Efeito da proteína Beta-Conglicinina da soja no metabolismo lipídico de animais submetidos à dieta hipercolesterolêmica

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Iron homeostasis in immune mononuclear cells : a potential role in a atherogenesis

Tese de doutoramento, Biologia (Biologia-Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015

Toxicidade induzida pelos peptídeos AB42 e AB25-35 em modelo de cultura organotípica de hipocampo de ratos

O crescimento da expectativa de vida média da população mundial tem sido acompanhado do aumento na prevalência de doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson, isquemia cerebral e, especialmente, a doença de Alzheimer. A doença de Alzheimer (DA) caracteriza-se por um crescente declínio na função mental e memória do paciente. Estes sintomas são explicados por uma profunda perda neuronal e pela presença de alterações estruturais no tecido cerebral: as placas senis, extracelulares e os emaranhados neurofibrilares, intracelulares. O passo que desencadeia a neurodegeneração na DA é ainda objeto de estudo, mas a hipótese mais aceita atualmente é a de que a secreção anormal do peptídeo β amilóide (Aβ), principal componente das placas senis, dê início ao processo. O presente trabalho teve como objetivos investigar a toxicidade induzida pelo peptídeo Aβ1-42 e seu fragmento, o peptídeo Aβ25-35 em culturas organotípicas de hipocampo de ratos. Na primeira parte do trabalho, investigamos a toxicidade induzida pela exposição de culturas organotípicas de hipocampo de ratos a 10 ou 20 μM do peptídeo Aβ1-42, por 24 ou 72 h. Além disso, investigamos o envolvimento das proteínas iNOS e GSK-3β no mecanismo de morte celular induzida pelo peptídeo Aβ1-42. Na segunda parte do trabalho, investigamos a toxicidade induzida pelo fragmento Aβ25-35 na concentração de 25 μM, nos tempos de 1, 3, 6, 12, 24 ou 48 h de exposição às culturas organotípicas, e seu efeito sobre as proteínas Akt, GSK-3β e PTEN. A morte celular foi quantificada pela incorporação do iodeto de propídeo, corante marcador excluído de células sadias, e as proteínas foram quantificadas por imunodetecção com o uso de anticorpos específicos. Nossos resultados mostraram que o peptídeo Aβ1-42 apresentou toxicidade nas concentrações de 10 e 20 μM, induzindo a uma considerável morte celular após 72 h de exposição. A análise do imunoconteúdo da proteína iNOS mostrou um aumento significativo em relação ao controle, após 72 h de exposição ao peptídeo e na concentração de 20 μM. Os resultados obtidos na segunda parte do trabalho mostraram uma morte celular significativa apenas após 48 h de exposição ao peptídeo Aβ25- 35 na concentração de 25 μM. O tratamento com peptídeo Aβ25-35 levou ao aumento no estado de fosforilação da proteína Akt após 6 h de exposição e também da proteína GSK-3β, um potencial substrato da Akt. Após 12 h de exposição ao peptídeo, observamos uma diminuição de ambas as proteínas (Akt e GSK-3β). Porém, após 24 h de exposição ao peptídeo, a proteína Akt continua menos fosforilada enquanto que a proteína GSK-3β apresenta um novo pico de fosforilação. O imunoconteúdo da proteína fosfatase PTEN apresentou um aumento significativo em 24 h e 48 h. Os resultados do presente estudo mostraram que o tratamento das culturas organotípicas de hipocampo de ratos com o peptídeo Aβ1-42 como com o fragmento Aβ25-35 apresentou toxicidade após um período de aproximadamente 48 h de tratamento, e mostrou ser um bom modelo para o estudo de sua toxicidade. Com relação ao mecanismo investigado, os dados sugerem que a proteína iNOS pode estar envolvida na toxicidade induzida pelo peptídeo Aβ1-42. Além disso, sugerem que o fragmento Aβ25-35 possa exercer sua toxicidade através da inibição da via de sobrevivência celular PI3-K, por diminuir a fosforilação/ativação da proteína Akt, parecendo envolver a proteína fosfatase PTEN, principal regulador negativo da via PI3-K/Akt.

