel muy importante en la resistencia a este insecticida. Sin embargo, tanto las moscas de la línea susceptible C como las de la línea resistente W-1K perdieron inmediatamente la capacidad de caminar (efecto “knock-down”) al ser tratadas tópicamente con lambda-cihalotrina, lo que sugiere que la resistencia no está mediada por alteraciones en la molécula diana (resistencia tipo “kdr”). La resistencia metabólica mediada por P450 fue analizada comparando la expresión de 53 genes CYP (codifican enzimas P450) de las familias CYP4, CYP6, CYP9 y CYP12 en adultos de la línea resistente W-1K y de la línea susceptible C. Nuestros resultados muestran que el gen CYP6A51 (número de acceso GenBank XM_004534804) fue sobreexpresado (13-18 veces) en la línea W-1K. Por otra parte, la expresión del gen CYP6A51 fue inducida tanto en adultos de la línea W-1K como de la línea C al ser tratados con lambda-cihalotrina. Sin embargo, no se obtuvieron diferencias significativas entre la línea susceptible C y la línea resistente W-1K al comparar la cantidad de P450 y la actividad NADPH-citocromo c reductasa presente en fracciones microsomales obtenidas a partir de abdómenes. Asimismo, no hemos podido correlacionar el metabolismo de deltametrina, estimado in vitro mediante la incubación de este insecticida con fracciones microsomales, con el nivel de resistencia a este piretroide observado en los bioensayos con la línea W-1K. Por otro lado, no se encontró ninguna alteración en la región promotora 5'UTR del gen CYP6A51 (-500 pb desde el inicio de la traducción) que pudiera explicar su sobreexpresión en la línea W-1K. Los datos obtenidos sugieren que la resistencia a lambda-cihalotrina en la línea W-1K está mediada por P450 y que la sobreexpresión de CYP6A51 puede desempeñar un papel importante, aunque se necesitan más evidencias para establecer una asociación directa de la resistencia con este gen. Hemos estudiado la herencia, el coste biológico y la estabilidad de la resistencia a malatión mediada por la mutación G328A y la duplicación del gen Ccace2 (una de las copias lleva la mutación G328A). La línea susceptible C, donde no se encuentra la mutación G328A (genotipo S/S), se cruzó con dos isolíneas establecidas para representar genotipos únicos correspondientes a los dos mecanismos de resistencia asociados a la molécula diana: 1) la isolínea 267Y (genotipo R/R) establecida a partir de una pareja que portaba la mutación G328A en homocigosis; 2) la isolínea 306TY (genotipo RS/RS) establecida a partir de una pareja que portaba en homocigosis la duplicación del gen Ccace2. No se realizaron cruces recíprocos, ya que mediante experimentos de hibridación in situ en cromosomas politénicos se pudo comprobar que el locus de la AChE y la duplicación (probablemente en tándem) se localizan en el cromosoma autosómico 2L. La susceptibilidad al malatión de los parentales resistentes (R/R o RS/RS) y susceptibles (S/S), los cruces F1 (S/R, S/RS y R/RS) y los retrocruzamientos indican que la resistencia a malatión es semi-dominante en ambos casos. Sin embargo, nuestros resultados no fueron concluyentes con respecto a la naturaleza monogénica de la resistencia a malatión en estas isolíneas. Por lo tanto, no podemos descartar que otros genes que contribuyan a la resistencia, además de la mutación G328A (isolínea 267Y) y de la duplicación del gen Ccace2 (isolínea 306TY), puedan haber sido seleccionados durante el proceso de selección de 267Y y 306TY. Varios parámetros biológicos fueron evaluados para determinar si estos dos mecanismos de resistencia a malatión suponen un coste biológico para los genotipos resistentes. Individuos con genotipo R/R mostraron un retraso en el tiempo de desarrollo de huevo a pupa, un peso de pupa reducido y una menor longevidad de los adultos, en comparación con los individuos con genotipo S/S. Sin embargo, el peso de pupa de los individuos con genotipo RS/RS fue similar al de los individuos S/S, y su desarrollo de huevo a pupa intermedio entre S/S y R/R. Estas diferencias en el coste biológico pueden estar relacionadas con la reducción de la eficiencia catalítica de la AChE mutada en los individuos R/R, y al efecto compensatorio que la copia no mutada del gen tiene en los individuos RS/RS que portan la duplicación. La estabilidad de la resistencia a malatión mediada por la mutación G328A y la duplicación se analizó mediante el seguimiento de los caracteres de resistencia en la progenie de retrocruzamientos S/R x R/R y S/RS x RS/RS a lo largo de varias generaciones en ausencia de presión de selección con insecticidas. Nuestros resultados muestran que la frecuencia del alelo que porta la mutación G328A disminuyó desde 67,5% en la primera generación del retrocruzamiento S/R x R/R (75% esperado, asumiendo segregación mendeliana y que sólo hay dos alelos: uno mutado y otro no mutado) a 12% después de 10 generaciones. Por el contrario, la frecuencia de la duplicación sólo disminuyó desde 75% en en la primera generación del retrocruzamiento S/RS x RS/RS (75% esperado, asumiendo segregación Mendeliana y que la duplicación segrega como un único alelo) a 50% en el mismo período, lo que indica que la duplicación es más estable que la mutación. Asimismo, se analizó la presencia de la mutación y de la duplicación en poblaciones de campo recogidas en seis localidades en 2004-2007, cuando todavía se usaba el malatión, y se comparó con poblaciones recogidas en los mismos campos en 2010, un año después de la prohibición del malatión en la Unión Europea. La frecuencia media del genotipo susceptible (S/S) aumentó del 55,9% en el período 2004-2007 a 70,8% en 2010, mientras que la frecuencia de los genotipos portadores de la mutación en homocigosis o heterocigosis (R/R y S/R) disminuyó del 30,4 al 9,2%, los que llevan la duplicación en homocigosis o heterocigosis (RS/RS y S/RS) aumentaron levemente desde 12,8 hasta 13,3%, y los que llevan a la vez la mutación y la duplicación (R/RS) también aumentaron del 1 al 6,7%. Estos resultados son consistentes con que la duplicación del gen Ccace2 (con una copia con la mutación G328A y la otra copia no mutada) es más ventajosa que la mutación G328A por si sola, ya que la duplicación mantiene los niveles de resistencia a la vez que limita el coste biológico. Para investigar la asociación entre la resistencia a malatión y las mutaciones encontradas previamente en CcE7, hemos generado isolíneas con mutaciones específicas seleccionadas por su ubicación próxima a la entrada al centro activo de la enzima. La isolínea Sm2 (procedente de una hembra heterocigota para la mutación V96L y un macho homocigoto para el alelo no mutado) mantuvo altos niveles de resistencia a malatión, incluso después de 30 generaciones sin presión de selección. Por el contrario, la isolínea 267Y (compuesta por individuos homocigotos para la mutación L267Y) y la línea 306TY (compuesta por individuos homocigotos para la doble mutación R306T-N307Y) mostraron una reducción significativa en los niveles de resistencia. También hemos encontrado que la resistencia a malatión de la línea Sm2 fue parcialmente revertida por DEF y TPP, y que Sm2 mostró una reducción significativa en la actividad MTB, como se ha descrito en otras especies que muestran resistencia específica a malatión mediada por aliesterases. Además, fue posible asociar la presencia de la mutación V96L en individuos de la línea Sm2 con supervivencia a una concentración discriminante de malatión (5,000 ppm) y con una baja actividad MTB. Estos resultados sugieren una posible relación entre la mutación V96L en la aliesterasa CcE7 y la resistencia a malatión, aunque todavía no se puede concluir que la resistencia es causada por esta mutación, siendo necesarios más estudios para comprobar su contribución a la resistencia. En conclusión, se ha encontrado por primera vez resistencia a lambda-cihalotrina en poblaciones de campo de C. capitata, y nuestros resultados indican que las P450 son el principal mecanismo de resistencia en la línea W-1K. Esta situación se suma al caso previamente descrito de resistencia en campo a malatión