Efeito dos ácidos etilmalônico e metilsucínico sobre alguns parâmetros do sistema glutamatérgico e de estresse oxidativo em cérebro de ratos

A deficiência da enzima desidrogenase de acil-CoA de cadeia curta (SCAD) é um erro inato do metabolismo potencialmente letal que afeta o último ciclo da oxidação de ácidos graxos. O bloqueio da rota na conversão de n-butiril-CoA a acetil-CoA resultante da deficiência enzimática leva ao acúmulo tecidual e aumento da concentração nos líquidos biológicos predominantemente dos ácidos etilmalônico e metilsucínico. Os pacientes afetados apresentam episódios de acidose metabólica intermitente, hiperamonemia, coma e acidose neonatal com hiperreflexia, miopatia por depósito de lipídios e hipotonia. Os sinais e sintomas dessa doença são variáveis, podendo aparecer em qualquer idade, do nascimento à vida adulta, e em combinações variáveis, freqüentemente levando a episódios ameaçadores à vida de descompensação metabólica depois de um período de ingesta inadequada de calorias e/ou doença intercorrente. Tendo em vista que a patogênese do dano cerebral na deficiência da SCAD é pouco conhecida, no presente estudo investigamos a ação dos ácidos etilmalônico e metilsucínico sobre alguns parâmetros envolvendo o sistema glutamatérgico e a produção de estresse oxidativo em cérebro de ratos jovens. Observamos inicialmente que o ácido etilmalônico promoveu uma diminuição significativa na captação de L-[3H]glutamato por fatias de córtex nas concentrações de 0,01, 0,1 e 1,0 mM. Já nas técnicas relacionadas à união de L-[3H]glutamato em membranas sinápticas plasmáticas, o ácido provocou uma diminuição da ligação de L-[3H]glutamato às membranas na ausência de sódio em todas as concentrações testadas (0,01 – 1,0 mM) e, quando em presença de sódio, houve diminuição da união somente na concentração de 1,0 mM do ácido. Por outro lado, não foi verificado qualquer efeito desse ácido sobre a captação vesicular de L-[3H]glutamato nas concentrações utilizadas. O ácido metilsucínico comportou-se de forma semelhante ao ácido etilmalônico nos parâmetros de captação de L-[3H]glutamato por fatias e união de L-[3H]glutamato em membranas sinápticas plasmáticas. Houve uma diminuição da captação de glutamato por fatias de córtex cerebral, uma diminuição da união de L-[3H]glutamato na ausência de sódio em todas as concentrações e, na presença de sódio, uma diminuição da captação apenas na concentração de 1,0 mM. Por outro lado, distintamente do que ocorreu com o ácido etilmalônico, na captação vesicular observamos uma diminuição da captação em todas as concentrações testadas. Nossos resultados demonstram, desta forma, alterações importantes no sistema glutamatérgico pelos ácidos acumulados na deficiência da desidrogenase de acil-CoA de cadeia curta. A etapa seguinte foi investigar o efeito dos ácidos etilmalônico e metilsucínico sobre parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos jovens: medida do potencial antioxidante total (TRAP), medida das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) e medida de quimiluminescência. Foi verificado que os dois ácidos não afetam a lipoperoxidação, medida através do TBA-RS e quimiluminescência e tampouco as defesas antioxidantes não-enzimáticas, medidas através do TRAP. Embora não tenhamos medido o efeito dos ácidos sobre as defesas enzimáticas antioxidantes representadas pelas enzimas superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase, os resultados dos parâmetros analisados no presente trabalho sugerem que os ácidos acumulados na deficiência da SCAD não produzem estresse oxidativo.

Efeito in vitro dos ácidos glutárico e 3-hidroxiglutárico sobre alguns parâmetros do sistema glutamatérgico em córtex cerebral de ratos e em astrócitos cultivados de córtex de ratos

A acidemia glutárica tipo I (AG I) é um erro inato do metabolismo de herança autossômica recessiva que se caracteriza bioquimicamente pela deficiência da atividade da enzima glutaril-CoA desidrogenase da rota de degradação dos aminoácidos lisina, hidroxilisina e triptofânio. O bloqueio da rota na conversão de glutaril-CoA à crotonil-CoA e resultante da deficiência enzimática leva ao acúmulo tecidual e aumento da concentração nos líquidos biológicos predominantemente dos ácidos glutárico e 3-hidroxiglutárico e, em alguns casos, do ácido glutacônico. Os pacientes afetados apresentam sintomas neurológicos especialmente após crises encefalopáticas, comuns no primeiro ano de vida, em que ocorre necrose bilateral dos gânglios da base, degeneração do globo pálido e da substância branca. Tendo em vista que a patogênese do dano cerebral na AG I é pouco conhecida e que as lesões do SNC dos pacientes muito se assemelham às lesões devido à excitotoxicidade, no presente estudo investigamos a ação dos ácidos glutárico e 3-hidroxiglutárico sobre alguns parâmetros neuroquímicos envolvendo o sistema glutamatérgico em córtex cerebral e astrócitos cultivados de córtex cerebral de ratos. Alguns desses parâmetros já haviam sido testados previamente com o ácido glutárico. Observamos que o ácido 3-hidroxiglutárico, em concentrações de 10 µM a 1 mM, não alterou a captação de L-[3H]glutamato por preparações sinaptossomais. Verificamos também que os ácidos glutárico e 3- hidroxiglutárico, nas mesmas concentrações, não alteraram a liberação do L- [3H]glutamato por estas estruturas em condições basais ou estimuladas (despolarizadas) por potássio (20 mM e 40 mM). Já nos ensaios de união do L- [3H] glutamato a membranas plasmáticas, o ácido 3-hidroxiglutárico inibiu a união do neurotransmissor em meio de incubação sem sódio e cloreto (sítios receptores), quando em baixas concentrações (1 µM a 100 µM), enquanto não alterou esta união em altas concentrações (500 µM a 2 mM). Na presença de alto sódio (sítios transportadores), ambos os ácidos inibiram a união de L- [3H]glutamato em todas as concentrações testadas (10 µM a 1 mM). Outros experimentos demonstraram que o ácido 3-hidroxiglutárico não alterou a captação vesicular de L-[3H]glutamato. Avaliamos também a influência dos ácidos glutárico e 3-hidroxiglutárico sobre a captação de L-[3H]glutamato por astrócitos cultivados de córtex cerebral. Inicialmente verificamos a viabilidade destas células na presença dos ácidos pelo teste do MTT que reflete a atividade das desidrogenases mitocondriais e também pela liberação de lactato desidrogenase para o meio de incubação. Na concentração de 1 mM , os ácidos glutárico e 3- hidroxiglutárico não se mostraram citotóxicos para estas células. Por outro lado, quando incubados por 60 minutos, nas concentrações de 50 µM e 1mM, aumentaram significativamente a captação de L-[3H]glutamato pelos astrócitos.

