Phosphorylation of the carboxy-terminal domain of histone H1: effects on secondary structure and DNA condensation

Linker histone H1 plays an important role in chromatin folding. Phosphorylation by cyclin-dependent kinases is the main post-translational modification of histone H1. We studied the effects of phosphorylation on the secondary structure of the DNA-bound H1 carboxy-terminal domain (CTD), which contains most of the phosphorylation sites of the molecule. The effects of phosphorylation on the secondary structure of the DNA-bound CTD were site-specific and depended on the number of phosphate groups. Full phosphorylation significantly increased the proportion of -structure and decreased that of -helix. Partial phosphorylation increased the amount of undefined structure and decreased that of -helix without a significant increase in -structure. Phosphorylation had a moderate effect on the affinity of the CTD for the DNA, which was proportional to the number of phosphate groups. Partial phosphorylation drastically reduced the aggregation of DNA fragments by the CTD, but full phosphorylation restored to a large extent the aggregation capacity of the unphosphorylated domain. These results support the involvement of H1 hyperphosphorylation in metaphase chromatin condensation and of H1 partial phosphorylation in interphase chromatin relaxation. More generally, our results suggest that the effects of phosphorylation are mediated by specific structural changes and are not simply a consequence of the net charge.

Apoptosis and cell-cycle regulatory proteins in colorectal carcinoma: relationship to tumour stage and patient survival

The quantitative assessment of apoptotic index (AI) and mitotic index (MI) and the immunoreactivity of p53, bcl-2, p21, and mdm2 were examined in tumour and adjacent normal tissue samples from 30 patients with colonic and 22 with rectal adenocarcinoma. Individual features and combined profiles were correlated with clinicopathological parameters and patient survival data to assess their prognostic value. Increased AI was significantly associated with increased bcl-2 expression (p

Cell cycle sensing of oxidative stress in saccharomyces cerevisiae by oxidation of a specific cysteine residue in the transcription factor Swi6p

Yeast cells begin to bud and enter S phase when growth conditions are favourable during G1 phase. When subjected to some oxidative stresses, cells delay entry at G1 allowing repair of cellular damage. Hence, oxidative stress sensing is coordinated with the regulation of cell cycle. We identified a novel function of the cell-cycle regulator of Saccharomyces cerevisiae, Swi6p, as a redox sensor through its cysteine residue at position 404. When alanine was substituted at this position, the resultant mutant, C404A, was sensitive to several reactive oxygen species and oxidants including linoleic acid hydroperoxide, the superoxide anion and diamide. This mutant lost the ability to arrest in G1 phase upon treatment with lipid hydroperoxide. The Cys404 residue of Swi6p in wild-type cells was oxidised to a sulfenic acid when cells were subjected to linoleic acid hydroperoxide. Mutation of Cys404 to Ala abolished the down-regulation of expression of the G1 cyclin genes CLN1, CLN2, PCL1 and PCL2 that occurred when cells of the wild type were exposed to the lipid hydroperoxide. In conclusion, oxidative stress signaling for cell-cycle regulation occurs through oxidation of the G1/S-speicific transcription factor Swi6p and consequently leads to suppression of the expression of G1-cyclins and delay in cells entering the cell cycle.