asociada a la mutación G328A, a la duplicación del gen Ccace2 (una de las copias lleva la mutación G328A) y a resistencia metabólica mediada por esterasas. Nuestros resultados también indican que la alteración de la molécula diana AChE parece ser responsable de un cierto nivel de resistencia a malatión en C. capitata, que puede ser estimada como aproximadamente 25-40 veces para la mutación G328A y 40-60 veces para la duplicación; mientras que la resistencia mediada por esterasas y que ha sido asociada en este estudio con la mutación V96L en CcE7 puede conferir un efecto multiplicativo (por un factor de 5 a 10) aumentando la resistencia a malatión a 200-400 veces. Por otra parte, hemos demostrado que los insectos resistentes que llevan la duplicación tienen un coste biológico menor y muestran una estabilidad mayor que aquellos con la mutación G328A en ausencia de presión de selección con insecticidas. Esto representa un escenario en el que los genotipos con la duplicación permanecerán en el campo en frecuencias bajas a moderadas, pero podrían ser seleccionados rápidamente si se utilizan malatión u otros insecticidas que muestren resistencia cruzada. Estos resultados tienen importantes implicaciones para los programas de manejo de la resistencia, ya que el repertorio de insecticidas eficaces para el control de C. capitata es cada vez más limitado. Además, la coexistencia de múltiples mecanismos de resistencia en poblaciones de campo ofrece el potencial para desarrollar resistencia frente a otros insecticidas disponibles para el control de esta plaga. Estrategias para de manejo de la resistencia basadas en la alternancia de insecticidas con diferentes modos de acción, y su combinación con otros métodos de control, deben ser implementadas para evitar el desarrollo de resistencia en campo. ABSTRACT The Mediterranean fruit fly (Medfly), Ceratitis capitata (Wiedemann, 1824) (Diptera: Tephritidae), is one of the most economically damaging pests of citrus and other fruit crops worldwide. Control measures in citrus crops in Spain from the mid 90's to 2009 were mainly based on field monitoring of population levels and aerial and ground treatments with malathion bait sprays. However, since the withdrawal of phytosanitary products containing malathion in the European Union in 2009, lambda-cyhalothrin and spinosad have become the most widely used insecticides for the control of this pest. Resistance to malathion was found in Spanish field populations of C. capitata in 2004-2005. This resistance has been associated with a mutation G328A in the acetylcholinesterase (AChE), a duplication of the AChE gene (Ccace2) (one of the copies bearing the mutation G328A), and metabolic resistance mediated by esterases (probably aliesterases). However, when the gene of the aliesterase CcE7 was sequenced in individuals from a malathion resistant strain of C. capitata, none of the known G137D and/or W251L/S/G mutations associated to resistance in other species were found, though other mutations were detected when compared with individuals from a susceptible strain. Noteworthy, a lambda-cyhalothrin resistant strain (W-1K) was obtained by selecting a field-derived malathion resistant strain (W-4Km) with lambda-cyhalothrin. Moreover, it has also been demonstrated the capacity of this species to develop resistance to spinosad by laboratory selection. The multiple resistance mechanisms identified highlight the potential of this species to develop resistance to insecticides with different modes of action. The objectives of this PhD Thesis are: 1) to assess the susceptibility of Spanish field populations of C. capitata to lambda-cyhalothrin and to elucidate the resistance mechanisms in the W-1Kλ strain; 2) to compare the inheritance, fitness cost and stability of the malathion resistance mediated by the G328A mutation and the duplication of the Ccace2 gene (with one of the copies bearing the mutation G328A); and 3) to investigate the role of the aliesterase CcαE7 mutations in malathion resistance. All these studies will be of use for devising proactive resistance management strategies that could prevent or delay resistance development and would increase the sustainability of the insecticides available for Medfly control. Our results indicate that Spanish field populations of C. capitata have developed resistance to lambda-cyhalothrin. The LC50 values estimated for populations collected at Comunidad Valenciana, Cataluña and Andalucía ranged from 129 ppm to 287 ppm, equaling or overpassing the recommended concentration for field treatments (125 ppm). These results contrast with those obtained with three different Tunisian field populations, whose susceptibility was similar to that of the control (C) strain. The lambda-cyhalothrin resistant W-1K strain has been further selected to achieve a 205-fold resistance compared to the C strain, being its LC50 (4,224 ppm) more than 30 times higher than the recommended concentration for field applications. This resistant strain showed high levels of cross-resistance to deltamethrin (150-fold) and etofenprox (240-fold), suggesting that the development of resistance to lambda-cyhalothrin may compromise the effectiveness of other pyrethroids for the control of this species. We have shown that the resistance of the W-1K strain to lambda-cyhalothrin was almost completely suppressed by the synergist PBO, indicating that P450 enzymes play a very important role in resistance to this insecticide. However, both susceptible C and resistant W-1K flies were knocked down after topical treatment with lambda-cyhalothrin, suggesting that kdr resistance mediated by alterations of the target site is not playing a major role. Metabolic resistance mediated by P450 was further analyzed by comparing the expression of 53 genes of the families CYP4, CYP6, CYP9 and CYP12 in adults flies from the resistant W-1K and the susceptible C strains. We found that the gene CYP6A51 (GenBank accession number XM_004534804) was overexpressed (13-18-fold) in the W-1K strain. Moreover, the expression of the CYP6A51 gene was induced when adults of the W-1K and C strains were treated with lambda-cyhalothrin. However, no significant differences were obtained between susceptible C and resistant W-1K strains for the quantity of P450 and for the activity of NADPH- cytochrome c reductase measured in microsomal fractions obtained from abdomens. Moreover, we failed to correlate the metabolism of deltamethrin, analyzed in vitro by incubating this insecticide with microsomal fractions, with the resistance level against this pyrethroid observed in bioassays with W-1K. The sequencing of the 5´UTR region of the CYP6A51 gene failed in finding an alteration in the promoter region (-500 bp from translation start site) that could explain overexpression in the W-1K strain. All data obtained suggest that resistance to lambda-cyhalothrin in the W- 1K strain is mediated by P450 and that overexpression of CYP6A51 may play a major role, although further evidences are needed to establish a direct association of resistance with this gene. We have studied the inheritance, fitness cost and stability of the malathion resistance mediated by the G328A mutation and the duplication of the Ccace2 gene (with one of the copies bearing the mutation G328A). The malathion-susceptible C strain where the G328A mutation is not found (S/S genotype) was crossed with two isolines established to represent unique genotypes corresponding to the two target-site resistance mechanisms: 1) the 267Y isoline (genotype R/R) was established from a couple bearing the mutation G328A in homozygosis; and 2) the 306TY isoline (genotype RS/RS) was established from a couple being homozygous for the duplication of the Ccace2 gene. Reciprocal crosses have not been performed, since in situ hybridization on polythene chromosomes showed that the AChE locus and the duplication (most probably in tandem) are placed at the autosomal chromosome 2L. Mortality responses to malathion of resistant isolines (R/R or RS/RS) and susceptible (S/S) genotypes, F1 