Neurotoxicidade do metotrexato : utilização da proteína S100B como um marcador e estudo do envolvimento do sistema glutamatérgico

O metotrexato (MTX) é um antagonista do ácido fólico amplamente utilizado no tratamento de doenças neoplásicas e não neoplásicas. Entretanto, o uso terapêutico desse fármaco pode levar à neurotoxicidade que pode se manifestar na forma aguda, subaguda e crônica, abrangendo os seguintes sintomas: cefaléia, sonolência, confusão, edema cerebral, convulsões, encefalopatia, coma e prejuízo das funções cognitivas. Os achados neuropatológicos consistem de astrogliose reativa, desmielinização, dano axonal e necrose da substância branca. Em nível celular, o MTX parece afetar primeira e seletivamente os astrócitos, quando comparados com os neurônios.O exato mecanismo neurotóxico do MTX continua não esclarecido, e parece ser multifatorial. Visando ampliar os conhecimentos a respeito dos efeitos do MTX no SNC, foram desenvolvidos dois trabalhos com diferentes modelos em animais, nos quais foram estudados os possíveis mecanismos de ação tóxica desse fármaco, como também propomos a utilização do marcador bioquímico S100B na detecção de injúrias cerebrais associadas ao tratamento. A partir dos resultados obtidos nos experimentos de captação de glutamato in vitro, verificamos que o MTX interfere na remoção do glutamato da fenda sináptica, podendo levar à excitotoxicidade. Também, o aumento da proteína S100B auxilia no entendimento dos mecanismos de ação do MTX, pois sugere que os astrócitos estão respondendo a um insulto na tentativa de neuroproteção Além disso, a S100B, aliada a outros marcadores neuroquímicos e técnicas de diagnóstico por imagem, seria muito importante no monitoramento terapêutico, pois poderia detectar alterações celulares sutis e ajudaria a prevenir a neurotoxicidade pelo MTX. Os resultados que obtivemos nos experimentos de convulsões induzidas pelo MTX demonstraram a participação do sistema glutamatérgico na neurotoxicidade desse fármaco. Especificamente, evidenciamos o envolvimento dos receptores inotrópicos glutamatérgicos na patogênese das convulsões. Porém, neste modelo experimental, a captação de glutamato possivelmente diminuiu em decorrência das manifestações das convulsões e não por uma ação direta, ou indireta, do MTX. O entendimento dos mecanismos de ação é muito importante para a clínica médica, pois permite que novas ferramentas sejam criadas no intuito de prevenir os danos tóxicos induzidos por fármacos. Assim, mais estudos devem ser realizados para tentar desvendar os mecanismos de neurotoxicidade do MTX, como também para estudar potenciais marcadores bioquímicos de injúria cerebral que auxiliem no monitoramento terapêutico.

Efeito do ácido glutárico sobre parâmetros do sistema glutamatérgico em cérebro de ratos ao longo do desenvolvimento

