Silencing the gip gene of Phytophthora cinnamomi by iRNA and studying the subcellular localization of GIP and NPP1 proteins

Ink Disease is considered one of the most important causes of the decline of chestnut orchards. The break in yield of Castanea sativa Mill is caused by two species: Phytophthora cinnamomi and Phytophthora cambivora, being the first one the foremost pathogen of ink disease in Portugal. P. cinnamomi is one of the most aggressive and widespread plant pathogen with nearly 1,000 host species. This oomycete causes enormous economic losses and it is responsible for the decline of many plant species in Europe and worldwide. Up to now no efficient treatments are available to fight these pathogens. Because of the importance of chestnut at economical and ecological levels, especially in Portugal, it becomes essential to explore the molecular mechanisms that determine the interaction between Phytophthora species and host plants through the study of proteins GIP (glucanase inhibitor protein) and NPP1 (necrosis-inducing Phytophthora protein 1) produced by P. cinnamomi during the infection. The technique of RNA interference was used to knockdown the gip gene of P. cinnamomi. Transformants obtained with the silenced gene have been used to infect C. sativa, in order to determine the effect of gene silencing on the plant phenotype. To know more about the function of GIP and NPP1 involved in the mechanism of infection, the ORF’s of gip and npp1 genes have been cloned to the pTOR-eGFP vector for a future observation of P. cinnamomi transformants with fluorescent microscopy and determination of the subcellular localization. Moreover the prediction by bioinformatics tools indicates that both GIP and NPP1 proteins are secreted. The results allow to predict the secretory destination of both GIP and NPP1 proteins and confirm RNAi as a potential alternative biological tool in the control and management of P. cinnamomi. Keywords:

A doença de tinta do castanheiro é considerada uma das mais importantes causas do declínio dos soutos. A quebra da produção de Castanea sativa Mill é causada por duas espécies: Phytophthora cambivora e Phytophthora cinnamomi, sendo o principal causador da doença da tinta em Portugal. P.cinnamomi é um dos patógenos de plantas mais agressivo e generalizado, com cerca de 1.000 espécies de hospedeiros. Este oomiceta provoca enormes perdas económicas e é responsável pelo declínio de muitas espécies de plantas na Europa e no mundo. Até ao momento não se conhecem tratamentos eficazes para combater esses patógenos. Devido à importância do castanheiro a níveis económico e ecológico, especialmente em Portugal, é importante explorar os mecanismos moleculares que determinam a interação entre espécies de Phytophthora e plantas hospedeiras através do estudo das proteínas GIP (proteína inibidora de glucanases) e NPP1 (proteína indutora de necroses em Phytophthora) produzidos por P.cinnamomi durante a infeção. A técnica de RNA de interferência foi usada para o silenciamento do gene gip de P.cinnamomi. Os transformantes obtidos com o gene silenciado foram utilizados para infectar C. sativa, a fim de determinar o efeito de silenciamento de genes no fenótipo da planta. Para saber mais sobre a função de GIP e NPP1 no mecanismo da infeção, estes genes foram clonados no vector pTOR-eGFP para uma posterior observação de transformantes de P.cinnamomi com microscopia de fluorescência a fim de determinar a sua localização subcelular, apesar de, a previsão com ferramentas bioinformática indicarem que tanto GIP como NPP1 são proteínas secretadas para o meio extracelular. Os resultados permitem prever o destino celular de ambas as proteínas e confirmar a técnica de silenciamento de genes por iRNA como uma potencial ferramenta biológica alternativa no controle de P. cinnamomi.