crosses (S/R, S/RS, and R/RS), and the back-crosses indicated that resistance to malathion is inherited as a semi-dominant trait in both cases. However, our results were not conclusive about the monogenic nature of the resistance to malathion in these isolines. Thus, we can not discard that other genes contributing to resistance, in addition to the mutation G328A (isoline 267Y) and the duplication of the Ccace2 gene (isoline 306TY), may have been selected during the selection process of 267Y and 306TY. Several biological parameters were evaluated to determine if these two malathion resistance mechanisms impose a fitness cost for resistant genotypes. Individuals with genotype R/R have a reduced fitness in terms of developmental time from egg to pupa, pupal weight and adult longevity, when compared to susceptible individuals (genotype S/S). Interestingly, the fitness cost was substantially diminished in individuals with genotype RS/RS. These differences in fitness may be related to the reduction of the catalytic efficiency of mutated AChE in individuals R/R, and the compensatory effect that the non-mutated copy of the gene has on individuals RS/RS bearing the duplication. The stability of malathion reistance associated with the mutation G328A or the duplication was analyzed by following these resistant traits in the progeny of the back-crosses S/RS x RS/RS and S/R x R/R over consecutive generations in the absence of insecticide selection pressure. Our results show that the frequency of the allele bearing the mutation G328A decreased from 67.5% at the first generation of the back-cross S/R x R/R (75% expected, assuming Mendelian segregation and that there are only two alleles: one mutated and the other non-mutated) to 12% after 10 generations. By contrast, the frequency of the duplication only declined from 75% at the first generation of the back-cross S/RS x RS/RS (75% expected, assuming Mendelian segregation and that the duplication segregates as an unique allele) to 50% in the same period, indicating that the duplication is more stable than the mutation. The presence of the mutation and the duplication was analyzed in field populations collected in six localities in 2004-2007, when malathion was still used, and compared to populations collected in the same fields in 2010, one year after the prohibition of malathion in the European Union. The average frequency of the susceptible genotype (S/S) increased from 55.9% in the period 2004-2007 to 70.8% in 2010, whereas the frequency of those genotypes carrying the mutation in homozygosis or heterozygosis (R/R and S/R) declined from 30.4 to 9.2%, those carrying the duplication in homozygosis or heterozygosis (RS/RS and S/RS) increased slightly from 12.8 to 13.3%, and those carrying both the mutation and the duplication (R/RS) also increased from 1 to 6.7%. These results are consistent with the duplication of the Ccace2 gene (with one of the copies bearing the mutation G328A and the other copy non-mutated) being more advantageous than the G328A mutation alone by maintaining resistance while restoring part of the fitness. In order to investigate the association of malathion resistance with mutations previously found in the aliesterase CcE7, we have generated isolines bearing specific mutations selected by their putative location near the upper part of the active site gorge of the enzyme. The isoline Sm2 (originating from a female heterozygous for the mutation V96L and a male homozygous for the non-mutated allele) kept high levels of resistance to malathion, even after 30 generations without selection pressure. On the contrary, the isoline 267Y (composed by individuals homozygous for the mutation L267Y) and the strain 306TY (composed by homozygous for the double mutation R306T-N307Y) showed a significant reduction in the levels of resistance. We have found also that resistance to malathion in the Sm2 isoline was partially reverted by DEF and TPP, and that Sm2 showed a significant reduction in MTB activity, as reported for other species showing malathion-specific resistance mediated by aliesterases. Besides, it was possible to associate the presence of the mutation V96L in individuals from the Sm2 isoline with both survival to a discriminating concentration of malathion (5,000 ppm) and low MTB activity. Our results point out to a possible connection betwen the mutation V96L in the aliesterase CcE7 and resistance to malathion, though we can not yet conclude that the resistance is caused by the mutation, being needed further work to understand its contribution to resistance. In conclusion, resistance to lambda-cyhalothrin has been found for the first time in field populations of C. capitata, and metabolic resistance mediated by P450 appears to be the main resistance mechanism in the resistant strain W-1K. These findings add to the previously reported case of field resistance to malathion, associated to the G328A mutation and the duplication of the Ccace2 gene (with one of the copies bearing the mutation G328A) and to metabolic resistance mediated by esterases. Our results also indicate that altered target site AChE appears to be responsible for a certain level of resistance to malathion in C. capitata, that can be estimated as about 25-40-fold for the mutation G328A and 40-60-fold for the duplication; whereas metabolic resistance mediated by esterases and associated in this study with the mutation V96L in CcE7 may confer a multiplicative effect (by a factor of 5 to10) increasing malathion resistance to 200-400-fold. Moreover, we have shown that resistant insects carrying the duplication have better fitness and exhibit a higher stability than those with the mutation G328A in the absence of insecticide pressure. This represents a scenario where genotypes with the duplication will remain in the field at low to moderate frequencies, but could be rapidly selected if malathion or other insecticides showing cross-resistance are used. These findings have important implications for resistance management programs, as the repertoire of effective insecticides for C. capitata control is becoming very limited. Besides, multiple resistance mechanisms coexisting in field populations provide the potential to develop resistance to other available insecticides for the control of this pest. Appropriate resistance management strategies based on the alternation of insecticides with different modes of action, and their combination with other control methods, must then be implemented to avoid the evolution of resistance in the field.

La programación de ordenadores es una especie de actividad literaria.

Entrevista a Francisco Serradilla sobre las relaciones entre literatura y computación, creatividad e ingeniería.

Factores transcripcionales de la clase DOF en Brachypodium distachyon: caracterización molecular de BdDOF24 durante la germinación de las semillas

