Processing Pipeline for Digitalizing the Lineage Tree of Early Zebrafish Embryogenesis from Multiharmonic Imaging

The reconstruction of the cell lineage tree of early zebrafish embryogenesis requires the use of in-vivo microscopy imaging and image processing strategies. Second (SHG) and third harmonic generation (THG) microscopy observations in unstained zebrafish embryos allows to detect cell divisions and cell membranes from 1-cell to 1K-cell stage. In this article, we present an ad-hoc image processing pipeline for cell tracking and cell membranes segmentation enabling the reconstruction of the early zebrafish cell lineage tree until the 1K-cell stage. This methodology has been used to obtain digital zebrafish embryos allowing to generate a quantitative description of early zebrafish embryogenesis with minute temporal accuracy and μm spatial resolution

Methodology for reconstructing early zebrafish development from in vivo multiphoton microscopy

Investigating cell dynamics during early zebrafish embryogenesis requires specific image acquisition and analysis strategies. Multiharmonic microscopy, i.e., second- and third-harmonic generations, allows imaging cell divisions and cell membranes in unstained zebrafish embryos from 1- to 1000-cell stage. This paper presents the design and implementation of a dedicated image processing pipeline (tracking and segmentation) for the reconstruction of cell dynamics during these developmental stages. This methodology allows the reconstruction of the cell lineage tree including division timings, spatial coordinates, and cell shape until the 1000-cell stage with minute temporal accuracy and micrometer spatial resolution. Data analysis of the digital embryos provides an extensive quantitative description of early zebrafish embryogenesis.

Desarrollo de un procedimiento para la observación y caracterización mecánica de células sobre sustratos opacos mediante microscopía de fuerzas atómicas : aplicación al estudio de linfocitos

Las células en los tejidos biológicos están continuamente sometidas a estímulos físicos tales como la presión hidrostática y esfuerzos de tracción, compresión o cortante, entre otros. La importancia de los estímulos mecánicos en el comportamiento de las células se ha reconocido recientemente al comprobarse cómo la naturaleza de estas fuerzas puede cambiar en patologías tales como las enfermedades vasculares o el cáncer. En respuesta a estos cambios, las células reaccionan modificando desde su forma o aspecto hasta su ciclo celular. Consecuentemente, el interés por el comportamiento mecánico de las células ha experimentado un auge creciente que ha requerido el desarrollo de varias técnicas de caracterización. En este contexto, se puede afirmar que una de las técnicas que ha irrumpido con más fuerza en esta nueva área, situada entre el mundo biológico y el físico, es la microscopía de fuerza atómica. En esta Tesis se ha abordado el estudio mediante microscopía de fuerza atómica de linfocitos de ratón que constituyen un linaje celular especialmente difícil de caracterizar mediante esta técnica por su tamaño y naturaleza no adherente. Los linfocitos, como actores fundamentales del sistema inmune, tienen gran importancia en la determinación de la respuesta que un organismo desencadena ante la presencia de un biomaterial. Bajo esta premisa, y como condición previa a la caracterización de los linfocitos, ha sido necesario el desarrollo de una metodología robusta y de amplia aplicabilidad que permita el estudio de células sobre biomateriales. Finalmente y con el objetivo de correlacionar el comportamiento mecánico de los linfocitos con alguna característica fisiológica relevante, se ha analizado la hipótesis de que el comportamiento mecánico pueda ser utilizado como marcador de la edad biológica. Consecuentemente se ha abordado el estudio del comportamiento mecánico de los linfocitos clasificados por grupos de edad, de manera que se han obtenido los primeros resultados que indican cómo puede manifestarse el proceso de inmunosenescencia -depresión del sistema inmune relacionada con el envejecimiento- en el comportamiento mecánico de las células del sistema inmune. Cells within tissues are continuously exposed to physical forces including hydrostatic pressure, shear stress, and compression and tension forces. The relevance of these mechanical stimuli has recently been recognised by different works in which significant changes were observed in these forces when they were measued in individuals affected by cardiovasvular diseases or cancer. Cells may alter their orientation, shape, internal constitution, contract, migrate, adhere, modify the synthesis and degradation of extracellular constituents, or even their life cycle in response to perturbations in their mechanical environment. As a consequence of this, the attention in cell mechanical behavior has undergone a significant thrust and novel techniques have been developed. In this context, atomic force microscopy has become a basic tool for the progress of this field. In this Thesis, the mechanical behavior of living murine T-lymphocytes was assessed by atomic force microscopy. Lymphocytes play a main role in the immune system of the individual and, consequently, in the immune response triggered by the presence of a biomaterial. The observation and characterization of the lymphocytes required the development of a robust experimental procedure that allowed overcoming the difficulties related to the analysis of this cell lineage, in particular their relatively large size and non-adherent character. These procedures could be easily transferred to other non-adherent cell lineages. Finally, to check the viability of developed method, we study the lymphocyte mechanical behavior as a function of the murine ageing. The obtained data represent a first step in the knowledge about how mechanical stimuli can affect the age-dependent decrease in immunological competence, i.e., the immunosenescence.