A acidemia glutárica do tipo I (AG I) é um erro inato do metabolismo causado pela deficiência da glutaril-CoA desidrogenase (GCDH), uma enzima responsável pelo catabolismo da lisina, hidroxilisina e triptofano. A deficiência da atividade da GCDH leva ao acúmulo nos fluidos corporais e no cérebro predominantemente de ácido glutárico (AG) e em menor grau do ácido 3- hidroxiglutárico e do ácido glutacônico. Clinicamente, os pacientes apresentam macrocefalia ao nascimento e uma hipomielinização ou desmielinização progressiva do córtex cerebral. Crises de descompensação metabólica ocorrem usualmente entre 6 e 24 meses de vida, resultando numa destruição irreversível de regiões cerebrais suscetíveis, em particular o estriado, e subseqüentemente alterações severas dos movimentos, como distonia e discinesia. Apesar dos sintomas neurológicos severos e alterações neuropatológicas cerebrais importantes (atrofia cerebral), os mecanismos que levam ao dano cerebral na AG I são pouco conhecidos. No presente estudo, investigamos o efeito in vitro do AG sobre vários parâmetros do sistema glutamatérgico, tais como a união de glutamato a membranas plasmáticas sinápticas na presença e ausência de sódio, a captação de glutamato por fatias cerebrais e a liberação de glutamato induzida por potássio por preparações sinaptossomais de córtex cerebral e estriado ou cérebro médio de ratos ao longo do desenvolvimento. Primeiro, observamos que o AG diminui a união de glutamato Na+-independente a membranas sinápticas de córtex cerebral e cérebro médio de ratos de 7 e 15 dias de vida, evidenciando uma possível competição entre o glutamato e o AG por sítios de receptores glutamatérgicos. Visto que uma diminuição da união de glutamato Na+- independente pode representar uma interação do AG com receptores glutamatérgicos, investigamos se AG interage com receptores glutamatérgicos pela adição de antagonistas de receptores NMDA e não-NMDA. Verificamos que, em córtex cerebral de ratos de 15 dias de vida, o AG e o CNQX (antagonista de receptores não-NMDA) diminuem a união de glutamato em 20 e 40 %, respectivamente, e que a co-incubação desses compostos não provoca um efeito aditivo, sugerindo que a união do AG e do CNQX ao receptor não-NMDA ocorre provavelmente através do mesmo sítio. Resultados semelhantes foram encontrados em cérebro médio de ratos de 15 dias de vida. Por outro lado, o AG não alterou a união de glutamato na presença de sódio tanto em córtex cerebral como em cérebro médio e/ou estriado, sugerindo que o AG não compete pelos transportadores de glutamato. Também observamos que o AG diminui a captação de glutamato por fatias de córtex cerebral de ratos de 7 dias de vida, o que pode provavelmente resultar num excesso de glutamato na fenda sináptica levando à excitotoxicidade, o que pode ser relacionado com o dano cerebral característico dos pacientes com AG I. A inibição da captação de glutamato por fatias não foi prevenida pela pré-incubação com creatina e N-acetilcisteína, sugerindo que essa ação do AG provavelmente não se deva a um efeito indireto reduzindo o metabolismo energético ou aumentando a produção de radicais livres. Finalmente, verificamos que o AG não alterou a liberação de glutamato estimulada por potássio por sinaptossomas. Assim, concluímos que o AG pode alterar o sistema glutamatérgico durante o desenvolvimento cerebral, resultando em possíveis ações deletérias sobre o SNC que podem explicar ao menos em parte a neuropatogenia da AG I.

O fator de crescimento do nervo inibe o edema citotóxico de células de Müller e células bipolares da retina de rato por meio da liberação de citocinas gliais: participação do sistema glutamatérgico e purinérgico

O fator de crescimento do nervo (NGF) pode retardar a degeneração celular na retina de ratos em diferentes injúrias retinianas. O acúmulo de água em células da retina contribui para o desenvolvimento de edema retiniano e degeneração neuronal. Em atribuição ao seu efeito protetor, este trabalho teve por objetivo avaliar se o NGF influencia o edema celular osmótico em células de Müller e células bipolares. Assim, montagens planas, fatias de retina e células isoladas da retina de ratos foram superfundidas com solução hipo-osmótica na presença de BaCl₂. Secções retinianas foram utilizadas para imunomarcações, e a liberação de adenosina foi medida por cromatografia líquida de alta eficácia, em montagens planas. A área de secção transversal celular foi medida antes e após a superfusão em meio hipo-osmótico, em fatias de retina e suspensões celulares. Tanto células de Müller quanto células bipolares foram imunopositivas para TrkA, mas somente células de Müller foram marcadas contra p75^NTR e NGF. A hipo-osmolaridade induziu um rápido e significativo aumento da liberação de adenosina endógena em retinas controle, mas não em retinas perfundidas com BaCl₂. O NGF inibiu o edema citotóxico em células de Müller e em células bipolares em fatias de retina controle e retinas pós-isquêmicas submetidas a condições hipo-osmóticas. Por outro lado, NGF impediu o edema citotóxico da célula de Müller isolada, mas não da célula bipolar isolada (em meio hipo-osmótico contendo íons Ba²⁺). Isto sugere que NGF induz a liberação de fatores por células de Müller, os quais inibem o edema citotóxico de células bipolares em fatias de retina. O efeito inibitório do NGF sobre o edema citotóxico de células de Müller foi mediado pela ativação do receptor TrkA, mas não de p75^NTR, e foi anulado por bloqueadores de receptores metabotrópicos de glutamato, receptores de adenosina A₁, e receptores do fator de crescimento de fibroblasto (FGF). O bFGF evitou o edema citotóxico de células de Müller isoladas, mas inibiu somente em parte o edema citotóxico de células bipolares isoladas. O bloqueio de FGFR impediu o efeito inibidor de edema celular da adenosina, sugerindo que a liberação de bFGF ocorre após à ativação autócrina/parácrina de receptores A_l. Além de bFGF, GDNF e TGF431 reduziram em parte o edema citotóxico da célula bipolar. Estes dados sugerem que o efeito neuroprotetor do NGF é em parte mediado pela prevenção de edema citotóxico de células gliais e bipolares da retina.

