Y-box binding protein 1 (YB-1) relevance in estrogen receptor-positive (ER+) breast cancer

Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2016

O cancro da mama é uma doença heterogénea determinada por várias características clínicas e patológicas, incluindo parâmetros histológicos e marcadores moleculares como o recetor de estrogénio (RE), recetor de progesterona (RP) e o recetor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2). A classificação de cancro da mama em três principais grupos com interesse clínico reflete essencialmente a classificação molecular: subtipo Luminal, Luminal A (RE+ e/ou RP+, HER2-, Ki67 baixo) e Luminal B (RE+ e/ou RP+, HER2+ ou Ki67 elevado); subtipo com sobre-expressão de HER2 (RE-, PR-, HER2+); e subtipo triplo negativo (RE-, RP- HER2-). Os tumores da mama positivos para o RE são os mais frequentes (cerca de 80%) e são os que apresentam melhor prognóstico. No entanto, cerca de 30% irão progredir com metastização à distância, resultando num aumento da taxa de mortalidade. O cancro da mama RE+ é dependente de estrogénios que ativam o RE, um factor de transcrição importante. Neste contexto, o gene YBX1, que codifica a proteína YB-1 (Y-box binding protein 1), foi recentemente identificado como parte de um preditor de mau prognóstico em cancro da mama dependente de RE. A proteína YB-1 parece estar envolvida em todos os hallmarks do cancro, sendo um indicador de mau prognóstico, recidiva, invasão e resistência a fármacos. Em cancro da mama, a proteína YB-1 encontra-se normalmente sobreexpressa, e tem sido associada com a progressão da doença e com a ausência de RE e RP. Devido à sua capacidade de ligação aos ácidos nucleicos, a proteína YB-1 é um regulador importante de transcrição e tradução de vários genes relacionados com o cancro, como ERBB2, cyclin A/B1, E2F, MDR1, MYC, PIK3CA, e também um componente principal das partículas de ribonucleoproteínas mensageiras, contribuindo assim para a sua estabilização e regulação de tradução. O papel funcional da proteína YB-1 parece ser dependente da sua localização celular, que é estreitamente regulada. Em condições fisiológicas normais a proteína é maioritariamente citoplasmática, embora possa também ser encontrada no núcleo. A translocação nuclear surge, geralmente, em resposta a um stress ou estímulo, e pode ocorrer por clivagem proteolítica ou fosforilação da proteína. A proteína YB-1 é fosforilada no resíduo de serina 102 localizada no cold shock domain, pela cinase p90 ribossomal S6 e pela cinase Akt serina/treonina. Recentemente, utilizando um modelo animal de xenotransplantes ortotópicos de cancro da mama RE+ vs. RE-, com modulação dos níveis de estradiol, o nosso grupo mostrou que o gene YBX1 se encontra sobrexpresso em tumores RE+ que cresceram na presença de 17β-Estradiol (E2), comparativamente a tumores RE+ que cresceram na ausência de E2. Assim, o objetivo deste projeto foi explorar a relevância biológica e clínica da regulação de YB-1 mediada pelo RE em cancro da mama. A nossa hipótese é que as terapias dirigidas ao RE possam afectar o gene YBX1, levando a uma diminuição da sua expressão e que a cessação da hormonoterapia possa desencadear um aumento da sua expressão e consequentemente da proliferação tumoral. Para testar a nossa hipótese usámos uma abordagem translacional, baseada em modelos celulares de cancro da mama e na análise de grupos clínicos relevantes de pacientes com cancro da mama. O estudo do efeito do E2 na expressão do gene YBX1 na linha celular de cancro da mama positiva para RE MCF-7, mostrou que a adição de E2 ao meio de cultura per se não é suficiente para alterar os níveis de expressão de YBX1. De facto, a análise de um painel de 124 genes regulados pelo RE revelou que a sua regulação in vitro difere substancialmente do que foi observado in vivo, o que indica que existirão outros fatores e/ou mecanismos envolvidos, quer sejam intrínsecos da célula ou derivados do hospedeiro, que poderão afetar a relação entre o RE e YBX1. O efeito do E2 nos níveis de YB-1 foi também avaliado ao nível da proteína por Western Blot e imunofluorescência, utilizando anticorpos específicos contra YB-1 total e a forma fosforilada no resíduo de serina 102 (p-YB-1). O estímulo com E2 induziu um aumento da p-YB-1 e da sua localização nuclear. Este efeito mostrou ser dependente do RE, uma vez que foi inibido pelo tamoxifeno e não foi observado na linha celular RE negativa MDA-MB-231. Assim, embora não tenha sido observado um efeito da ativação da via do RE pelo E2 na expressão do gene YBX1, foi detetado um aumento na fosforilação da proteína YB-1, o que sugere que no modelo in vitro, a expressão e atividade de YB-1 pode ser modulada pela via RE ao nível pós-transducional. No contexto clínico, o nosso principal objetivo consistiu em estabelecer uma possível correlação entre a expressão de YB-1 e o cancro da mama RE+. Deste modo, analisámos pela primeira vez a expressão de p-YB-1 em amostras cancro da mama, num conjunto de 60 amostras de tumor primário e 32 metástases emparelhadas. Observou-se uma associação entre níveis elevados de p-YB-1 e tumores RE e RP negativos (P=0,006 e P=0,037, respetivamente). Relativamente aos outcomes clínicos, a expressão de YB-1 e p-YB-1 correlacionou-se com uma diminuição da sobrevivência livre de recidiva (P=0.0442, HR 0.5514 95%CI 0.3088-0.9846 e P=0.0108, HR 0.058 95%CI 0.1230-0.7606 respetivamente), mas não com a sobrevivência global (P=0.2473, HR 0.6097 95%CI 0.3704-1.292 e P=0.0687, HR 0.4789 95%CI 0.2168-1.058). Desta forma, YB-1 e p-YB-1 são importantes biomarcadores de pior prognóstico, nomeadamente para risco de recidiva, especialmente em pacientes com tumores RE-, RP-. Em amostras de metástases, observou-se uma correlação positiva entre a expressão elevada de p-YB-1 e metástases RP negativas (P=0,030), sendo que a marcação de YB-1 não mostrou associação significativa com nenhum dos parâmeros clínicos. Verificámos ainda não existirem níveis diferentes de expressão de ambos os marcadores nos tumores primários e metástases, refletindo uma alteração durante a progressão tumoral (Teste McNemar: P=0.7728 e P=0.0771, respetivamente; Paired t-test: P=0.5754 e P=0.1883, respetivamente). Este estudo consiste n a primeira análise da expressão de YB-1 e p-YB-1 em tumores primários da mama e metástases emparelhadas. Visto que a deteção da proteína YB-1 em tecidos tumorais é um marcador de mau prognóstico, procurámos de seguida avaliar se a deteção de YB-1 no soro de doentes com cancro da mama poderia ser igualmente significante. A deteção de níveis séricos de proteínas é uma técnica minimamente invasiva e de fácil aplicação. Para esta análise foi utilizado um grupo de amostras de soro disponível de doentes com cancro da mama e metástases ósseas. Foi detetada a presença de YB-1 no soro de 22 doentes, correlacionada com a presença de metástases extra-ósseas (P=0.044). A análise multivariada mostrou que os doentes com YB-1 no soro apresentaram uma progressão da doença óssea mais rápida (HR 3.29, 95% CI 1.13 – 9.60, P=0.029), no entanto sem diferenças ao nível da sobrevivência global (HR 2.04, 95% CI 0.86 – 4.87, P=0.108). Este estudo corresponde à primeira análise dos níveis séricos de YB-1 em doentes com cancro da mama. Em suma, os resultados obtidos neste projeto mostram que não só a proteína YB-1, mas também p-YB-1 e YB-1 secretada têm valor de prognóstico em doentes com cancro da mama, reforçando a sua utilidade clínica como fator de prognóstico e possível alvo terapêutico. Este estudo mostrou ainda a regulação in vitro e in vivo de YBX1 não é exclusivamente dependente da presença de E2. No geral, este estudo gerou dados significativos e colocou questões importantes que serão abordadas em projetos futuros.