Aß biology and its contribution to Alzheimer's disease

A doença de Alzheimer (DA) é uma desordem neurodegenerativa progressiva patologicamente caracterizada pela presença de placas de amilóide (placas senis) insolúveis e também pela presença de tranças neurofibrilhares,formadas pela proteína Tau hiperfosforiladada. O principal constituinte das placas senis é o peptídeo beta-amilóide (Ab), que deriva do processamento proteolítico da proteína precursora de amilóide de Alzheimer (APP). Embora Ab exista como um agregado pouco solúvel nas placas senis, ele é secretado pelas células como uma molécula solúvel. O Ab “per se” pode afectar o metabolismo da APP. Alguns autores sugerem que o Ab exerce o seu efeito alterando o processamento ou catabolismo da APP, outros sugerem que ele também induz a transcrição da APP, onde aumentando os níveis da APP pode estar a contribuir para a sua própria produção (mecanismo de “feedback” positivo). Assim sendo, torna-se difícil consolidar todas estas observações e identificar as potenciais funções fisiológicas do Ab “in vivo”, ou as consequências da sua produção. Neste trabalho caracterizaram-se os efeitos do Ab no metabolismo da APP. Os nossos estudos revelaram que um dos mecanismos induzidos pelo Ab é a acumulação intracelular do fragmento neuroprotector sAPP (isAPPa) em estruturas com características vesiculares associadas ao citosqueleto. Estudos adicionais em culturas primárias revelaram que o Ab estava a exercer o seu efeito ao nível da secreção vesicular, provavelmente interferindo com o transporte de APP/sAPP ao longo da rede do citosqueleto. Esta hipótese é sustentada pelo facto do Ab estar a afectar a estabilidade e a polimerização de proteínas envolvidas na dinâmica do citosqueleto. Contrariamente a publicações anteriores o Ab não induziu a transcrição da APP, na verdade em culturas primárias neuronais foi observado uma diminuição nos níveis de expressão da APP. Isto foi acompanhado por um aumento nos fragmentos C-terminais da APP (CTFs) e uma diminuição na localização nuclear do seu domínio intracelular (AICD), sugerindo alterações na sinalização nuclear da APP. O Ab pode afectar outras vias de sinalização, particularmente alterando o balanço entre as actividades das proteínas cinases e fosfatases, o que pode ter consequências para o desenvolvimento da doença. Os dados obtidos indicam que o Ab é capaz de inibir a actividade da proteína fosfatase1, a sua importância numa perspectiva de futuras terapias é discutida. Devido à relevância da agregação do Ab para a sua toxicidade, a formação de complexos com proteínas que promovem a sua desagregação/degradação e o seu efeito no processamento da APP foi avaliado. Na presença destes complexos observou-se uma reversão da acumulação isAPP, demonstrando o potencial terapêutico destas proteínas como moduladores do metabolismo da APP. Este trabalho permitiu compreender melhor os mecanismos envolvidos nos efeitos do Ab no processamento da APP e descobrir algumas moléculas que podem ser relevantes numa perspectiva de diagnóstico e terapia na DA.

Brain-derived neurotrophic factor and adenosine signalling on amyloid-β peptide induced toxicity : impact on hippocampal function

Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Neurociências), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2014

Identification of the cellular and molecular mechanism by which CD2AP, a regulator of neuronal intracellular transport contributes to the development of Alzheimer’s disease

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências,2014

The role of cellular prion protein in Alzheimer’s disease

Alzheimer’s disease (AD) is the most prevalent age-related neurodegenerative disease that leads to cognitive impairment and dementia. The major defined pathological hallmark of AD is the accumulation of amyloid beta (Aβ), a neurotoxic peptide, derived from beta and gamma-secretase cleavage of the amyloid precursor protein (APP). It has been described that cellular prion protein (PrPC) plays a role in the pathogenesis of Alzheimer disease. Although, the role of PrPC is still unclear, previous studies showed contradictious results. To elucidate this issue, the main objective of the present study is to investigate the influence of a knockout of the PRNP gene in 5XFAD mice, 5xFAD mice exhibited 5 mutations related to familial Alzheimer disease. These mice show an Aβ1-42 accumulation and an increased neuronal loss during aging. To create a bi-transgenic 5xFAD mice were crossed with Prnp0/0 Zurich 1 mice (prion protein knockout mice). We subjected two transgenic mice (5xFAD and Prnp0/05xFAD) at different ages (3, 9 and 12 months of age) to a battery of task to evaluate cognitive and motoric deficits and a biochemical analysis (ELISA, western blot and immunohistochemistry) to investigate the regulation and potential involvement of downstream signaling proteins in the Aβ induced toxicity process dependent of the PrPC concentration. The study revealed that the deficits induced by Aβ mediated toxicity appeared earlier in 5xFAD mice (9 months of age) than in Prnp0/05xFAD (12 months of age). Investigating the amount of amyloid beta in 5xFAD mice we observed a PrPC dependent regulation in 9 month-old animals of Aβ1−40 but not of the toxic form Aβ1−42. We did not found in Prnp0/05xFAD mice the up-regulation of P-Fyn, Fyn or Cav-1 as we found in 5xFAD mice. This suggests an important role of PrPC in Alzheimer’s disease as a promoter of toxic effect of Aβ oligomers. Our results may suggest the loss of PrPC delays the toxicity of amyloid beta. In conclusion, our data support a role of PrPC as a mediator of Aβ toxicity in AD by promoting early onset of disease.

