Antigen-dependent induction of a CD40 signal in peripheral B cells

Monoclonal antibodies have emerged as one of the most promising therapeutics in oncology over the last decades. The generation of fully human tumorantigen-specific antibodies suitable for anti-tumor therapy is laborious and difficult to achieve. Autoreactive B cells expressing those antibodies are detectable in cancer patients and represent a suitable source for human antibodies. However, the isolation and cultivation of this cell type is challenging. A novel method was established to identify antigen-specific B cells. The method is based on the conversion of the antigen independent CD40 signal into an antigen-specific one. For that, the artificial fusion proteins ABCos1 and ABCos2 (Antigen-specific B cell co-stimulator) were generated, which consist of an extracellular association-domain derived from the constant region of the human immunoglobulin (Ig) G1, a transmembrane fragment and an intracellular signal transducer domain derived of the cytoplasmic domain of the human CD40 receptor. By the association with endogenous Ig molecules the heterodimeric complex allows the antigen-specific stimulation of both the BCR and CD40. In this work the ability of the ABCos constructs to associate with endogenous IgG molecules was shown. Moreover, crosslinking of ABCos stimulates the activation of NF-κB in HEK293-lucNifty and induces proliferation in B cells. The stimulation of ABCos in transfected B cells results in an activation pattern different from that induced by the conventional CD40 signal. ABCos activated B cells show a mainly IgG isotype specific activation of memory B cells and are characterized by high proliferation and the differentiation into plasma cells. To validate the approach a model system was conducted: B cells were transfected with IVT-RNA encoding for anti-Plac1 B cell receptor (antigen-specific BCR), ABCos or both. The stimulation with the BCR specific Plac1 peptide induces proliferation only in the cotransfected B cell population. Moreover, we tested the method in human IgG+ memory B cells from CMV infected blood donors, in which the stimulation of ABCos transfected B cells with a CMV peptide induces antigen-specific expansion. These findings show that challenging ABCos transfected B cells with a specific antigen results in the activation and expansion of antigen-specific B cells and not only allows the identification but also cultivation of these B cells. The described method will help to identify antigen-specific B cells and can be used to characterize (tumor) autoantigen-specific B cells and allows the generation of fully human antibodies that can be used as diagnostic tool as well as in cancer therapy.

An interferon regulatory factor element controls the major immune modulator of murine cytomegalovirus

Immune modulation by herpesviruses, such as cytomegalovirus, is critical for the establishment of acute and persistent infection confronting a vigorous antiviral immune response of the host. Therefore, the action of immune-modulatory proteins has long been the subject of research, with the final goal to identify new strategies for antiviral therapy.rnIn the case of murine cytomegalovirus (mCMV), the viral m152 protein has been identified to play a major role in targeting components of both the innate and the adaptive immune system in terms of infected host-cell recognition in the effector phase of the antiviral immune response. On the one hand, it inhibits cell surface expression of RAE-1 and thereby prevents ligation of the activating natural killer (NK)-cell receptor NKG2D. On the other hand, it decreases cell surface expression of peptide-loaded MHC class I molecules thereby preventing antigen presentation to CD8 T cells. Ultimately, the outcome of CMV infection is determined by the interplay between viral and cellular factors.rnIn this context, the work presented here has revealed a novel and intriguing connection between viral m152 and cellular interferon (IFN), a key cytokine of the immune system: rnthe m152 promoter region contains an interferon regulatory factor element (IRFE) perfectly matching the consensus sequence of cellular IRFEs.rnThe biological relevance of this regulatory element was first suggested by sequence comparisons revealing its evolutionary conservation among various established laboratory strains of mCMV and more recent low-passage wild-derived virus isolates. Moreover, search of the mCMV genome revealed only three IRFE sites in the complete sequence. Importantly, the functionality of the IRFE in the m152 promoter was confirmed with the use of a mutant virus, representing a functional deletion of the IRFE, and its corresponding revertant virus. In particular, m152 gene expression was found to be inhibited in an IRFE-dependent manner in infected cells. Essentially, this inhibition proved to have a severe impact on the immune-modulatory function of m152, first demonstrated by a restored direct antigen presentation on infected cells for CD8 T-cell activation. Even more importantly, this effect of IRFE-mediated IFN signaling was validated in vivo by showing that the protective antiviral capacity of adoptively-transferred, antigen-specific CD8 T cells is also significantly restored by the IRFE-dependent inhibition of m152. Somewhat curious and surprising, the decrease in m152 protein simultaneously prevented an enhanced activation of NK cells in acute-infected mice, apparently independent of the RAE-1/NKG2D ligand/receptor interaction but rather due to reduced ‘missing-self’ recognition.rnTaken together, this work presents a so far unknown mechanism of IFN signaling to control mCMV immune modulation in acute infection.rnrn