Guanosina : uma nova abordagem do sistema purinérgico

Durante as últimas décadas os estudos do sistema purinérgico concentraram seu foco de atenção nas ações dos derivados da adenina (como adenosina e o ATP). Seus efeitos, receptores, agonistas e antagonistas encontram-se muito bem estabelecidos dentro do sistema nervoso central. Os resultados obtidos com os diversos estudos dos derivados da guanina trazem uma nova perspectiva para o estudo do sistema purinérgico. Os nucleotídeos derivados da guanina são classicamente associados ao sistema de transmissão de sinal transmembrana via proteínas G. Além disto, suas ações extracelulares sobre o sistema nervoso central, especificamente sobre o sistema glutamatérgico, têm tornado essa classe de moléculas uma nova fronteira no estudo da neuroproteção. Estas moléculas também são capazes de promover processos trófico e mitóticos nas células do SNC, promover a liberação de fatores de crescimento e estimular o influxo de cálcio nos astrócitos. Entretanto, suas ações sobre o sistema glutamatérgico são o alvo principal deste trabalho. Os derivados da guanina, especialmente a guanosina, são capazes de estimular a captação de glutamato em cultura de células astrocitárias e em fatias de tecido cerebral. Atuam como anticonvulsivantes pelas mais diversas vias de administração, e ainda possuem efeito amnésico. O aumento provocado na captação de glutamato parece ser realizado especificamente pela guanosina, uma vez que os nucleotídeos necessitam ser hidrolisados para exercerem tais efeitos. Assim a guanosina acaba assumindo um papel importante na neuroproteção contra os efeitos de concentrações extracelulares tóxicas de glutamato no SNC. Nosso trabalho demonstra que a guanosina também é a real efetora do efeito anticonvulsivante apresentado pelo GMP, uma vez que o uso de inibidores da conversão de GMP para guanosina leva a uma diminuição do seu efeito. Ainda, a guanosina aumenta a Vmax da captação de glutamato em fatias, o que indicaria um maior contingente de transportadores presentes na membrana da célula ou uma menor taxa de turnover dos mesmos. Esse efeito nos transportadores parece permanecer mesmo depois que a guanosina é retirada do meio de incubação. Os efeitos demonstrados pela guanosina in vitro foram confirmados em experimentos ex vivo. Além disso, a concentração de purinas no liquor dos ratos tratada não demonstrou aumentos significativos após a administração i.c.v. de guanosina ou GMP. Essa ação pode indicar que a guanosina dispara algum mecanismo que aumente o tônus glutamatérgico por um período maior do que o tempo de exposição a ela. Essas ações da guanosina devem ser desempenhadas através de seu receptor. Nossos resultados apontam para um novo receptor no sistema purinérgico, sensível à guanosina e adenosina, mas não antagonizado por cafeína e ATP. Esse receptor parece ter proteínas G acopladas, uma vez que o GTP-N foi capaz de inibir a união de guanosina ao receptor. Esse receptor deve responder de acordo com a purina que estiver ligada a ele, pois a adenosina e a guanosina têm ações diversas e muitas vezes contrárias no SNC. O sitio de união parece ser preferencialmente astrocitário, o que ajudaria a explicar as ações encontradas para a guanosina na captação de glutamato. Somando-se todas as ações já descobertas para a guanosina e as suas mais variadas formas de proteger o cérebro de excesso de glutamato extracelular, é impossível tratar a guanosina apenas como uma molécula coadjuvante no sistema purinérgico.

Efeitos da desnutrição protéica sobre o metabolismo cerebral e sistemas glutamatérgico e GABAérgico sob condições de excitotoxicidade em SNC de ratos wistar

Para um adequado funcionamento do SNC, são necessárias complexas interações entre os sistemas de neurotransmissão inibitório e excitatório. Desequilíbrios nos sistemas, e/ou na sua interação, podem acarretar comprometimentos neuropsiquiátricos. Várias etapas do desenvolvimento ontogenético cerebral, incluindo proliferação e migração neuronal, crescimento cerebral e mielinização, astrocitogênese e morte celular programada, são alteradas pela desnutrição protéica. Alterações no sistema glutamatérgico decorrentes de desnutrição, padrões de desenvolvimento afetados no sistema GABAérgico como a atividade da glutamato descarboxilase (GAD) e mRNA de subunidades de receptores GABAA , alterações nas reações a fármacos envolvendo o sistema GABAérgico, além de estudos epidemiológicos que apontam para a maior incidência de doenças neuropsiquiátricas em populações desnutridas precocemente e, ainda, os transtornos nas complexas interações entre células neuronais e gliais, que acompanham o desenvolvimento destas patologias, levantam questionamentos sobre as implicações da desnutrição sobre o metabolismo cerebral e parâmetros inibitórios e excitatórios sob condições de excitotoxicidade. Considerando estes aspectos, investigou-se a sensibilidade a drogas convulsivantes agindo sobre os sistemas glutamatérgico (ácido quinolínico) e GABAérgico (picrotoxina), assim como se procurou detectar interferências provocadas pela desnutrição protéica gestacional e pós-natal, e/ou drogas em um dos parâmetros, que, além da biossíntese, liberação, interação com receptores, determina uma neurotransmissão eficiente, qual seja: na inativação dos dois principais neurotransmissores excitatório e inibitório, glutamato e GABA, respectivamente, por meio da captação mediada por transportadores localizados nas membranas neuronais e gliais de córtex e hipocampo de ratos em desenvolvimento, assim como parâmetros ontogenéticos ligados ao transporte de GABA. A sensibilidade à picrotoxina foi avaliada ainda segundo parâmetros metabólicos, envolvendo o metabolismo da glicose e do acetato, procurando detectar interações neurônio-glia na resposta à droga, assim como a ocorrência de peroxidação lipídica, dado o seu envolvimento no processo convulsivante. Considerando que o acetato é metabolizado predominantemente pelos astrócitos, células que têm importante papel no fluxo de substratos energéticos aos neurônios, a sua oxidação foi avaliada em fatias de córtex cerebral de ratos adultos, frente a diferentes concentrações extracelulares de potássio. A desnutrição acarretou menor sensibilidade à ação convulsivante do ácido quinolínico, em ratos de 25 dias de idade, excluindo alterações na captação de glutamato como mecanismo envolvido, uma vez que este parâmetro não foi afetado pela desnutrição e/ou droga. Contrariamente, a desnutrição induziu maior sensibilidade à ação convulsivante da picrotoxina, em ratos de 25 dias, o que pode estar relacionado à maior captação de GABA por fatias de córtex cerebral e hipocampo evidenciadas no grupo desnutrido. A desnutrição alterou o perfil ontogenético da captação de GABA por fatias de córtex cerebral e também o perfil inibitório da β-alanina (inibidor de GAT-3), dando suporte à hipótese de que a maior captação de GABA em ratos desnutridos em desenvolvimento seja devida predominantemente a este transportador. A maior sensibilidade à picrotoxina no grupo desnutrido também foi evidenciada pelo maior estímulo à oxidação da glicose em fatias de córtex cerebral (que também é idade dependente) e peroxidação lipídica. Enquanto em ratos imaturos a administração de uma única dose de picrotoxina mostrou a maior susceptibilidade de ratos desnutridos, no procedimento de “kindling” químico pela picrotoxina em ratos em desenvolvimento, a susceptibilidade mostrou-se sexo e tratamento nutricional dependente. A picrotoxina estimulou a oxidação do acetato a CO2, mas não a da glicose em período precoce pós picrotoxina (24 horas) em fatias de córtex e hipocampo de ratos de 25 dias, indicando o envolvimento astrocitário na resposta ao agente convulsivante, independente do tratamento nutricional. A administração crônica de picrotoxina acarretou estímulo à oxidação da glicose em fatias de córtex de ratos desnutridos, mostrando efeito tempo e tratamento nutricional-dependente sobre o metabolismo da glicose, sem alteração da oxidação do acetato. Altas concentrações de potássio extracelular aumentaram a oxidação do acetato em fatias de córtex cerebral, em função da redução intracelular de sódio em ratos controle e desnutridos adultos; o agravamento do déficit nutricional exacerbou a oxidação do acetato em fatias de cerebelo. A desnutrição pré e pós-natal afeta respostas envolvendo os sistemas GABAérgico e glutamatérgico em situações de excitotoxicidade, provocada por antagonista de receptor GABAA, picrotoxina e por hiperestimulador do sistema glutamatérgico, ácido quinolínico, em ratos em desenvolvimento, assim como parâmetros ontogenéticos ligados ao transporte de GABA. A severidade da restrição nutricional é fator determinante da exacerbação do estímulo à oxidação do acetato. Além do mais, a desnutrição parece afetar a interação neurônio-glia em condições de excitotoxicidade.