La semilla es el órgano que garantiza la propagación y continuidad evolutiva de las plantas espermatofitas y constituye un elemento indispensable en la alimentación humana y animal. La semilla de cereales acumula en el endospermo durante la maduración, mayoritariamente, almidón y proteínas de reserva. Estas reservas son hidrolizadas en la germinación por hidrolasas sintetizadas en la aleurona en respuesta a giberelinas (GA), siendo la principal fuente de energía hasta que la plántula emergente es fotosintéticamente activa. Ambas fases del desarrollo de la semilla, están reguladas por una red de factores de transcripción (TF) que unen motivos conservados en cis- en los promotores de sus genes diana. Los TFs son proteínas que han desempeñado un papel central en la evolución y en el proceso de domesticación, siendo uno de los principales mecanismos de regulación génica; en torno al 7% de los genes de plantas codifican TFs. Atendiendo al motivo de unión a DNA, éstos, se han clasificado en familias. La familia DOF (DNA binding with One Finger) participa en procesos vitales exclusivos de plantas superiores y sus ancestros cercanos (algas, musgos y helechos). En las semillas de las Triticeae (subfamilia Pooideae), se han identificado varias proteínas DOF que desempeñan un papel fundamental en la regulación de la expresión génica. Brachypodium distachyon es la primera especie de la subfamilia Pooideae cuyo genoma (272 Mbp) ha sido secuenciado. Su pequeño tamaño, ciclo de vida corto, y la posibilidad de ser transformado por Agrobacterium tumefaciens (plásmido Ti), hacen que sea el sistema modelo para el estudio de cereales de la tribu Triticeae con gran importancia agronómica mundial, como son el trigo y la cebada. En este trabajo, se han identificado 27 genes Dof en el genoma de B. distachyon y se han establecido las relaciones evolutivas entre estos genes Dof y los de cebada (subfamilia Pooideae) y de arroz (subfamilia Oryzoideae), construyendo un árbol filogenético en base al alineamiento múltiple del dominio DOF. La cebada contiene 26 genes Dof y en arroz se han anotado 30. El análisis filogenético establece cuatro grupos de genes ortólogos (MCOGs: Major Clusters of Orthologous Genes), que están validados por motivos conservados adicionales, además del dominio DOF, entre las secuencias de las proteínas de un mismo MCOG. El estudio global de expresión en diferentes órganos establece un grupo de nueve genes BdDof expresados abundantemente y/o preferencialmente en semillas. El estudio detallado de expresión de estos genes durante la maduración y germinación muestra que BdDof24, ortólogo putativo a BPBF-HvDOF24 de cebada, es el gen más abundante en las semillas en germinación de B. distachyon. La regulación transcripcional de los genes que codifican hidrolasas en la aleurona de las semillas de cereales durante la post‐germinación ha puesto de manifiesto la existencia en sus promotores de un motivo tripartito en cis- conservado GARC (GA-Responsive Complex), que unen TFs de la clase MYB-R2R3, DOF y MYBR1-SHAQKYF. En esta tesis, se ha caracterizado el gen BdCathB de Brachypodium que codifica una proteasa tipo catepsina B y es ortólogo a los genes Al21 de trigo y HvCathB de cebada, así como los TFs responsables de su regulación transcripcional BdDOF24 y BdGAMYB (ortólogo a HvGAMYB). El análisis in silico del promotor BdCathB ha identificado un motivo GARC conservado, en posición y secuencia, con sus ortólogos en trigo y cebada. La expresión de BdCathB se induce durante la germinación, así como la de los genes BdDof24 y BdGamyb. Además, los TFs BdDOF24 y BdGAMYB interaccionan en el sistema de dos híbridos de levadura e in planta en experimentos de complementación bimolecular fluorescente. En capas de aleurona de cebada, BdGAMYB activa el promotor BdCathB, mientras que BdDOF24 lo reprime; este resultado es similar al obtenido con los TFs ortólogos de cebada BPBF-HvDOF24 y HvGAMYB. Sin embargo, cuando las células de aleurona se transforman simultáneamente con los dos TFs, BdDOF24 tiene un efecto aditivo sobre la trans-activación mediada por BdGAMYB, mientras que su ortólogo BPBF-HvDOF24 produce el efecto contrario, revirtiendo el efecto de HvGAMYB sobre el promotor BdCathB. Las diferencias entre las secuencias deducidas de las proteínas BdDOF24 y BPBF-HvDOF24 podrían explicar las funciones opuestas que desempeñan en su interacción con GAMYB. Resultados preliminares con líneas de inserción de T-DNA y de sobre-expresión estable de BdGamyb, apoyan los resultados obtenidos en expresión transitoria. Además las líneas homocigotas knock-out para el gen BdGamyb presentan alteraciones en anteras y polen y no producen semillas viables. ABSTRACT The seed is the plant organ of the spermatophytes responsible for the dispersion and survival in the course of evolution. In addition, it constitutes one of the most importan elements of human food and animal feed. The main reserves accumulated in the endosperm of cereal seeds through the maturation phase of development are starch and proteins. Its degradation by hydrolases synthetized in aleurone cells in response to GA upon germination provides energy, carbon and nitrogen to the emerging seedling before it acquires complete photosynthetic capacity. Both phases of seed development are controlled by a network of transcription factors (TFs) that interact with specific cis- elements in the promoters of their target genes. TFs are proteins that have played a central role during evolution and domestication, being one of the most important regulatory mechanisms of gene expression. Around 7% of genes in plant genomes encode TFs. Based on the DNA binding motif, TFs are classified into families. The DOF (DNA binding with One Finger) family is involved in specific processes of plants and its ancestors (algae, mosses and ferns). Several DOF proteins have been described to play important roles in the regulation of genes in seeds of the Triticeae tribe (Pooideae subfamily). Brachypodium distachyon is the first member of the Pooideae subfamily to be sequenced. Its small size and compact structured genome (272 Mbp), the short life cycle, small plant size and the possibility of being transformed with Agrobacterium tumefaciens (Ti-plasmid) make Brachypodium the model system for comparative studies within cereals of the Triticeae tribe that have big economic value such as wheat and barley. In this study, 27 Dof genes have been identified in the genome of B. distachyon and the evolutionary relationships among these Dof genes and those frome barley (Pooideae subfamily) and those from rice (Oryzoideae subfamily) have been established by building a phylogenetic tree based on the multiple alignment of the DOF DNA binding domains. The barley genome (Hordeum vulgare) contains 26 Dof genes and in rice (Oryza sativa) 30 genes have been annotated. The phylogenetic analysis establishes four Major Clusters of Orthologous Genes (MCOGs) that are supported by additional conserved motives out of the DOF domain, between proteins of the same MCOG. The global expression study of BdDof genes in different organs and tissues classifies BdDof genes into two groups; nine of the 27 BdDof genes are abundantly or preferentially expressed in seeds. A more detailed expression analysis of these genes during seed maturation and germination shows that BdDof24, orholog to barley BPBF-HvDof24, is the most abundantly expressed gene in germinating seeds. Transcriptional regulation studies of genes that encode hydrolases in aleurone cells during post-germination of cereal seeds, have identified in their promoters a tripartite conserved cis- motif GARC (GA-Responsive Complex) that binds TFs of the MYB-R2R3, DOF and MYBR1-SHAQKYF families. In this thesis, the characterization of the BdCathB gene, encoding a Cathepsin B-like protease and that is ortholog to the wheat Al21 and the barley HvCathB genes, has been done and its transcriptional regulation by the TFs BdDOF24 and BdGAMYB (ortholog to HvGAMYB) studied. The in silico analysis of the BdCathB promoter sequence has identified a GARC motif. BdCathB expression is induced upon germination, as well as, those of BdDof24 and BdGamyb genes. Moreover, BdDOF24 and BdGAMYB interact in yeast (Yeast 2 Hybrid System, Y2HS) and in planta (Bimolecular Fluorecence Complementation, BiFC). In transient assays in aleurone cells, BdGAMYB activates the BdCathB promoter, whereas BdDOF24 is a transcriptional repressor, this result is similar to that obtained with the barley orthologous genes BPBF-HvDOF24 and HvGAMYB. However, when aleurone cells are simultaneously transformed with both TFs, BdDOF24 has an additive effect to the trans-activation mediated by BdGAMYB, while its ortholog BPBF-HvDOF24 produces an opposite effect by reducing the HvGAMYB activation of the BdCathB promoter. The differences among the deduced protein sequences between BdDOF24 and BPBF-HvDOF24 could explain their opposite functions in the interaction with GAMYB protein. Preliminary results of T-DNA insertion (K.O.) and stable over-expression lines of BdGamyb support the data obtained in transient expression assays. In addition, the BdGamyb homozygous T-DNA insertion (K.O.) lines have anther and pollen alterations and they do not produce viable seeds.