Zur Rolle der Antigendosis in IgE-vermittelten Immunantworten und der allergischen Atemwegsentzündung

Die Verabreichung von hohen Antigendosen im Rahmen der allergenspezifischen Immuntherapie (SIT) resultiert in der Induktion einer allergenspezifischen Toleranz in sensibilisierten Patienten. Vorangegangene Studien der Klinischen Forschergruppe Allergie identifizierten CD4-CD8- doppelt-negative T-Zellen (dnTZ), welche nach wiederholter intraperitonealer Injektion von hohen Dosen (HD) des an das Adjuvans Aluminiumhydroxid adsorbierten Antigens Keyhole Limpet Hemocyanin in Mäusen induziert wurden, als potente Suppressorzellen für die IgE-Produktion. Mäuse, die hingegen mit niedrigen Dosen (LD) desselben Antigens behandelt wurden, entwickelten eine starke, persistierende IgE-Immunantwort. rnIm Fokus meiner Doktorarbeit stand die phänotypische Charakterisierung der dnTZ aus HD-Mäusen sowie die Aufklärung möglicher inhibitorischer Wirkmechanismen. In Erweiterung der bisherigen Arbeiten und in Anlehnung an die klinische Praxis bei der Durchführung der SIT habe ich bei meinen Untersuchungen die subkutane Injektion ohne Adjuvans als alternative Applikationsroute verwendet. In meinen Studien konnte ich durch die zusätzliche Verwendung des klinisch relevanten Allergens Ovalbumin die Allgemeingültigkeit des Konzepts der antigendosisabhängigen Regulation der IgE- Produktion durch dnTZ verifizieren. Die Vakzinierung mit hohen Antigendosen verhinderte die Ausbildung einer IgE-Produktion in antigenspezifischer Weise. HD- Mäuse wiesen in vitro eine geringere Aktivierung von TH2-Zellen als LD-Mäuse auf. Im Mausmodell der allergischen Atemwegsentzündung wiesen HD-Mäuse eine reduzierte Atemwegsreaktivität sowie eine geringere pulmonale TH2-Zytokin- produktion auf. rnIch konnte zudem tendenziell eine leicht erhöhte Anzahl von dnTZ in HD-Mäusen messen. Die in HD-Mäusen induzierten dnTZ habe ich durchflusszytometrisch charakterisiert, konnte jedoch keinen eindeutigen Marker für suppressive dnTZ identifizieren. In einem adoptiven Transferexperiment war eine T-Zellpopulation von HD-Mäusen aus der γδ-T-Zell-Rezeptor-tragende T-Zellen depletiert worden waren, ähnlich wie die Ausgangs-T-Zellpopulation in der Lage die IgE-Produktion in den Rezipienten zu inhibieren, was darauf schließen lässt, dass die untersuchten regulatorischen dnTZ einen αβ-T-Zell-Rezeptor exprimieren. rn

Regulation der Funktion dendritischer Zellen im immunologischen steady state

Dendritische Zellen sind professionelle Antigenpräsentierende Zellen und übernehmen sowohl in der Aktivierung naiver T-Zellen als auch in der Aufrechterhaltung peripherer Toleranz eine zentrale Funktion. Ruhende Dendritische Zellen im immunologischen Steady State induzieren antigenspezifisch Toleranz in autoreaktiven T-Zellen, welche bei der negativen Selektion im Thymus nicht eliminiert wurden und verhindern somit die Entstehung von Autoimmunität. Mit Hilfe eines transgenen Maus Modells, welches die induzierbare Expression transgen kodierter CD8+ T-Zell-Epitope auf ruhenden Dendritischen Zellen erlaubt, konnten wir zeigen, dass die periphere Toleranz Induktion durch Dendritische Zellen in Abwesenheit von regulatorischen T-Zellen beeinträchtigt ist. Wir konnten verdeutlichen, dass für die Suppression von steady-state Dendritischen Zellen die Erkennung von MHC Klasse II Molekülen auf Dendritischen Zellen durch den T-Zell-Rezeptor regulatorischer T-Zellen zwingend erforderlich ist. In Abwesenheit dieser suppressiven Interaktion hatten Dendritische Zellen einen aktivierten Phänotyp und lösten eine funktionale T-Zell-Antwort aus, anstatt periphere Toleranz zu induzieren. Als Folge dessen entwickelten Mäuse, in denen Dendritische Zellen nicht antigenspezifisch mit suppressiven CD4+ T-Zellen interagieren konnten, spontane Autoimmunität, welche durch CD8+ T-Zellen mediiert wurde. Wir konnten weiterhin zeigen, dass der Verlust peripherer T-Zell Toleranz durch basale Level an Typ I Interferonen mediiert wird sowie durch CD40 Signale, welche von adaptiven Immunzellen geliefert werden.