Estrogen receptor-positive (ER+) tumors are the most frequent breast cancers (BC), and have the better prognosis. Nevertheless, about 30% of patients with ER+ BC will develop distant metastases, with increased mortality rates. ER+ BC is dependent on estrogens that activate ER, an important transcription factor. In this context YBX1, which encodes for Y-box binding protein 1 (YB-1), was recently identified as part of an ER-dependent poor prognosis predictor for ER+ BC. YB-1 is an oncoprotein overexpressed in BC, where it has been associated with disease progression and ER/PR negativity. Recently, using an orthotopic mouse model of ER+ vs. ER- BC, our group showed that YBX1 is overexpressed in ER+ tumors growing under the presence of 17β-Estradiol (E2). Therefore, this project aimed to establish a biological and clinical link between ER and YB-1 expression in BC. Using BC cell lines, we showed that E2 per se did not altered YB-1 expression, at the mRNA or protein level, but induced its phosphorylation. These results need further investigation to address the mechanism behind YB-1/ER connection we observe in the in vivo model. Next, we explored the prognostic value of p-YB-1 expression and secreted YB-1 in the clinical setting. We demonstrated that p-YB-1 is a biomarker of decreased distant metastases-free survival and overall survival, and that secreted YB-1 correlates with faster bone disease progression in patients with BC and bone metastases. In conclusion, the results obtained in this project demonstrate that not only YB-1 but also p-YB-1 and secreted YB-1 have prognostic value in BC patients, reinforcing its clinical utility as prognostic factor and putative target. We also showed that the in vitro and in vivo regulation of YBX1 is not exclusively dependent on the presence of E2. Overall, this work generated significant data and raised important questions to be addressed in future projects.