Aplicación web para la realización de experimentos astronómicos del proyecto GLORIA en la plataforma Facebook

La Ciencia Ciudadana nace del resultado de involucrar en las investigaciones científicas a todo tipo de personas, las cuales pueden participar en un determinado experimento analizando o recopilando datos. No hace falta que tengan una formación científica para poder participar, es decir cualquiera puede contribuir con su granito de arena. La ciencia ciudadana se ha convertido en un elemento a tener en cuenta a la hora de realizar tareas científicas que requieren mucha dedicación, o que simplemente por el volumen de trabajo que estas implican, resulta casi imposible que puedan ser realizadas por una sola persona o un pequeño grupo de trabajo. El proyecto GLORIA (GLObal Robotic-telescopes Intelligent Array) es la primera red de telescopios robóticos del mundo de acceso libre que permite a los usuarios participar en la investigación astronómica mediante la observación con telescopios robóticos, y/o analizando los datos que otros usuarios han adquirido con GLORIA, o desde otras bases de datos de libre acceso. Con el objetivo de contribuir a esta iniciativa se ha propuesto crear una plataforma web que pasará a formar parte del Proyecto GLORIA, en la que se puedan realizar experimentos astronómicos. Con el objetivo de fomentar la ciencia y el aprendizaje colaborativo se propone construir una aplicación web que se ejecute en la plataforma Facebook. Los experimentos los proporciona la red de telescopios del proyecto GLORIA mediante servicios web y están definidos mediante XML. La aplicación web recibe el XML con la descripción del experimento, lo interpreta y lo representa en la plataforma Facebook para que los usuarios potenciales puedan realizar los experimentos. Los resultados de los experimentos realizados se envían a una base de datos de libre acceso que será gestionada por el proyecto GLORIA, para su posterior análisis por parte de expertos. ---ABSTRACT---The citizen’s science is born out of the result of involving all type of people in scientific investigations, in which, they can participate in a determined experiment analyzing or compiling data. There is no need to have a scientific training in order to participate, but, anyone could contribute doing one’s bit. The citizen’s science has become an element to take into account when carrying out scientific tasks that require a lot dedication, or that, for the volume of work that these involve, are nearly impossible to be carried out by one person or a small working group. The GLORIA Project (Global Robotic-Telescopes Intelligent Array) is the first network of free access robotic telescopes in the world that permits the users to participate in the astronomic investigation by means of observation with robotic telescopes, and/or analyzing data from other users that have obtained through GLORIA, or from other free-access databases. With the aim of contributing to this initiative, a web platform has been created and will be part of the GLORIA Project, in which astronomic experiments can be carried out. With the objective of promoting science and collaborative apprenticeship, a web application carried out in the FACEBOOK platform is to be built. The experiments are founded by the telescopes network of the GLORIA project by means of web services and are defined through XML. The web application receives the XML with the description of the experiment, interprets it and represents it in the FACEBOOK platform in order for potential users may perform the experiments. The results of the experiments carried out are sent to a free-access database that will be managed by the GLORIA Project for its analysis on the part of experts.

Native bradyrhizobial symbionts of Lupinus mariae-josephae, a unique endemism thriving in alkaline soils in Eastern Spain

Lupinus mariae-josephae (Lmj) es una especie de lupino endémica de una pequeña y específica área de Comunidad Valenciana (Este de España), donde prospera en suelos alcalinoscalcáreos, un hábitat singular para los altramuces, que crecen preferentemente en suelos ácidos o neutros. Esto hace de Lmj una especie de lupino única. Cuando se inició este trabajo, la extensión conocida de este endemismo abarcaba unos 700 kilómetros cuadrados, confinados en la provincia de Valencia. En esta área, Lmj prospera en pequeñas poblaciones aisladas que contienen un número reducido de plantas por lo que se la consideró una especie en peligro de extinción. Todos los esfuerzos, utilizando estrategias clásicas dirigidas a ampliar el área de crecimiento de Lmj y garantizar su conservación, han tenido un éxito limitado. El trabajo que se presenta está dirigido a mejorar el conocimiento de la ecología de Lmj, en particular la interacción simbiótica que establece con bacterias del suelo denominadas rizobios y se centra en la caracterización fenotípica, filogenética y genómica de esos rizobios. También se investiga la posible contribución de la simbiosis en mejorar la conservación de Lmj. Para este fin, se han estudiado diferentes aspectos que se describen a continuación. El primero objetivo se centró en aislar y estudiar de la diversidad genética de las bacterias endosimbióticas de Lmj. . Se realizó un análisis filogenético de genes esenciales que mostró que las cepas de Lmj pertenecen al género Bradyrhizobium y que presentan una gran diversidad con características fenotípicas y simbióticas diferentes de cepas de Bradyrhizobium que nodulan otras especies de lupinos nativos de España (cepas ISLU). Las cepas estudiadas se dividieron en dos grupos (Clado I y Clado II). El Clado I, incluye a las cepas Lmj, definiendo un nuevo linaje, filogenéticamente relacionado con otras especies de Bradyrhizobium, como B. jicamae y B. elkanii. El Clado II contiene cepas ISLU relacionadas con cepas de B. canariense y B. japonicum que establecen simbiosis con lupinos de suelos ácidos. Otro análisis filogenético basado en genes simbióticos, distribuyó las cepas de Lmj en sólo dos grupos diferentes. La singularidad y gran diversidad de estas cepas en una pequeña área geográfica, hacen de este, un atractivo sistema para el estudio de la evolución y adaptación de las bacterias simbióticas a su respectiva planta huésped. Adicionalmente, se estudio la presencia de bacterias capaces de nodular Lmj en suelos básicos de Chiapas, México. Sorprendentemente, estos suelos contienen bacterias capaces establecer interacciones simbióticas eficientes con Lmj en ensayos de invernadero. A continuación se investigó la taxonomía de los endosimbiontes de Lmj analizando la secuencia de cuatro genes esenciales (16S rRNA, recA, glnII y atpD) y el promedio de identidad de nucleótidos de genomas completos de algunas cepas representativas de la diversidad (ANIm). Se identificaron nuevas especies de Bradyrhizobium dentro del Clado I y se definió una de ellas: 'Bradyrhizobium valentinum' sp. nov (cepa tipo LmjM3T = CECT 8364T, LMG 2761T). También se abordó cómo conservar Lmj en su hábitat natural mediante inoculación con alguna de las cepas aisladas. Se demostró la ausencia de bacterias capaces de nodular Lmj en suelos rojos alcalinos o ‘‘terra rossa’’ de la Península Ibérica y Baleares. Dos cepas, altamente eficientes en cuanto a la fijación de nitrógeno, LmjC y LmjM3T, fueron seleccionadas para ser empleadas como inoculantes. Dos experimentos de campo llevados a cabo en años consecutivos en áreas con características edafoclimáticas similares a las que presentan las poblaciones de Lmj, lograron la reproducción exitosa de la planta. Se concluyó que un ciclo reproductivo exitoso de Lmj es absolutamente dependiente de la inoculación con sus simbiontes naturales y que la simbiosis debe ser considerada un factor esencial en estrategias de conservación de leguminosas en peligro. La obtención de varias secuencias genómicas de cepas aisladas de Lmj y de otras cepas de Bradyrhizobium reveló una alta similitud entre los genomas de las cepas del Clado I, y permitió la