Untersuchungen der Aktivierungs- und Effektorwege von T-Helferzellen in der Pathogenese vaskulärer inflammatorischer Prozesse

T-Zellen sind an der Induktion und Erhaltung chronischer Entzündungen maßgeblich beteiligt. Im Bereich kardiovaskulärer Erkrankungen konnte eine Beteiligung von T-Zellen an der Entstehung von Ateriosklerose, Bluthochdruck und arterieller Thrombose aufgezeigt werden. Allerdings sind sowohl die Mechanismen ihrer Aktivierung, als auch die für die Entstehung und Persistenz vaskulärer Entzündung relevanten Effektorfunktionen weitgehend unbekannt. rnIn der vorliegenden Arbeit konnte erstmals in zwei Mausmodellen gezeigt werden, dass sowohl die dem Bluthochdruck zugrundeliegende Entzündung der Arterienwände als auch die durch venöse Thrombose ausgelöste Entzündung der Venenwand zu einer selektiven Einwanderung von CD4+ und CD8+ T-Zellen mit einem Effektor-Gedächtniszell-Phänotyp führt. Mit Hilfe von Nur77-GFP-transgenen Mäusen konnte gezeigt werden, dass die in die entzündeten Gefäßwände eingewanderten T-Zellen lokal T-Zell-Rezeptor-unabhängig aktiviert werden.rnBluthochdruck und venöse Thrombose sind durch eine verstärkte Expression eines ähnlichen Musters an Zytokinen und Chemokinen in den Gefäßwänden begleitet, das in rekombinanter Form in einem Teil der Effektor-T-Gedächtniszellen die Bildung von IFN-γ auslöst. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse weisen erstmals eine Beteiligung von T-Zellen an der Entzündung der Venenwand im Rahmen einer venösen Thrombose nach. Des Weiteren konnten erstmals Hinweise darauf gefunden werden, dass T-Zellen Gefäßentzündungen durch eine Zytokin-induzierte IFN-γ-Bildung erhalten und verstärken.rn

Safety and therapeutic efficacy of adoptive p53-specific T cell antigen receptor (TCR) gene transfer

Immunotherapy with T cells genetically modified by retroviral transfer of tumor-associated antigen (TAA)-specific T cell receptors (TCR) is a promising approach in targeting cancer. Therefore, using a universal TAA to target different tumor entities by only one therapeutic approach was the main criteria for our TAA-specific TCR. Here, an optimized (opt) αβ-chain p53(264-272)-specific and an opt single chain (sc) p53(264-272)-specific TCR were designed, to reduce mispairing reactions of endogenous and introduced TCR α and TCR β-chains, which might lead to off-target autoimmune reactions, similar to Graft-versus-host disease (GvHD). rnIn this study we evaluated the safety issues, which rise by the risk of p53TCR gene transfer-associated on/off-target toxicities as well as the anti-tumor response in vivo in a syngeneic HLA-A*0201 transgenic mouse model. We could successfully demonstrate that opt sc p53-specific TCR-redirected T cells prevent TCR mispairing-mediated lethal off-target autoimmunity in contrast to the parental opt αβ-chain p53-specific TCR. Since the sc p53-specific TCR proofed to be safe, all further studies were performed using sc p53-specific TCR redirected T cells only. Infusion of p53-specific TCR-redirected T cells in Human p53 knock-in (Hupki) mice after lymphodepletion-preconditioning regimen with either sublethal body irradiation (5Gy) or chemotherapy (fludarabine and cyclophosphamide) in combination with vaccination (anti-CD40, CpG1668 and p53(257-282) peptide) did not result in a depletion of hematopoietic cells. Moreover, adoptive transfer of high numbers of p53-specific TCR-redirected T cells in combination with Interleukin 2 (IL-2) also did not lead to toxic on-target reactions. The absence of host tissue damage was confirmed by histology and flow cytometry analysis. Furthermore, p53-specific TCR-redirected T cells were able to lyse p53+A2.1+ tumor cells in vitro. However, in vivo studies revealed the potent suppressive effect of the tumor microenvironment (TME) mediated by tumor-infiltrating myeloid-derived suppressor cells (MDSC). Accordingly, we could improve an insufficient anti-tumor response in vivo after injection of the sc p53-specific TCR-redirected T cells by additional depletion of immunosuppressive cells of the myeloid lineage.rnTogether, these data suggest that the optimized sc p53(264-272)-specific TCR may represent a safe and efficient approach for TCR-based gene therapy. However, combinations of immunotherapeutic strategies are needed to enhance the efficacy of adoptive cell therapy (ACT)-mediated anti-tumor responses.