Estudo ontogenético dos efeitos do ácido alfa-cetoisocapróico na fosforilação in vitro de filamentos intermediários de córtex cerebral de ratos

A disfunção neurológica é um sintoma comum em pacientes com Doença do Xarope do Bordo. Entretanto, os mecanismos que levam à neuropatologia dessa doença são pouco conhecidos. Neste trabalho, nós investigamos os efeitos do ácido α-cetoisocapróico (CIC) na incorporação in vitro de proteínas do tipo filamento intermediário de córtex cerebral de ratos durante o desenvolvimento. Fatias de tecido de ratos de 09, 12, 15, 17, 21 e 60 dias foram incubadas com 32P-ortofosfato na presença ou na ausência de CIC. A fração citoesquelética foi isolada e a radioatividade incorporada nas proteínas de filamento intermediário foi medida. Nós observamos que o CIC diminui a incorporação in vitro de 32P nas proteínas estudadas até 12 dias, entretanto, a fosforilação aumentou nas fatias de tecido de ratos de 17, 21 e 60 dias e nenhuma alteração ocorreu nas fatias cerebrais dos animais de 15 dias. Nós também testamos a influência do sistema glutamatérgico na incorporação in vitro de 32P nas proteínas estudadas, incubando fatias de córtex cerebral na presença de glutamato, agonistas e antagonistas glutamatérgicos. O glutamato apresentou um efeito similar ao observado para o CIC na fosforilação das proteínas de filamento intermediário durante o desenvolvimento, mas não afetou a incorporação in vitro de 32P nas proteínas estudadas nos ratos de 60 dias, sugerindo que nos animais adultos o CIC aumenta a incorporação in vitro nas proteínas estudadas por outros mecanismos. Além disso, nós observamos que os agonistas glutamatérgicos ionotrópicos NMDA, AMPA e cainato mimetizam o efeito inibitório do CIC, enquanto os agonistas metabotrópicos 1S, 3R ACPD e L-AP4 não induziram alterações na incorporação in vitro de 32P nas proteínas de filamento intermediário estudadas nos animais de 09 dias. Nos ratos de 21 dias, somente os agonistas ionotrópicos NMDA e AMPA mimetizaram o efeito estimulatório do CIC. Também observamos que quando fatias de córtex cerebral de ratos de 09 e 21 dias foram incubadas com 1mM CIC seguidas de incubação com o DL-AP5, um antagonista específico para receptores NMDA, ou com CNQX, antagonista de receptores ionotrópicos AMPA e cainato, o efeito inibitório ou estimulatório do ácido na fosforilação in vitro de ratos de 09 e 21 dias foi revertido. Estes resultados demonstram que o CIC, nas mesmas concentrações encontradas no sangue de crianças afetadas por DXB, altera o sistema de fosforilação associado com as proteínas do citoesqueleto, via sistema glutamatérgico, de maneira regulada pelo desenvolvimento. Portanto, é provável que a alteração de fosforilação das proteínas de citoesqueleto cerebral seja importante para o entendimento da patofisiologia da disfunção neuronal e das alterações estruturais observadas do SNC dos pacientes com DXB.