Diminuição da expressão dos genes APP e CP em doentes de Alzheimer sugere alteração da exportação de ferro celular nesta demência

Recentemente tem-se assistido a um acumular de evidência sugerindo a implicação de uma desregulação do metabolismo do ferro (Fe) na fisiopatologia da doença de Alzheimer (DA). Neste trabalho, pretendemos esclarecer melhor os mecanismos moleculares subjacentes à homeostasia deste metal na DA, particularmente ao nível do efluxo celular. Assim, mediu-se em células mononucleares do sangue periférico de 73 doentes com DA e 74 controlos a expressão de genes diretamente envolvidos na regulação e exportação celular de Fe, utilizando a técnica de PCR quantitativo. Os resultados mostraram uma diminuição significativa na expressão dos genes aconitase (ACO1; P=0,007); ceruloplasmina (CP; P<0,001) e proteína precursora de beta amilóide (APP; P=0,006) em doentes com DA comparativamente com os voluntários saudáveis. Estas observações apontam para uma diminuição significativa da expressão dos genes associados com a exportação de Fe celular mediada pela ferroportina na DA. Assim, o presente estudo reforça resultados anteriores que mostram alterações no metabolismo do Fe e podem estar na origem da retenção intracelular deste metal e aumento de stress oxidativo caraterísticos desta patologia.

Synthesis of new Aβ-ligands useful in diagnosis of Alzheimer's disease

Alzheimer’s disease is a chronic progressive neurodegenerative disease and is the most common form of dementia (estimated 50−60% of all cases), associated with loss of memory (in particular episodic memory), cognitive decline, and behavioural and physical disability, ultimately leading to death. Alzheimer’s disease is a complex disease, mostly occurring sporadically with no apparent inheritance and being the age the main risk factor. The production and accumulation of amyloid-beta peptide in the central nervous system is a key event in the development of Alzheimer’s disease. This project is devoted to the synthesis of amyloid-beta ligands, fluorophores and blood brain barrier-transporters for diagnosis and therapy of Alzheimer’s disease. Different amyloid-beta ligands will be synthesized and their ability to interact with amyloid-beta plaques will be studied with nuclear magnetic resonance techniques and a process of lead optimization will be performed. Many natural and synthetic compounds able to interact as amyloid-beta ligands have been identified. Among them, a set of small molecules in which aromatic moieties seem to play a key role to inhibit amyloid-beta aggregation, in particular heteroaromatic polycyclic compounds such as tetracyclines. Nevertheless tetracyclines suffer from chemical instability, low water solubility and possess, in this contest, undesired anti-bacterial activity. In order to overcome these limitations, one of our goals is to synthesize tetracyclines analogues bearing a polycyclic structure with improved chemical stability and water solubility, possibly lacking antibacterial activity but conserving the ability to interact with amyloid-beta peptides. Known tetracyclines have in common a fourth cycle without an aromatic character and with different functionalisations. We aim to synthesize derivatives in which this cycle is represented by a sugar moiety, thus bearing different derivatisable positions or create derivatives in which we will increase or decrease the number of fused rings. In order to generate a potential drug-tool candidate, these molecules should also possess the correct chemical-physical characteristics. The glycidic moiety, not being directly involved in the binding, it assures further possible derivatizations, such as conjugation to others molecular entities (nanoparticles, polymeric supports, etc.), and functionalization with chemical groups able to modulate the hydro/lipophilicity. In order to be useful such compounds should perform their action within the brain, therefore they have to be able to cross the blood brain barrier, and to be somehow detected for diagnostic purposes.

Chemokines impact in Alzheimer’s disease

Alzheimer’s Disease (AD) is a neurodegenerative disorder neuropathologically characterized by the presence of extracellular senile plaques, intracellular neurofibrillary tangles and synaptic loss. Neuroinflammation has been associated with some neurodegenerative diseases, such as AD. In AD, increased Aβ production and aggregation, have a fundamental role in the activation of the inflammatory process. In turn, this could be fundamental in the early stages of this pathology, regarding the Aβ clearance and brain protection. However, chronic inflammation leads to an increase of the inflammatory mediators, such as cytokines, released by activated microglia, astrocytes, and neurons. The excessive production of these inflammatory components promotes alterations in both amyloid precursor protein (APP) expression and processing, stimulating the increase of Aβ accumulation and abnormal tau phosphorylation. This results in neurotoxic effects, irreversible damage and neuronal loss. Chronic inflammation is a feature of AD however, little is known about the effects of some chemokines on its pathogenesis. Thus, the main aim of this thesis was to study the impact of the interleukin-8 (IL-8) and monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) on apoptosis, APP and tau. The both studied chemokines resulted in small alterations regarding the cytotoxicity on SH-SY5Y differentiated cells, being a significant increase in apoptosis observed only for the MCP-1 at the highest concentration. For the APP processing no significant differences were obtained, although a tendency to increase at different concentrations and periods was registered for both IL-8 and MCP-1. With respect to tau and other cytoskeleton-associated proteins, it was possible to observe a tendency to increase in the phosphorylated residue (Ser396) at the higher concentrations, as well as alterations on actin and tubulin with an increase on acetylated-α tubulin. This effect can be translated by neuronal architectural and survival alterations. Therefore additional studies could contribute to a better understanding of the way that these chemokines act on AD pathogenesis.