Untersuchung der DNA-Reparatur in humanen Lymphozyten

Oxidative DNA-Schäden, wie 7,8-Dihydro-8-oxoguanin (8-oxoG), werden kontinuierlich in allen Zellen durch endogene und exogene Noxen gebildet. Ohne eine effektive Reparatur können DNA-Schäden nach erfolgter Replikation als Mutationen fixiert werden und somit die Kanzerogenese initiieren.rnUntersuchungsgegenstand dieser Arbeit war die Reparatur, vorrangig von oxidativen DNA-Schäden, in humanen Lymphozyten. Dabei sollte ebenfalls überprüft werden, inwiefern eine Aktivierung dieser Immunzellen, die u.a. zu einer Initiierung der Proliferation führt, modulierend auf die DNA-Reparatur wirkt. Für diese Untersuchungen wurden primäre Lymphozyten aus Buffy Coats isoliert. Eine Aktivierung von T Lymphozyten, welche physiologisch Antigen-vermittelt über den T-Zell-Rezeptor verläuft, wurde durch eine ex vivo Stimulation mit Phytohämagglutinin (PHA) nachgeahmt. Die Induktion oxidativer DNA-Basenmodifikationen erfolgte mit Hilfe des Photosensibilisators Acridinorange in Kombination mit sichtbarem Licht. Das Schadensausmaß sowie die Reparatur wurden mittels der Alkalischen Elution unter Nutzung der Reparaturendonuklease Fpg bestimmt.rnDie Ergebnisse zeigten, dass global keine Reparatur induzierter oxidativer DNA-Schäden in primären Lymphozyten stattfindet. Eine Aktivierung der Lymphozyten mittels PHA führte hingegen zu einer deutlichen Reduktion der induzierten DNA-Schäden innerhalb einer 24-stündigen Reparaturzeit. Diese verbesserte Reparatur konnte auf eine Steigerung der Transkription und somit eine erhöhte Proteinmenge von OGG1, welches die Reparatur von 8-oxoG DNA-Glykosylase initiiert, zurückgeführt werden. Weiterführende mechanistische Untersuchungen deuten darauf hin, dass der transkriptionellen Regulation von OGG1 eine Aktivierung der JNK-Signalkaskade zugrunde liegt. Als ein verantwortlicher Transkriptionsfaktor konnte NF-YA identifiziert werden. Dessen erhöhte Bindung am OGG1-Promotor in Folge einer PHA-Stimulation konnte durch eine JNK-Hemmung reduziert werden.rnDie Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass eine Aktivierung von Lymphozyten, welche die Proliferation initiiert und dadurch mit dem Risiko für die Entstehung von Mutationen und malignen Entartungen verknüpft ist, gleichzeitig eine transkriptionelle Hochregulation von OGG1 bewirkt, die die Reparatur oxidativer DNA-Schäden sicherstellt. Die Fähigkeit zur Steigerung der DNA-Reparatur unter den gezeigten Bedingungen bietet den proliferierenden Zellen einen Schutzmechanismus zur Erhaltung ihrer genomischen Stabilität.rn

Development of a highly potent bispecific antibody format targeting the novel tumor-specific antigen CLDN18.2