Avaliação comportamental e neuroquímica em modelos de convulsão em ratos jovens

O ácido quinolínico (AQ) tem sido usado como modelo farmacológico de hiperestimulação do sistema glutamatérgico. A captação de glutamato é o principal mecanismo envolvido na manutenção do glutamato extracelular abaixo dos níveis tóxicos. A guanosina sistemicamente administrada previne convulsões induzidas pela hiperestimulação do sistema glutamatérgico em ratos adultos e aumenta a captação basal de glutamato em culturas primárias de astrócitos e em fatias corticais de ratos jovens. Este trabalho teve como objetivo investigar o efeito da guanosina p.o. sobre convulsões induzidas por ácido quinolínico e sobre a captação de glutamato em fatias corticais de ratos jovens (12-14 dias pós-natal). A infusão i.c.v. de 250nmol AQ induziu convulsões em todos os animais testados e diminui a captação de glutamato. A administração de MK-801 e fenobarbital i.p. 30 min antes preveniu as convulsões em todos os animais. Guanosina (7.5 mg/kg) 75 min antes, preveniu em 50% as convulsões induzidas por AQ bem como reverteu a captação de glutamato aos níveis do controle. No intuito de investigar se o efeito anticonvulsivo da guanosina é específico para convulsões induzidas por ácido quinolínico, testamos também o efeito da guanosina em convulsões induzidas por picrotoxina. O pré-tratamento com fenobarbital i.p. (60 mg/kg – 30 min) preveniu as convulsões em todos os animais, visto que guanosina p.o. (7.5 mg/kg – 75 min) e MK-801 i.p. (0.5 mg/kg – 30 min) não tiveram efeito. Desta forma, nossos resultados indicam que a guanosina pode ser considerado para o tratamento das epilepsias e possíveis transtornos neurológicos associados com excitotoxicidade mediada por AQ.

Influência do tratamento crônico com cafeína em modelos animais de esquizofrenia : parâmetros cognitivos e comportamentais

A esquizofrenia envolve um conjunto de sintomas de sensopercepção, cognição e afeto que compromete significativamente a vida do sujeito. O mais aceito modelo para se entender essa doença é o modelo de hiperatividade dopaminérgica, pois drogas como anfetamina e cocaína, que aumentam a atividade dopaminérgica, mimetizam alguns sintomas dessa patologia, e os fármacos usados para o tratamento são os que bloqueiam os receptores de dopamina. Além da dopamina, o sistema glutamatérgico também tem sido relacionado à esquizofrenia, pelo fato de antagonistas de receptores glutamatérgicos do tipo NMDA, tais como PCP, MK-801 e cetamina, provocarem alguns sintomas dessa doença, como desorganização cognitiva e delírios em pessoas saudáveis. adenosina, por sua vez, desempenha um papel neuromodulatório tanto da atividade dopaminérgica quanto da atividade glutamatérgica, inibindo o tônus de ambos neurotransmissores por diferentes vias. Assim, sugerimos que antagonistas de receptores adenosinérgicos, como a cafeína, também seriam um modelo farmacológico para a doença. Com base nisso, demonstramos previamente que camundongos tratados cronicamente com cafeína desenvolvem tolerância cruzada ao efeito do antagonista NMDA MK-801 em provocar hiperlocomoção, mas não em seu déficit cognitivo na esquiva inibitória. Buscando ampliar e melhor caracterizar essa interação, os seguintes parâmetros foram avaliados em camundongos: atividade locomotora realizando-se as curvas de dose e de tempo; memória de trabalho, avaliada na tarefa de alternação tardia; memória de longa duração, avaliada na tarefa de esquiva inibitória e a avaliação de ataxia. Os resultados nos mostraram que camundongos subcronicamente tratados com cafeína na bebida (1 mg/mL, por 1, 3, ou 7 dias) apresentaram habituação semelhante entre os grupos e que MK-801 (0,25 mg/kg, i.p.) produziu hiperlocomoção nos animais tratados com água e 1 dia de cafeína, com efeito diminuído depois de 3 dias e praticamente abolido depois de 7 dias. Depois de 7 dias, o efeito também foi dose-dependente, sem tolerância cruzada na dose de 0,1 mg/mL, intermediária na dose de 0,3 mg/mL e total a 1,0 mg/mL. Os escores de ataxia induzidos por 0,5 mg/kg de MK-801 não foram afetados pelo tratamento com cafeína por 7 dias a 1 mg/mL, mas uma hiperlocomoção transitória foi observada. O tratamento com cafeína por 7 dias a 1 mg/mL preveniu os déficits induzidos por 0,01 mg/kg de MK-801 na tarefa de esquiva inibitória e os atenuou, a 0,4 mg/kg de MK-801, na tarefa de alternação tardia, no labirinto em T. Conclui-se, então, que a hiperlocomoção e os déficits cognitivos – mas não a ataxia – induzidos por MK-801 podem estar influenciados pela atividade reduzida da adenosina. Assim, os estudos sobre a ação da adenosina podem se fazer relevantes para a melhor compreensão da neurobiologia da esquizofrenia. Estes resultados são concordantes com o novo modelo proposto, que é o de hipofunção adenosinérgica na esquizofrenia.