identificación de cinco posibles nuevas especies. Además, se estudiaron tres agrupaciones de genes relacionados con la simbiosis (nod, nif y fix) definiendo un nuevo linaje para las cepas de Lmj, diferente del symbiovar “genistearum” de B. canariense y B. japonicum. La baja diversidad encontrada en el análisis filogenético de los genes simbióticos contrasta con la gran diversidad asociada a genes esenciales. La presencia de plásmidos en cepas del género Bradyrhizobium ha sido descrita en muy pocas ocasiones, sin embargo el análisis de la secuencia genómica de la cepa ISLU101, aislada de Lupinus angustifolius, reveló la presencia de un origen de replicación extracromosómico homólogo al operón repABC, presente en el plásmido de Bradyrhizobium sp BTAi1. Gracias a esta secuencia se identificaron genes homólogos en 19 de 72 cepas ISLU. Filogenéticamente, las secuencias de repABC se agruparon en un grupo monofilético con las de pBTAi1 y separadas de los rizobios de crecimiento rápido. Finalmente, se identificaron sistemas de secreción de proteínas de tipo III (T3SS) en nueve genomas de cepas de Lmj. Los T3SS pueden inyectar proteínas efectoras al interior de células vegetales. Su presencia en rizobios se ha relacionado con la gama de hospedador que pueden nodular y puede tener un efecto beneficioso, neutro o perjudicial en la simbiosis. Los T3SS de las cepas de Lmj codifican para una proteína efectora similar a NopE, un efector dependiente de T3SS descrito en B. diazoefficiens USDA 110T. La proteína NopE de la cepa LmjC se ha caracterizado bioquímicamente. ABSTRACT Lupinus mariae-josephae (Lmj) is a lupine species endemic of a unique small area in Valencia region (Eastern Spain) where the lupine plants thrive in alkaline-limed soils, which preferentially grow in acid or neutral soils. This is the type of soils native lupines of Spain. When this work was initiated, the extension of the endemic area of Lmj was of about 700 squared kilometers confined to the Valencia province. In this area, Lmj thrives in small, isolated patches containing a reduced number of plants, and points to an endemism that can easily became endangered or extinct. Consequently, the Valencia Community authorities gave a ‘‘microreserve” status for conservation of the species. All efforts, using classical strategies directed to extend the area of Lmj growth and ensure its conservation have been so far unsuccessful. The work presented here is directed to improve our knowledge of Lmj ecology and it is centered in the characterization of the rhizobial symbiosis by phenotypic, phylogenetic and genomic analysis as well as in investigate the potential contribution of the symbiosis to improve its conservation. To this end, five different topics have been studied, and results are briefly described here. Extensive details can be followed en the attached, published articles. The first topic deals with the indigenous rhizobial symbionts of the Lmj endemism, and its genetic diversity was investigated. The Lmj root symbionts belong to the Bradyrhizobium genus, and phylogenetic analysis based on core genes identified a large diversity of Bradyrhizobium strains with phenotypic and symbiotic characteristics different from rhizobia nodulating other Lupinus spp. native of Spain. The strains were split in two clades. Clade II contained strains close to classical B. canariense and B. japonicum lineages that establish symbioses with lupines in acid soils of the Mediterranean area. Clade I included Lmj strains that define a new lineage, close to other Bradyrhizobium species as B. jicamae and B. elkanii. The phylogenetic analysis based on symbiotic genes identified only two distinct clusters. The singularity and large diversity of these strains in such a small geographical area makes this an attractive system for studying the evolution and adaptation of the rhizobial symbiont to the plant host. Additionally, the presence of bacteria able to nodulate Lmj in basic soils from Chiapas, Mexico was investigated. Surprisingly, these soils contain bacteria able to effectively nodulate and fix nitrogen with Lmj plants in greenhouse assays. In the second topic, the taxonomic status of the endosymbiotic bacteria of Lmj from Valencia endemism and Chiapas was investigated. Results from phylogenetic analysis of core genes and Average Nucleotide Identity (ANIm) using draft genomic sequences identified new Bradyrhizobium species within strains of Clade I of Lmj endosymbiotic bacteria. Only one of these potentially new species has been defined, meanwhile the others are under process of characterization. The name ‘Bradyrhizobium valentinum’ sp. nov. was proposed for the defined species (type strain LmjM3T= CECT 8364T, LMG 2761T). The third topic was directed to conservation of endangered Lmj in its natural habitat. The relevant conclusion of this experimentation is that the symbiosis should be considered as a relevant factor in the conservation strategies for endangered legumes. First, we showed absence of bacteria able to nodulate Lmj in all the inspected ‘‘terra rossa’’ or alkaline red soils of the Iberian Peninsula and Balearic Islands. Then, two efficient nitrogen fixing strains with Lmj plants, LmjC and LmjM3T, were selected as inoculum for seed coating. Two planting experiments were carried out in consecutive years under natural conditions in areas with edapho-climatic characteristics identical to those sustaining natural Lmj populations, and successful reproduction of the plant was achieved. The relevant conclusion from these assays was that the successful reproductive cycle was absolutely dependent on seedling inoculation with effective bradyrhizobia The forth topic deep into the analysis of the genomic of Lmj representative strains. To this end, draft genomic sequences of selected Lmj strains and type strains of Bradyrhizobium spp. were assembled. The comparison analysis of the draft genomic sequences of Lmj strains and related Bradyrhizobium species grouped in Clade I, revealed a high genomic homology among them, and allowed the definition of five potentially new species of Lmj nodulating bacteria. Also, based on the available draft genomic sequences, only three clusters of nod, fix and nif genes from Lmj strains were identified and showed to define a new symbiotic lineage, distant from that of B. canariense and B. japonicum bv. genistearum. The low diversity exhibited by the phylogenetic analysis of symbiotic genes contrast with the large diversity of strains as regards the housekeeping genes analyzed. Besides, the genomic analysis of a Lupinus angustifolius strain ISLU101, revealed the presence of an extrachromosomal replication origin homologous to repABC cluster from plasmid present in Bradyrhizobium spp BTAi1. This repABC cluster gene sequence allowed the identification of extrachromosomic replication origin in 19 out of 72 Bradyrhizobium strains from Lupinus spp., a highly significant result since the absence of plasmids in the Bradyrhizobium genus was traditionally assumed. The repABC gene sequences of these strains grouped them in a unique monophyletic group, related to B. sp. BTAi1 plasmid, but differentiated from the repABC gene cluster of plasmids in fast growing rhizobium strains. The last topic was focused on characterization of type III secreted effectors present in Lmj endosymbiotic bacteria. Type III secretion systems (T3SS) are specialized protein export machineries which can deliver effector proteins into plant cells. The presence of T3SS in rhizobia has frequently been related to the symbiotic nodulation host-range and may have a beneficial or detrimental effect on the symbiosis with legumes. In this context, the presence of T3SS in genomes of nine Lmj strains was investigated, and it was shown the presence of clusters encoding NopE type III-secreted protein similar to the NopE1 and NopE2 of B. diazoefficiens USDA 110T. The putative NopE protein of LmjC strain is at present being characterized regarding its structure and function.