Due to multiple immune evasion mechanisms of cancer cells, novel therapy approaches are required to overcome the limitations of existing immunotherapies. Bispecific antibodies are potent anti-cancer drugs, which redirect effector T cells for specific tumor cell lysis, thus enabling the patient’s immune system to fight cancer cells. The antibody format used in this proof of concept study–bispecific ideal monoclonal antibodies termed BiMAB–is a tailor-made recombinant protein, which consists of two fused scFv antibodies recognizing different antigens. Both are arranged in tandem on a single peptide chain and the individual variable binding domains are separated by special non-immunogenic linkers. The format is comprised of a scFv targeting CLDN18.2–a gastric cancer tumor associated antigen (TAA) –while the second specificity binds the CD3 epsilon (CD3ε) subunit of the T cell receptor (TCR) on T cells. For the first time, we compared in our IMAB362-based BiMAB setting, four different anti-CD3-scFvs, respectively derived from the mAbs TR66, CLB-T3, as well as the humanized and the murine variant of UCHT1. In addition, we investigated the impact of an N- versus a C-terminal location of the IMAB362-derived scFv and the anti-CD3-scFvs. Thus, nine CLDN18.2 specific BiMAB proteins were generated, of which all showed a remarkably high cytotoxicity towards CLDN18.2-positive tumor cells. Because of its promising effectiveness, 1BiMAB emerged as the BiMAB prototype. The selectivity of 1BiMAB for its TAA and CD3ε, with affinities in the nanomolar range, has been confirmed by in vitro assays. Its dual binding depends on the design of an N-terminally positioned IMAB362 scFv and the consecutive C-terminally positioned TR66 scFv. 1BiMAB provoked a concentration and target cell dependent T cell activation, proliferation, and upregulation of the cytolytic protein Granzyme B, as well as the consequent elimination of target cells. Our results demonstrate that 1BiMAB is able to activate T cells independent of elements that are usually involved in the T cell recognition program, like antigen presentation, MHC restriction, and co-stimulatory effector molecules. In the first in vivo studies using a subcutaneous xenogeneic tumor mouse model in immune incompetent NSG mice, we could prove a significant therapeutic effect of 1BiMAB with partial or complete tumor elimination. The initial in vitro RIBOMAB experiments correspondingly showed encouraging results. The electroporation of 1BiMAB IVT-RNA into target or effector cells was feasible, while the functionality of translated 1BiMAB was proven by induced T cell activation and target cell lysis. Accordingly, we could show that the in vitro RIBOMAB approach was applicable for all nine BiMABs, which proves the RIBOMAB concept. Thus, the CLDN18.2-BiMAB strategy offers great potential for the treatment of cancer. In the future, administered either as protein or as IVT-RNA, the BiMAB format will contribute towards finding solutions to raise and sustain tumor-specific cellular responses elicited by engaged and activated endogenous T cells. This will potentially enable us to overcome immune evasion mechanisms of tumor cells, consequently supporting current solid gastric cancer therapies.

Generierung und Transduktion wachstumsnegativer Signale durch den Contactinhibin-Rezeptor

Generierung und Transduktion wachstumsnegativer Signale durch den Contactinhibin-RezeptorDie kontaktabhängige Wachstumshemmung, Kontaktinhibition, basierend auf der Interaktion von Contactinhibin (Ci) und seinem Rezeptor (CiR), reguliert das Zellwachstum. Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung der Signalweiterleitung über den CiR.Der transformierende Wachstumsfaktor TGF-beta führt in den meisten Zelltypen wie die Kontaktinhibition zum Zellzyklusstopp in der G1-Phase. Um mögliche Interaktionen der beiden Signalkaskaden zu untersuchen, wurden humane Keratinozyten (HaCaT) mit einem dominant-negativen TGF-beta-Rezeptor Typ II stabil transfiziert. Das Ausschalten des TGF-beta-Signalweges resultierte in einer erhöhten Sättigungsdichte und Aufhebung der Kontaktinhibition. Die durch Kontaktinhibition induzierte Zunahme der Expression der TGF-beta-mRNA bestätigte die mögliche Interaktion der beiden Signalwege.In einem weiteren Ansatz sollte die Proteinkinase C (PKC) als möglicher Second Messenger der Kontaktinhibition untersucht werden. Die Herunterregulierung der PKC-Isoformen alpha, delta, epsilon und mu nach Langzeit-Behandlung mit 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetat führte in humanen Fibroblasten (FH109) zu einer Reduktion der Kontaktinhibition. Nur durch Inkubation mit dem spezifischen Inhibitor der delta-Isoform Rottlerin konnte die Kontaktinhibition vollständig aufgehoben werden. Eine Beteiligung der PKC-delta in die Kontaktinhibition wurde dadurch bestätigt, daß sowohl die Stärke ihrer Proteinexpression als auch ihre intrazelluläre Verteilung über Zell-Zellkontakte reguliert wurde. Außerdem führte die transiente Transfektion von Maus-Fibroblasten, NIH3T3, mit einer dominant-negativen Mutante der PKC-delta zu einem transformierten Phänotyp.