Efeito de compostos organocalcogênicos e derivados da guanina em modelos de dano cerebral em ratos

Os mecanismos envolvidos nas atividades toxicológicas e/ou farmacológicas dos compostos orgânicos de selênio são pouco conhecidos. Os compostos orgânicos de selênio (disseleneto de difenila e ebselen) e organotelúrio (ditelureto de difenila) foram alvo dos trabalhos realizados“in vitro”, neste estudo. Os compostos organocalcogênios apresentaram efeitos diversos sobre o influxo de 45Ca2+ medido em sinaptossomas de cérebro de rato, dependendo das condições e agentes despolarizantes usados. Ebselen, (PhSe)2 e (PhTe)2 alteram a captação de 45Ca2+ de maneira distinta quando expostos a aminopiridina ou KCl. Enquanto (PhTe)2 inibe a captação de cálcio em todas as condições experimentadas, (PhSe)2, apresenta este efeito apenas quando incubado em condições basais ou sob a ação de aminopiridina. Ebselen, por sua vez, aumenta a captação de cálcio em altas concentrações em condições basais e sob a ação de aminopiridina, porém, apresenta efeito inverso quando os sinaptossomas são despolarizados por KCl. Ebselen evitou a inibição da captação de 45Ca2+ “in vitro” provocada por cloreto de mercúrio(HgCl) em sinaptossomas de cérebro de rato em condições basais do ensaio, no entanto, ebselen não afetou a inibição da captação de glutamato “in vitro” por HgCl, indicando que ebselen pode atuar dependendo das proteínas-alvo consideradas.Os compostos de mercúrio, MeHg e HgCl, inibiram a captação de glutamato em córtex cerebral de ratos de 17 dias e ebselen reverteu somente o efeito do MeHg porém, não, o do HgCl. Disseleneto de difenila não alterou os parâmetros avaliados na exposição de ambos os compostos de mercúrio.Os compostos de mercúrio estudados provocaram a morte celular das fatias de córtex, porém, ebselen protegeu as fatias dos efeitos lesivos provocados por MeHg e não pelo HgCl.

Sistemas dopaminérgicos e ação antipsicótica : abordagens experimentais e teóricas

Os objetivos da presente tese de doutorado foram os de buscar novos antipsicóticos atípicos de baixo preço comercial e também procurar entender o mecanismo de ação que leva a um perfil antipsicótico atípico. Os resultados da tese são divididos em duas partes, de acordo com sua natureza, em experimentais (primeira parte) e teóricos (segunda parte). Para o desenvolvimento da primeira parte, foi necessária primeiramente a programação de um software para medir locomoção em roedores após filmagem com webcam. A seguir, foram investigados os efeitos da guanosina, flunarizina e cinarizina em modelos animais de psicose, bem como em outros paradigmas comportamentais. A guanosina foi escolhida para estudo uma vez que tem se mostrado que ela interage com o sistema glutamatérgico – que sabidamente está envolvido na fisiopatologia da esquizofrenia – promovendo a captação astrocitária de glutamato. Já a flunarizina e a cinarizina, dois bloqueadores de canal de cálcio empregados para tratar enxaqueca e vertigem foram escolhidas pelo fato delas produzirem sinais e sintomas extrapiramidais em pacientes idosos, o que posteriormente foi relacionado às suas propriedades como antagonistas moderados dos receptores dopaminérgicos do tipo D2 A guanosina diminuiu o aumento de locomoção induzido por um antagonista NMDA (MK-801), enquanto que não apresentou efeito sobre o aumento de locomoção induzido por anfetamina, de forma que sua utilidade como potencial antipsicótico deve ser ainda melhor estudada. Tanto a flunarizina quanto a cinarizina foram capazes de diminuir o aumento de locomoção induzido por MK-801 e por anfetamina em doses que não causam efeitos catalépticos importantes. Portanto, foi concluído que estes dois compostos apresentam um potencial perfil de antipsicótico atípico, com as vantagens de já estarem disponíveis para uso comercial, boa tolerabilidade e baixo custo quando comparados com os antipsicóticos atípicos disponíveis comercial. A segunda parte da tese apresenta alguns resultados teóricos matemáticos que podem ser derivados da teoria da lei de ação das massas aplicada ao binding de receptores, utilizando também resultados experimentais já conhecidos de PET Estes resultados apresentam insights ao entendimento das diferenças entre os perfis antipsicóticos atípicos e típicos em relação à geração de sinais extrapiramidais. É discutido que fatores culturais e comerciais relacionados à posologia atual empregada no tratamento com antipsicóticos típicos podem ser os responsáveis pelas diferenças de perfis, uma vez que alguns deles são prescritos em doses proporcionalmente maiores em relação à sua afinidade, atingindo assim maiores níveis de bloqueio dopaminérgico no estriado. Uma curta meia-vida plasmática também é apontada como um possível parâmetro importante na geração de um perfil atípico. É mostrado ainda alguns erros de concepção relacionados ao curso temporal da ocupação dopaminérgica que tem sido atualmente cometidos na literatura científica, como o conceito de meia-vida de ocupação de receptores. Como um último resultado teórico, é proposto um algoritmo para a redução de dose em pacientes tratados com antipsicóticos apresentando sinais e sintomas extrapiramidais.

Caracterização da resposta inflamatória e alterações neuroquímicas e eletrofisiológicas do tecido retiniano em modelo murino de malária cerebral induzido pela infecção por Plasmodium Berghei ANKA