Functional response of Ulmus minor Mill. to drought, flooding and dutch elm disease

Ulmus minor es una especie arbórea originaria de Europa cuyas poblaciones han sido diezmadas por el hongo patógeno causante de la enfermedad de la grafiosis. La conservación de los olmos exige plantearse su propagación a través de plantaciones y conocer mejor su ecología y biología. Ulmus minor es un árbol de ribera, pero frecuentemente se encuentra alejado del cauce de arroyos y ríos, donde la capa freática sufre fuertes oscilaciones. Por ello, nuestra hipótesis general es que esta especie es moderadamente resistente tanto a la inundación como a la sequía. El principal objetivo de esta tesis doctoral es entender desde un punto de vista funcional la respuesta de U. minor a la inundación, la sequía y la infección por O. novo-ulmi; los factores que posiblemente más influyen en la distribución actual de U. minor. Con este objetivo se persigue dar continuidad a los esfuerzos de conservación de esta especie que desde hace años se dedican en varios centros de investigación a nivel mundial, ya que, entender mejor los mecanismos que contribuyen a la resistencia de U. minor ante la inoculación con O. novo-ulmi y factores de estrés abiótico ayudará en la selección y propagación de genotipos resistentes a la grafiosis. Se han planteado tres experimentos en este sentido. Primero, se ha comparado la tolerancia de brinzales de U. minor y U. laevis – otro olmo ibérico – a una inmersión controlada con el fin de evaluar su tolerancia a la inundación y comprender los mecanismos de aclimatación. Segundo, se ha comparado la tolerancia de brinzales de U. minor y Quercus ilex – una especie típica de ambientes Mediterránea secos – a la falta de agua en el suelo con el fin de evaluar el grado de tolerancia y los mecanismos de aclimatación a la sequía. El hecho de comparar dos especies contrastadas responde al interés en entender mejor cuales son los procesos que conducen a la muerte de una planta en condiciones de sequía – asunto sobre el que hay una interesante discusión desde hace algunos años. En tercer lugar, con el fin de entender mejor la resistencia de algunos genotipos de U. minor a la grafiosis, se han estudiado las diferencias fisiológicas y químicas constitutivas e inducidas por O. novo-ulmi entre clones de U. minor seleccionados a priori por su variable grado de resistencia a esta enfermedad. En el primer experimento se observó que los brinzales de U. minor sobrevivieron 60 días inmersos en una piscina con agua no estancada hasta una altura de 2-3 cm por encima del cuello de la raíz. A los 60 días, los brinzales de U. laevis se sacaron de la piscina y, a lo largo de las siguientes semanas, fueron capaces de recuperar las funciones fisiológicas que habían sido alteradas anteriormente. La conductividad hidráulica de las raíces y la tasa de asimilación de CO2 neta disminuyeron en ambas especies. Por el contrario, la tasa de respiración de hojas, tallos y raíces aumentó en las primeras semanas de la inundación, posiblemente en relación al aumento de energía necesario para desarrollar mecanismos de aclimatación a la inundación, como la hipertrofia de las lenticelas que se observó en ambas especies. Por ello, el desequilibrio del balance de carbono de la planta podría ser un factor relevante en la mortalidad de las plantas ante inundaciones prolongadas. Las plantas de U. minor (cultivadas en envases de 16 litros a media sombra) sobrevivieron por un prolongado periodo de tiempo en verano sin riego; la mitad de las plantas murieron tras 90 días sin riego. El cierre de los estomas y la pérdida de hojas contribuyeron a ralentizar las pérdidas de agua y tolerar la sequía en U. minor. Las obvias diferencias en tolerancia a la sequía con respecto a Q. ilex se reflejaron en la distinta capacidad para ralentizar la aparición del estrés hídrico tras dejar de regar y para transportar agua en condiciones de elevada tensión en el xilema. Más relevante es que las plantas con evidentes síntomas de decaimiento previo a su muerte exhibieron pérdidas de conductividad hidráulica en las raíces del 80% en ambas especies, mientras que las reservas de carbohidratos apenas variaron y lo hicieron de forma desigual en ambas especies. Árboles de U. minor de 5 y 6 años de edad (plantados en eras con riego mantenido) exhibieron una respuesta a la inoculación con O. novo-ulmi consistente con ensayos previos de resistencia. La conductividad hidráulica del tallo, el potencial hídrico foliar y la tasa de asimilación de CO2 neta disminuyeron significativamente en relación a árboles inoculados con agua, pero solo en los clones susceptibles. Este hecho enlaza con el perfil químico “más defensivo” de los clones resistentes, es decir, con los mayores niveles de suberina, ácidos grasos y compuestos fenólicos en estos clones que en los susceptibles. Ello podría restringir la propagación del hongo en el árbol y preservar el comportamiento fisiológico de los clones resistentes al inocularlos con el patógeno. Los datos indican una respuesta fisiológica común de U. minor a la inundación, la sequía y la infección por O. novo-ulmi: pérdida de conductividad hidráulica, estrés hídrico y pérdida de ganancia neta de carbono. Pese a ello, U. minor desarrolla varios mecanismos que le confieren una capacidad moderada para vivir en suelos temporalmente anegados o secos. Por otro lado, el perfil químico es un factor relevante en la resistencia de ciertos genotipos a la grafiosis. Futuros estudios deberían examinar como este perfil químico y la resistencia a la grafiosis se ven alteradas por el estrés abiótico. ABSTRACT Ulmus minor is a native European elm species whose populations have been decimated by the Dutch elm disease (DED). An active conservation of this species requires large-scale plantations and a better understanding of its biology and ecology. U. minor generally grows close to water channels. However, of the Iberian riparian tree species, U. minor is the one that spread farther away from rivers and streams. For these reasons, we hypothesize that this species is moderately tolerant to both flooding and drought stresses. The main aim of the present PhD thesis is to better understand the functional response of U. minor to the abiotic stresses – flooding and drought – and the biotic stress – DED – that can be most influential on its distribution. The overarching goal is to aid in the conservation of this emblematic species through a better understanding of the mechanisms that contribute to resistance to abiotic and biotic stresses; an information that can help in the selection of resistant genotypes and their expansion in large-scale plantations. To this end, three experiments were set up. First, we compared the tolerance to experimental immersion between seedlings of U. minor and U. laevis – another European riparian elm species – in order to assess their degree of tolerance and understand the mechanisms of acclimation to this stress. Second, we investigated the tolerance to drought of U. minor seedlings in comparison with Quercus ilex (an oak species typical of dry Mediterranean habitats). Besides assessing and understanding U. minor tolerance to drought at the seedling stage, the aim was to shed light into the functional alterations that trigger drought-induced plant mortality – a matter of controversy in the last years. Third, we studied constitutive and induced physiological and biochemical differences among clones of variable DED resistance, before and following inoculation with Ophiostoma novo-ulmi. The goal is to shed light into the factors of DED resistance that is evident in some genotypes of U. minor, but not others. Potted seedlings of U. minor survived for 60 days immersed in a pool with running water to approximately 2-3 cm above the stem collar. By this time, U. minor seedlings died, whereas U. laevis seedlings moved out of the pool were able to recover most physiological functions that had been altered by flooding. For example, root hydraulic conductivity and leaf photosynthetic CO2 uptake decreased in both species; while respiration initially increased with flooding in leaves, stems and roots possibly to respond to energy demands associated to mechanisms of acclimation to soil oxygen deficiency; as example, a remarkable hypertrophy of lenticels was soon observed in flooded seedlings of both species. Therefore, the inability to maintain a positive carbon balance somehow compromises seedling survival under flooding, earlier in U. minor than U. laevis, partly explaining their differential habitats. Potted seedlings of U. minor survived for a remarkable long time without irrigation – half of plants dying only after 90 days of no irrigation in conditions of high vapour pressure deficit typical of summer. Some mechanisms that contributed to tolerate drought were leaf shedding and stomata closure, which reduced water loss and the risk of xylem cavitation. Obviously, U. minor was less tolerant to drought than Q. ilex, differences in drought tolerance resulting mostly from the distinct capacity to postpone water stress and conduct water under high xylem tension among species. More relevant was that plants of both species exhibited similar symptoms of root hydraulic failure (i.e. approximately 80% loss of hydraulic conductivity), but a slight and variable depletion of non-structural carbohydrate reserves preceding dieback. Five- and six-year-old trees of U. minor (planted in the field with supplementary watering) belonging to clones of contrasted susceptibility to DED exhibited a different physiological response to inoculation with O. novo-ulmi. Stem hydraulic conductivity, leaf water potential and photosynthetic CO2 uptake decreased significantly relative to control trees inoculated with water only in DED susceptible clones. This is consistent with the “more defensive” chemical profile observed in resistant clones, i.e. with higher levels of saturated hydrocarbons (suberin and fatty acids) and phenolic compounds than in susceptible clones. These compounds could restrict the spread of O. novo-ulmi and contribute to preserving the near-normal physiological function of resistant trees when exposed to the pathogen. These results evidence common physiological responses of U. minor to flooding, drought and pathogen infection leading to xylem water disruption, leaf water stress and reduced net carbon gain. Still, seedlings of U. minor develop various mechanisms of acclimation to abiotic stresses that can play a role in surviving moderate periods of flood and drought. The chemical profile appears to be an important factor for the resistance of some genotypes of U. minor to DED. How abiotic stresses such as flooding and drought affect the capacity of resistant U. minor clones to face O. novo-ulmi is a key question that must be contemplated in future research.