Das Interleukin-1Beta-Rezeptor-Homolog im Modifizierten Vakziniavirus Ankara (MVA) - Charakterisierung und möglicher Einfluss auf MVA-basierte Impfvektoren

MVA ist ein attenuiertes Vakziniavirus, das durch wiederholte Passagierung von Chorioallantoisvirus Ankara auf Hühnerembryofibroblasten gewonnen wurde. Es ist bis auf wenige Ausnahmen nicht mehr in der Lage, in Säugerzellen zu replizieren, zeigt aber dennoch eine vollständige virale Proteinexpression und induziert nach Immunisierung eine zu VACV vergleichbare Immunantwort. Aus diesem Grund wurde es bereits als Impfstoff gegen die menschliche Pockenerkrankung eingesetzt, ohne hierbei die bei den klassischen Impfviren beobachtbaren Nebenwirkungen hervorzurufen. Das Genom von MVA enthält jedoch noch Immunmodulatoren, deren Deletion Ansatzpunkt für die weitere Verbesserung des Impfstoffes sein kann. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine Deletionsmutante untersucht, bei der das Gen für den Interleukin-1β Rezeptor (IL-1βR) deletiert ist (MVA ΔIL-1βR). Es konnte nachgewiesen werden, dass der IL-1βR in murinen als auch in humanen Zellen exprimiertes IL-1β bindet und somit inaktiviert. Des Weiteren wurde gefunden, dass MVA in der Lage ist, IL-1β in antigenpräsentierenden Zellen zu induzieren, welches aber durch die Neutralisierung aufgrund des IL-1βR nur transient nachzuweisen war. Im Gegensatz dazu induzierte MVA ΔIL-1βR eine anhaltende und um ein Vielfaches erhöhte Sekretion an IL-1β. Untersuchungen in antigenpräsentierenden Zellen aus knock-out Mäusen, die verschiedene Defizienzen in den Signalwegen zur IL-1β-Induktion trugen, zeigten, dass die Sekretion von IL-1β von Caspase-1 abhängig war, welches wahrscheinlich aus der vorgeschalteten Aktivierung der NLRP3- und/oder AIM2-Inflammasomen resultierte. Interessanterweise wurden auch Caspase-1 unabhängige Mechanismen beobachtet, die auf eine Inflammasom-unabhängige IL-1β-Induktion hinweisen könnten. In Bezug auf die Immunaktivierung führte die vermehrte Sekretion von IL-1β durch MVA ΔIL-1βR vermutlich zu einer verbesserten Antigenpräsentation, die die nachfolgende T-Zellantwort beeinflusste. In Übereinstimmung mit bereits veröffentlichten Daten wurde nach Immunisierung mit MVA ΔIL-1βR eine effektivere Gedächtnis-T-Zellantwort festgestellt, deren Charakteristika und zu Grunde liegenden Mechanismen hier untersucht wurden. Jedoch konnten weder Unterschiede in weiteren pro-inflammatorischen Zytokinmustern noch im Verlauf insbesondere der CD8+ T-Zell-Aktivierung und -erhaltung zwischen MVA und MVA ΔIL-1βR beobachtet werden. Als mögliche weitere Ursache für die veränderte Gedächtnis-T-Zellantwort könnte daher eine vermehrte Stimulation durch antigenpräsentierende Zellen und eine IL-21-vermittelte bessere Unterstützungsfunktion der CD8+ Gedächtnis-T-Zellen durch CD4+ T-Zellen in Frage kommen. Zusammenfassend konnten hier neue molekulare Mechanismen, die zur Induktion von IL-1β nach einer MVA-Infektion führen, aufgedeckt werden. Darüber hinaus existieren bereits erste Hinweise auf einen Vorteil der Deletion des IL-1βR für MVA-basierte Vektorimpfstoffe. Die vorliegende Arbeit hat weitere Daten erhoben, die das Erzielen verbesserter Immunantworten nach Immunisierung mit MVA ΔIL-1βR unterstützen, woraus sich neue Ansätze für die Entwicklung MVA-basierter Impfstoffe ergeben könnten.