A malária cerebral (MC) é uma das complicações mais graves resultante da infecção por P. falciparum e a principal causa de morte em crianças. O quadro de MC apresenta uma patogênese complexa, associado a complicações neurológicas provenientes de uma resposta imunológica exacerbada, bem como eventos hemorrágicos. Estudos descrevem uma retinopatia associada ao quadro, juntamente com um intenso processo de astrogliose nas proximidades de vasos que nutrem o tecido retiniano. O presente trabalho buscou caracterizar o processo inflamatório e as possíveis alterações neuroquímicas e eletrofisiológicas no tecido retiniano de camundongos albino suíço, quando inoculados com a cepa ANKA de Plasmodium berghei (PbA). Camundongos albino suíço foram infectados com cepa PbA. Para caracterização do quadro de malária cerebral experimental (MCE) foram avaliados diversos parâmetros, como surgimento dos sinais clínicos, curva de sobrevivência, parasitemia (%), ganho de massa corpórea, permeabilidade vascular e quantificação de citocinas (TNF-α, IL-6 e IL-10) no tecido cortical. Para avaliarmos alterações na funcionalidade do tecido retiniano, utilizamos eletrorretinograma de campo total. Para a avaliação dos sistemas de neurotransmissão foi realizado ensaio de liberação e captação de glutamato e GABA que, posteriormente foi quantificado por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. Para análise da resposta inflamatória foi realizada a quantificação de citocinas (TNF-α, IL-6 e IL-10) no tecido retiniano. Após a caracterização do quadro de MCE nós observamos a diminuição da amplitude de onda-b de cones e bastonetes, bem como aumento do tempo implícito de bastonetes, respostas mistas em diferentes intensidades e potencial oscilatório. Observamos aumento na liberação e captação de glutamato e, ainda, a ativação de uma via antiinflamatória no tecido retiniano. Este trabalho nos permitiu validar o modelo murino de MCE e caracterizar, pela primeira vez, alterações na funcionalidade do tecido retiniano, acompanhada de alterações no sistema glutamatérgico, bem como ativação de uma via antiinflamatória no tecido retiniano.

Modulação dos sistemas GABAérgico e glutamatérgico na secreção hipotalâmica de ocitocina sob condições hiperosmóticas

Em mamíferos, a osmolalidade do fluído extracelular é o parâmetro mais importante na manutenção do balanco hidroeletrolitica. Deste modo, variações de osmolalidade são detectadas por células hipotalâmicas especializadas, iniciando assim uma sinalização neuroquímica, com envolvimento dos sistemas glutamátergicos e GABAérgico, a qual pode desencadear a secreção da ocitocina. Entretanto, o modo como a relação dos aminoácidos GABA e glutamato pode modular a liberação de ocitocina durante a hiperosmolalidade ainda é pouco compreendida. Neste contexto, o objetivo do presente estudo foi caracterizar o efeito do meio hipertônico sobre os níveis extracelulares de GABA e glutamato e sua relação com a liberação de ocitocina em preparações de hipotálamo in vitro. Para tal, Ratos Wistar Machos (270-300g) foram mantidos em condições padrões de laboratório. E após decapitação o cérebro foi retirado rapidamente, os fragmentos hipotalâmicos foram imediatamente dissecados em Krebs Ringer Bicarbonato Glicose gelado (KRBG) e colocados no sistema de perinfusão com solução de KRBG isotônica (280 mOsm/Kg H₂O) fluxo de 0.5-1.0 ml/min, foram feitas as coletas a cada minuto durante 15 min. O estímulo hipertônico (340 mOsm/Kg H₂O) ocorreu por 3 minutos. As dosagens de glutamato, GABA e ocitocina foram efetuadas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC). As dosagens de glutamato mostraram um aumento da liberação somente após a diminuição da concentração de GABA. Este padrão de liberação temporal motivou-nos a adicionar GABA (3 μM) durante o estímulo osmótico, resultando no bloqueio da liberação de glutamato anteriormente observada. Além disso, os resultados mostraram que a liberação de ocitocina estimulada por solução de NaCl hipertônica pode depender também de uma diminuição da liberação de GABA. O presente estudo sugere que a liberação de ocitocina estimulada por hipertonicidade depende de alteração da relação GABA/glutamato.

"Aplicación de un sistema multimétrico para evaluar la calidad del agua superficial en la microcuenca El Coyote del Rio Estelí, Nicaragua"

En la microcuenca El Coyote localizada en el municipio de Condega, Estelí, se evaluó la calidad del agua superficial de sde febrero del 2010 a febrero del 2011. El propósito fue la identificación de indicadores que faciliten la vigilancia y monitoreo de la calidad del agua . Se integró un sistema multimétrico utilizando las características físicoquímicas y bacteriológicas, macro invertebrados acuáticos, la caracterización morfométrica de la microcuenca y la información resultante a nivel de comunidad (cambios en el uso del suelo). En la determinación de la relación de la calidad del agua con la estructura de la macrofauna acuática (macroinvertebrados) se usó el método Biological Monitoring Working Party (BMWP/Col ) . La microcuenca tiene 144 afluentes con una forma oval - oblonga - alargada, y su curva hipsométrica refleja un estado de equilibrio relativo de juvenil a madurez. El uso del suelo es inadecuado y su entorno natural fue valorado como subóptimo. Aunque los parámetros fisico químicos indicaron que las aguas son alcalinas, con un nivel aceptable de oxigeno disuelto, categorizadas según el Diagrama de Riverside como aguas aptas par a riego (C2 - S1), y aceptables según valores determinados para DBO 5 y DQO; sin embargo, requieren de un tratamiento de descontaminación previo a su uso doméstico y agropecuario. Además, debido a la presencia de coliformes fecales estas aguas no están aptas para consumo humano . Los macroinvertebrados varían, según la estacionalidad, en riqueza, abundancia y distribución, presentando una disminución en el número de individuos en la época lluviosa (t= 5.21, p<2.18E - 07). E l 6 8 . 91 % de los macroinvertebrados bioin dicadores se distribuyeron en cinco familias : Leptohyphidae , Baetidae , Hydropsychidae , Chironomidae y Physidae , siendo el cariotipo piedra el que present ó mayor diversidad y abundancia . El promedio del BMWP /Col fue de 60.06, indicando una calidad del agua entre dudosa y aceptable , y el índice ASPT de 6.71 señala una contaminación moderada ; estos resultados coincide n con los obtenidos utilizando la batería de indicadores fisicoquímicos y bacteriológicos .