Methods for the analysis of multi-scale cell dynamics from fluorescence microscopy images

La embriogénesis es el proceso mediante el cual una célula se convierte en un ser un vivo. A lo largo de diferentes etapas de desarrollo, la población de células va proliferando a la vez que el embrión va tomando forma y se configura. Esto es posible gracias a la acción de varios procesos genéticos, bioquímicos y mecánicos que interaccionan y se regulan entre ellos formando un sistema complejo que se organiza a diferentes escalas espaciales y temporales. Este proceso ocurre de manera robusta y reproducible, pero también con cierta variabilidad que permite la diversidad de individuos de una misma especie. La aparición de la microscopía de fluorescencia, posible gracias a proteínas fluorescentes que pueden ser adheridas a las cadenas de expresión de las células, y los avances en la física óptica de los microscopios han permitido observar este proceso de embriogénesis in-vivo y generar secuencias de imágenes tridimensionales de alta resolución espacio-temporal. Estas imágenes permiten el estudio de los procesos de desarrollo embrionario con técnicas de análisis de imagen y de datos, reconstruyendo dichos procesos para crear la representación de un embrión digital. Una de las más actuales problemáticas en este campo es entender los procesos mecánicos, de manera aislada y en interacción con otros factores como la expresión genética, para que el embrión se desarrolle. Debido a la complejidad de estos procesos, estos problemas se afrontan mediante diferentes técnicas y escalas específicas donde, a través de experimentos, pueden hacerse y confrontarse hipótesis, obteniendo conclusiones sobre el funcionamiento de los mecanismos estudiados. Esta tesis doctoral se ha enfocado sobre esta problemática intentando mejorar las metodologías del estado del arte y con un objetivo específico: estudiar patrones de deformación que emergen del movimiento organizado de las células durante diferentes estados del desarrollo del embrión, de manera global o en tejidos concretos. Estudios se han centrado en la mecánica en relación con procesos de señalización o interacciones a nivel celular o de tejido. En este trabajo, se propone un esquema para generalizar el estudio del movimiento y las interacciones mecánicas que se desprenden del mismo a diferentes escalas espaciales y temporales. Esto permitiría no sólo estudios locales, si no estudios sistemáticos de las escalas de interacción mecánica dentro de un embrión. Por tanto, el esquema propuesto obvia las causas de generación de movimiento (fuerzas) y se centra en la cuantificación de la cinemática (deformación y esfuerzos) a partir de imágenes de forma no invasiva. Hoy en día las dificultades experimentales y metodológicas y la complejidad de los sistemas biológicos impiden una descripción mecánica completa de manera sistemática. Sin embargo, patrones de deformación muestran el resultado de diferentes factores mecánicos en interacción con otros elementos dando lugar a una organización mecánica, necesaria para el desarrollo, que puede ser cuantificado a partir de la metodología propuesta en esta tesis. La metodología asume un medio continuo descrito de forma Lagrangiana (en función de las trayectorias de puntos materiales que se mueven en el sistema en lugar de puntos espaciales) de la dinámica del movimiento, estimado a partir de las imágenes mediante métodos de seguimiento de células o de técnicas de registro de imagen. Gracias a este esquema es posible describir la deformación instantánea y acumulada respecto a un estado inicial para cualquier dominio del embrión. La aplicación de esta metodología a imágenes 3D + t del pez zebra sirvió para desvelar estructuras mecánicas que tienden a estabilizarse a lo largo del tiempo en dicho embrión, y que se organizan a una escala semejante al del mapa de diferenciación celular y con indicios de correlación con patrones de expresión genética. También se aplicó la metodología al estudio del tejido amnioserosa de la Drosophila (mosca de la fruta) durante el cierre dorsal, obteniendo indicios de un acoplamiento entre escalas subcelulares, celulares y supracelulares, que genera patrones complejos en respuesta a la fuerza generada por los esqueletos de acto-myosina. En definitiva, esta tesis doctoral propone una estrategia novedosa de análisis de la dinámica celular multi-escala que permite cuantificar patrones de manera inmediata y que además ofrece una representación que reconstruye la evolución de los procesos como los ven las células, en lugar de como son observados desde el microscopio. Esta metodología por tanto permite nuevas formas de análisis y comparación de embriones y tejidos durante la embriogénesis a partir de imágenes in-vivo. ABSTRACT The embryogenesis is the process from which a single cell turns into a living organism. Through several stages of development, the cell population proliferates at the same time the embryo shapes and the organs develop gaining their functionality. This is possible through genetic, biochemical and mechanical factors that are involved in a complex interaction of processes organized in different levels and in different spatio-temporal scales. The embryogenesis, through this complexity, develops in a robust and reproducible way, but allowing variability that makes possible the diversity of living specimens. The advances in physics of microscopes and the appearance of fluorescent proteins that can be attached to expression chains, reporting about structural and functional elements of the cell, have enabled for the in-vivo observation of embryogenesis. The imaging process results in sequences of high spatio-temporal resolution 3D+time data of the embryogenesis as a digital representation of the embryos that can be further analyzed, provided new image processing and data analysis techniques are developed. One of the most relevant and challenging lines of research in the field is the quantification of the mechanical factors and processes involved in the shaping process of the embryo and their interactions with other embryogenesis factors such as genetics. Due to the complexity of the processes, studies have focused on specific problems and scales controlled in the experiments, posing and testing hypothesis to gain new biological insight. However, methodologies are often difficult to be exported to study other biological phenomena or specimens. This PhD Thesis is framed within this paradigm of research and tries to propose a systematic methodology to quantify the emergent deformation patterns from the motion estimated in in-vivo images of embryogenesis. Thanks to this strategy it would be possible to quantify not only local mechanisms, but to discover and characterize the scales of mechanical organization within the embryo. The framework focuses on the quantification of the motion kinematics (deformation and strains), neglecting the causes of the motion (forces), from images in a non-invasive way. Experimental and methodological challenges hamper the quantification of exerted forces and the mechanical properties of tissues. However, a descriptive framework of deformation patterns provides valuable insight about the organization and scales of the mechanical interactions, along the embryo development. Such a characterization would help to improve mechanical models and progressively understand the complexity of embryogenesis. This framework relies on a Lagrangian representation of the cell dynamics system based on the trajectories of points moving along the deformation. This approach of analysis enables the reconstruction of the mechanical patterning as experienced by the cells and tissues. Thus, we can build temporal profiles of deformation along stages of development, comprising both the instantaneous events and the cumulative deformation history. The application of this framework to 3D + time data of zebrafish embryogenesis allowed us to discover mechanical profiles that stabilized through time forming structures that organize in a scale comparable to the map of cell differentiation (fate map), and also suggesting correlation with genetic patterns. The framework was also applied to the analysis of the amnioserosa tissue in the drosophila’s dorsal closure, revealing that the oscillatory contraction triggered by the acto-myosin network organized complexly coupling different scales: local force generation foci, cellular morphology control mechanisms and tissue geometrical constraints. In summary, this PhD Thesis proposes a theoretical framework for the analysis of multi-scale cell dynamics that enables to quantify automatically mechanical patterns and also offers a new representation of the embryo dynamics as experienced by cells instead of how the microscope captures instantaneously the processes. Therefore, this framework enables for new strategies of quantitative analysis and comparison between embryos and tissues during embryogenesis from in-vivo images.