Untersuchung von T-Zell-vermittelten Immunantworten in der murinen und humanen kutanen Leishmaniasis

Für die Ausheilung von L. major-Infektionen ist eine effektive Th1-/Tc1-Antwort unerlässlich. Dennoch sind bis heute nicht alle Mechanismen der schützenden Immunabwehr beim Menschen und in der Maus endgültig geklärt. Deshalb bestand das Ziel der vorliegenden Arbeit darin, Th1-/Tc1-Antworten und damit die Schnittstelle zwischen angeborenem und adaptivem Immunsystem eingehender zu untersuchen. Für diesen Ansatz wurde zunächst der Einfluss des genetischen Hintergrundes auf den Verlauf der Infektion anhand von BALB/c- und C57BL/6-Zellen analysiert. Als entscheidender Faktor für Heilung und Suszeptibilität wurde mit Hilfe von Knochenmarkschimären die Herkunft der T und/oder B Zellen identifiziert. Erst die Aktivierung durch Th1-/Tc1-Zellen versetzt L. major-infizierte Makrophagen in die Lage, die intrazellulären Parasiten abzutöten. In diesem Aktivierungsprozess spielt die TNF-induzierte Signalweiterleitung über den TNF-Rezeptor 1 (TNF-R1) eine wichtige Rolle. TNF-R1 ist mit dem Signalmolekül FAN assoziiert. In dieser Arbeit konnte anhand von Mäusen, denen FAN fehlt, die Involvierung dieses Moleküls in der Induktion eines Th1-Zytokinsprofils und in der Kontrolle der Parasitenzahl sowie der lokalen Begrenzung der Infektion gezeigt werden. Weiterhin wurde unter Verwendung immundefizienter Mäuse die Realisierbarkeit eines PBMC-Transfermodells geprüft. Ein solches wird zur Validierung an Mäusen gewonnener Erkenntnisse und als präklinisches Testsystem der humanen kutanen Leishmaniasis dringend benötigt. In allen getesteten Stämmen ließ sich durch den Transfer humaner PBMC die L. major-Infektion beeinflussen. Humane CD4+ und CD8+ T-Zellen waren an den Infektionsstellen präsent und es konnten antigenspezifische Immunreaktionen nnachgewiesen werden. Das PBMC-Transfermodell konnte durch die Transplantation humaner Haut auf immundefiziente Mäuse zusätzlich entscheidend verbessert werden. In diesen Transplantaten ließen sich L. major-Infektionen etablieren und durch zusätzlichen Transfer von PBMC die Zahl humaner CD45+ Zellen an der Infektionsstelle deutlich steigern. In ihrer Gesamtheit trägt die vorliegende Arbeit wesentlich zum Verständnis der Determinanten von Heilung und Suszeptibilität der kutanen Leishmaniasis bei und zeigt neue Ansatzpunkte für eine Beeinflussung des Krankheitsverlaufes auf. Die Etablierung eines präklinischen Testmodells der humanen Leishmaniasis ist entscheidend, um das Wissen über die murine Leishmaniasis auf die humane Erkrankung zu übertragen. So kann dem dauerhaften Problem der Entwicklung von Vakzinen an Mäusen, die keine Wirksamkeit gegen die humane Erkrankung zeigen, begegnet werden. Ein vollständig etabliertes Modell wird es ermöglichen, der humanen Erkrankung zugrundeliegende Mechanismen zu untersuchen und Patienten-spezifisch aber auch allgemeingültig Vakzinierungs-Ansätze und Therapien unter experimentellen Bedingungen zu testen.