O efeito do stress celular na proteína precursora de amilóide de Alzheimer = The effect of cellular stress on the Alzheimer's amyloid precursor protein

A proteína precursora de amilóide de Alzheimer (APP) é um factor chave na doença de Alzheimer (AD). Essencialmente o processamento da APP resulta na produção de Abeta, o peptídeo tóxico depositado nas placas de amilóide dos indivíduos com AD. Ainda permanece por esclarecer se o processamento da APP é afectado sob condições de stress celular, potencialmente aumentando a quantidade de Abeta produzida. Além disso, o stress celular pode induzir alterações moleculares, associadas à AD, que podem representar marcadores moleculares úteis para o diagnóstico da AD. Com estas questões em mente, procurámos identificar alterações, em resposta ao stress celular, no processamento da APP e na expressão de outras proteínas. Nestes estudos de monitorização considerámos que a fosforilação proteica anormal e o stress oxidativo podem contribuir para a condição patológica. Assim, investigámos o processamento da APP dependente da fosforilação durante o stress celular. Os dados obtidos confirmam que a secreção da APP é reduzida em situações de stress, e que o efeito é idêntico em linhas celulares de tipo neuronal e não neuronal. Os resultados obtidos revelam que o PMA, mesmo em situações de stress (azida de sódio 1 mM) pode afectar o processamento da APP, aumentando a produção de sAPP (o fragmento secretado após o processamento de APP) que pode potencialmente reduzir a produção de Abeta. A hipótese de afectar a produção de Abeta dependente da fosforilação, que por sua vez pode ter relevância num quadro clínico, mantém-se mesmo em condições de stress. Os resultados revelaram que a indução de sAPP, após a adição de ésteres de forbol, ou ácido ocadeíco, em condições de stress não é idêntica. Em contraste, sob condições controlo, tanto os ésteres de forbol como o ácido ocadeíco produzem o mesmo efeito em termos da produção de sAPP. Aparentemente estas duas vias podem ser dissociadas em condições de stress, o que de algum modo pode reflectir processamento alterado da APP em condições adversas. Nas experiências em que se analisou a expressão de outros potenciais marcadores moleculares, foram detectadas alterações nos níveis de expressão de várias proteínas. Estes marcadores moleculares representam alvos interessantes para futura validação e potenciais candidatos para um diagnóstico molecular na AD. As proteínas já identificadas são importantes do ponto de vista da transdução de sinais, e incluem a PP1, a HSP70, a PARP e a própria APP.

Parâmetros ecocardiográficos e variabilidade da frequência cardíaca em fêmeas caninas com sepse de ocorrência natural devido à piometra e suas correlações com valores séricos de TNF-alfa, IL-1 beta, IL-6, IL-10 e proteína C reativa

Pós-graduação em Medicina Veterinária - FCAV

Study the function of the newly discovered TrkB receptor fragment (TrkB-ICD) formed by calpain cleavage

Tese de mestrado, Neurociências, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2016

Variação da concentração de imunoglobulinas G e M, de proteína total e suas frações eletroforéticas e da atividade da gamaglutamiltransferase no soro sangüíneo de vacas holandesas, antes e após o parto

Com o objetivo de determinar a dinâmica do proteinograma sangüíneo e da atividade enzimática da gamaglutamiltransferase sérica de vacas antes e após o parto, foram utilizadas 26 vacas do período pré-parto até 180 dias após o parto, todas da raça Holandesa. Os resultados permitiram concluir que as vacas, no momento do parto, apresentam menores concentrações séricas de proteína total, das frações albumina e betaglobulina, bem como de imunoglobulinas G e M, do que nos períodos ante e pós-parto, apresentando, a partir dos nove dias pós-parto, elevação gradativa desses constituintes até os 180 dias após o parto. Não houve diferença na atividade da enzima gamaglutamiltransferase nos momentos estudados.

Diagnóstico de falha de transferência de imunidade passiva em bezerros através da determinação de proteína total e de suas frações eletroforéticas, imunoglobulinas g e m e da atividade da gama glutamil transferase no soro sangüíneo

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)