Immune escape durch Überexpression von HER-2/neu

In Tumoren und Onkogen-transformierten Zellen finden sich häufig Defizienzen in der Expression von Komponenten der MHC Klasse I-Antigenprozessierung, die mit einer verminderten MHC Klasse I-Oberflächenexpression und einer reduzierten Sensitivität der Zellen gegenüber einer ZTL-vermittelten Lyse gekoppelt sein können. Da in den meisten Fällen die reduzierten Expressionsmuster über Zytokine revertiert werden können, werden verschiedene Regulationsmechanismen als Ursache für die Defizienzen postuliert. Auch in Zellen, die den „human epidermal growth factor receptor 2“ (HER-2/neu) überexprimieren, wurden derartige „Immune escape“-Mechanismen identifiziert. Aufgrund der Amplifikation und/oder Überexpression dieses Onkogens in Tumoren, die mit einer schnellen Progression der Erkrankung und einer schlechten Heilungsprognose assoziiert ist, wurden zahlreiche Therapien entwickelt, die auf einer Mobilisierung des Immunsystems gegenüber HER-2/neu oder dessen Blockade durch spezifische Antikörper abzielen. Die bisher jedoch nur unzureichenden Erfolge dieser Therapien könnten ihre Ursache in einer verminderten Immunogenität der HER-2/neu+-Zellen aufgrund von Defizienzen in der MHC Klasse I-Antigenprozessierung haben, weshalb die Untersuchung der molekularen Ursachen dieser Suppression für die Therapie von HER-2/neu+-Tumoren von besonderer Bedeutung ist. In dieser Arbeit wurde anhand eines in vitro-Systems ein HER-2/neu-vermittelter „Immune escape“-Phänotyp charakterisiert und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen untersucht. Hierzu wurden murine, HER-2/neu--NIH3T3-Zellen mit HER-2/neu-transfizierten NIH3T3-Zellen verglichen. Die Untersuchung zeigte, dass die Oberflächenexpression von MHC Klasse I-Antigenen bei einer HER-2/neu-Überexpression vermindert ist. Dies ist assoziiert mit reduzierten Expressionen von LMP2, LMP10, PA28a, PA28b, ERAAP, TAP1, TAP2, und Tapasin, einem blockiertem TAP-Transport und einer fehlenden Sensitivität gegenüber einer ZTL-vermittelten Lyse. Da die analysierten Defekte durch eine Stimulation mit IFN‑g wieder revertiert werden können, wird eine transkriptionelle oder translationelle Regulation der betroffenen Gene durch HER-2/neu postuliert. Aufgrund dieser Ergebnisse ist eine T-Zell-vermittelte Therapie von HER-2/neu+-Tumoren als kritisch anzusehen. Die Untersuchung der Promotoren von TAP1/LMP2, TAP2 und Tapasin ergab geringere und durch IFN‑g-induzierbare Promotoraktivitäten in den HER-2/neu+-Zellen im Vergleich zu den HER-2/neu—-Zellen. Mittels Mutagenese-PCR und Gelretardationsanalysen konnte die Bindung eines Komplexes an zwei E2F- und einer P300-Bindungsstelle im Tapasin-Promotor identifiziert werden, die für die HER-2/neu-vermittelte Hemmung der Tapasin-Promotor­aktivität essentiell ist. Eine Inaktivierung der E2F- und P300-Motve in den TAP1/LMP2- und TAP2-Promotoren hatte dagegen keinen Einfluss auf die HER-2/neu-vermittelte Blockade der Promotoraktivität. Ein Vergleich der Promotoraktivitäten der HER-2/neu+- mit Ras-transformierten Zellen ergab, dass die TAP1/LMP2- und TAP2-Promotoren in beiden Zellen supprimiert werden, während der Tapasin-Promotor bei Ras-Transformation nicht beein­trächtigt ist. Der Einsatz von Inhibitoren zeigte, dass die Suppression des Tapasin-Promotors vermutlich über die PLC-g-PKC-Kaskade erfolgt. Dagegen konnte mit Inhibitoren gegen MAPK und PI3Kinase kein vergleichbarer Effekt erzielt werden. Aufgrund dieser Daten wird postuliert, dass HER-2/neu über die Signalkaskade PLC-g–PKC–E2F/P300 die Tapasin-Promotoraktivität supprimiert, wohingegen noch bisher unbekannte Signalkaskaden von HER-2/neu und Ras zu einer Hemmung der TAP1/LMP2- und TAP2-Promotoraktivität führen. Da die Komplexbildung von E2F und P300 auch im Zellzyklus eine Rolle spielt, wird eine negative Korrelation zwischen Zell-Proliferation und MHC Klasse I-Antigenpräsentation postuliert, die Gegenstand künftiger Studien sein wird.

Comprehensive Identification of Cell Cycle–regulated Genes of the Yeast Saccharomyces cerevisiae by Microarray HybridizationD⃞

We sought to create a comprehensive catalog of yeast genes whose transcript levels vary periodically within the cell cycle. To this end, we used DNA microarrays and samples from yeast cultures synchronized by three independent methods: α factor arrest, elutriation, and arrest of a cdc15 temperature-sensitive mutant. Using periodicity and correlation algorithms, we identified 800 genes that meet an objective minimum criterion for cell cycle regulation. In separate experiments, designed to examine the effects of inducing either the G1 cyclin Cln3p or the B-type cyclin Clb2p, we found that the mRNA levels of more than half of these 800 genes respond to one or both of these cyclins. Furthermore, we analyzed our set of cell cycle–regulated genes for known and new promoter elements and show that several known elements (or variations thereof) contain information predictive of cell cycle regulation. A full description and complete data sets are available at http://cellcycle-www.stanford.edu