Synthese und Evaluierung von (Radio)Liganden für den Free Fatty Acid Rezeptor 1

Der Free Fatty Acid Receptor 1 (FFAR1) ist ein G-Protein gekoppelter Rezeptor, welcher neben einer hohen Expression im Gehirn auch eine verstärkte Expressionsrate auf den β-Zellen des Pankreas aufweist. Diese Expressionsmuster machen ihn zu einem idealen Target für die Visualisierung der sogenannten β-Zell-Masse mittels molekularer bildgebender Verfahren wie der PET. Eine Entwicklung geeigneter Radiotracer für die β-Zell-Bildgebung würde sowohl für die Diagnostik als auch für die Therapie von Typ-1- und Typ-2-Diabetes ein wertvolles Hilfsmittel darstellen.rnAufbauend auf einem von Sasaki et al. publiziertem Agonisten mit einem vielversprechendem EC50-Wert von 5,7 nM wurden dieser Agonist und zwei weitere darauf basierende 19F-substituierte Moleküle als Referenzverbindungen synthetisiert (DZ 1-3). Für die 18F-Markierung der Moleküle DZ 2 und DZ 3 wurden die entsprechenden Markierungsvorläufer (MV 1-3) synthetisiert und anschließend die Reaktionsparameter hinsichtlich Temperatur, Lösungsmittel, Basensystem und Reaktionszeit für die nukleophile n.c.a. 18F-Fluorierung optimiert. Die abschließende Entschützung zum fertigen Radiotracer wurde mit NaOH-Lösung durchgeführt und die Tracer injektionsfertig in isotonischer NaCl-Lösung mit radiochemischen Ausbeuten von 26,9 % ([18F]DZ 2) und 39 % ([18F]DZ 3) erhalten.rnZusätzlich wurde ein Chelator zur 68Ga-Markierung an den Liganden gekoppelt (Verb. 46) und die Markierungsparameter optimiert. Nach erfolgter Markierung mit 95 % radiochemischer Ausbeute, wurde der Tracer abgetrennt und in vitro Stabilitätsstudien durchgeführt. Diese zeigten eine Stabilität von mehr als 90 % über 120 min in sowohl humanem Serum (37 °C) als auch isotonischer NaCl-Lösung.rnMit einem ebenfalls synthetisierten fluoreszenzmarkierten Derivat des Liganden (Verb. 43) wurden erste LSM-Bilder an sowohl Langerhansschen Inseln als auch FFAR1-tragenden RIN-M Zellen durchgeführt, welche einen vielversprechenden Uptake des neuen Liganden in die Zellen zeigen. Weitere Untersuchungen und biologische Evaluierungen stehen noch aus. Mit den Referenzsubstanzen wurden zusätzlich Vitalitätsstudien an Langerhansschen Inseln durchgeführt, um einen negativen toxischen Einfluss auszuschließen.rn

Otimização Energética do Sistema de Refrigeração da máquina de impregnar ZELL

Esta dissertação teve como objetivo fundamental a otimização energética do sistema de refrigeração da máquina de impregnar tela ZELL e, como objetivo adicional, a avaliação da qualidade da água do circuito, justificada pela acentuada degradação dos rolos devido à corrosão provocada pela recirculação da água de arrefecimento. Inicialmente fez-se o levantamento de informações do processo produtivo para caracterizar o funcionamento do sistema de refrigeração, tendo-se selecionado duas telas de poliéster designadas neste estudo por P1 e P2 e, também, uma tela de nylon designada por N. Foram efetuados ensaios, um para cada tela, para a atual temperatura de setpoint da água à saída da torre de arrefecimento (30ºC). Realizou-se outro ensaio para a tela N mas com uma temperatura de setpoint de 37ºC, ao qual se chamou N37. Deste modo, determinou-se as potências térmicas removidas pela água de refrigeração e as potências térmicas perdidas por radiação e por convecção, tendo-se verificado que na generalidade dos rolos as referências P1 e P2 apresentam valores mais elevados. Em termos percentuais, a potência térmica removida pela água de refrigeração nos grupos tratores 1 e 3 e no conjunto de rolos de R1 a R29 corresponde a 48%, 10% e 70%, respetivamente. Com a avaliação às necessidades de arrefecimento da máquina ZELL, confirmou-se que os caudais atuais de refrigeração dos rolos garantem condições, mais que suficientes, de funcionamento dos rolamentos. Assim sendo, fez-se uma análise no sentido da diminuição do caudal total que passou de 10,25 L/s para 7,65 L/s. Considerando esta redução, determinou-se o caudal de ar húmido a ser introduzido na torre de arrefecimento. O valor determinado foi de 4,6 m3ar húmido/s, o que corresponde a uma redução de cerca de 32% em relação ao caudal atual que é de 6,8 m3ar húmido/s. Com os resultados das análises efetuadas à água do circuito de refrigeração, concluiu-se que a água de reposição e a água de recirculação possuem má qualidade para uso na generalidade dos sistemas de refrigeração, principalmente devido aos elevados valores de concentração de ferro e condutividade elétrica, responsáveis pela intensificação da corrosão no interior dos rolos.

Échec et mat : drame en cinq actes, en prose. [suivi de] Mam'zell' Rose : vaudeville en un acte. Livr. 153 / par MM. Octave Feuillet et Paul Bocage ; par MM. Decourcelle et E. Bercioux

Collection : Théâtre contemporain illustré ; 153e et 154e livraisons

Échec et mat : drame en cinq actes, en prose. [suivi de] Mam'zell' Rose : vaudeville en un acte. Livr. 154 / par MM. Octave Feuillet et Paul Bocage ; par MM. Decourcelle et E. Bercioux

Collection : Théâtre contemporain illustré ; 153e et 154e livraisons