Identification of the cellular and molecular mechanism by which CD2AP, a regulator of neuronal intracellular transport contributes to the development of Alzheimer’s disease

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências,2014

A doença de Alzheimer (AD) foi identificada em 1907 pelo Dr. Alois Alzheimer. Trata-se de uma doença neurodegenerativa bastante complexa, sendo a maior causa de demência a nível mundial. Após mais de 100 anos de investigação na AD os únicos tratamentos alcançados apenas conseguem retardar a doença, e melhorar a qualidade de vida do paciente, por mais algum tempo. A neuropatologia é caracterizada pela presença no cérebro de placas de péptidos β-amilóide (Aβ) e aglomerados intraneuronais de formas hiperfosforiladas da proteína tau associada aos microtúbulos. Numa fase inícial da AD inicia-se a acumulação e oligomerização do péptido Aβ, tanto a nível extra como intracelular que causa disfunção das sinapses levando à perda de sinapses e neurónios. Os principais sinais e sintomas clínicos da AD são a perda de memória, de habilidades intelectuais, racionais e sociais gerando a perda de qualidade de vida do paciente, acabando por num estado avançado levar á perda total da autonomia e da própria identidade do paciente, até à morte. O péptido Aβ é um péptido de 39 a 43 aminoácidos produto do processamento sequencial da proteína precursora amilóide (APP) pelas enzimas β-secretase (BACE1) e posteriormente γ-secretase (via de processamento amilodoigénica). O processamento do APP origina dois péptidos Aβ40 ou Aβ42, sendo o último o responsável pelo efeito de toxicidade nos neurónios. A anormal acumulação de Aβ42 nos neurónios resulta de um desequilíbrio entre os níveis de produção e degradação do Aβ42. A produção do Aβ42 via o processamento de APP está dependende do encontro do APP e seus derivados com as secretases específicas do seu processamento nos endossomas. Sendo a desregulação do tráfego neuronal para os endosomas uma das causas possíveis para o desenvolvimento da AD. A AD está fortemente associada à idade sendo o envelhecimento celular o principal factor de risco para o seu desenvolvimento. A AD pode ser classificada em dois tipos, a AD de aparecimento precoce ou a AD de aparecimento tardio (também conhecida por tipo familiar ou esporádico respectivamente). Contudo, estão identificados outros factores de risco para a doença como factores genéticos; predisposição clínica, ou comportamentos de risco. Estudos de associação genética com a AD em populações de diversas regiões do globo, identificaram um conjunto de genes com forte associação à AD de aparecimento tardio. O polimorfismo rs9349407 do CD2AP foi um dos genes identificados como factor de risco para AD, p = 8.78E-07, odds racio (OR) = 1.08, 95 % intervalo de confiança. Cluster of Differentiation 2-Associated Protein (CD2AP) é uma proteína citoplasmática reconhecida pela sua função em células T, podócitos, ou pela sua interacção com actina. É referida como sendo uma proteína efectora da Rab4 na maturação dos endossomas. A função desempenhada nos neurónios e no desenvolvimento da AD é completamente desconhecida. O objectivo deste trabalho de dissertação é estudar o papel da proteína CD2AP nos mecanismos celulares e moleculares, que podem levar ao desenvolvimento da AD. A nossa hipótese biológica é que o CD2AP como regulador da via endocítica neuronal tem acção na acumulação de Aβ42 nos neurónios levando ao desenvolvimento da AD. Para estudar o CD2AP utilizamos uma linha celular de neuroblastoma de rato (N2a) e culturas primárias de neurónios (PN) de murganho (Balb-C). Iniciamos o estudo do CD2AP comprovando a expressão endógena do CD2AP nos neurónios primários e células N2a. Observamos uma distribuição homogénea do CD2AP no corpo celular e dendrites dos primários neurónios, e um enriquecimento junto á membrana plasmática e espiculas. Nos axónios a concentração de CD2AP era menor. Nas células N2a verificamos por imunofluorescência que o CD2AP se distribui por toda a célula com uma maior concentração na região perinuclear (PR). Para a subexpressão do CD2AP nas células utilizamos uma construção do CD2AP marcada por uma proteína de fluorescência verde (GFP-CD2AP), e uma segunda construção que possuí um codão stop após o segundo domínio SH3 (GFP-CD2AP(SH3)). Verificamos que o GFP-CD2AP nas células tem tendência a acumular-se junto á membrana plasmática e processos celulares, e que ao contrário da proteína endógena o GFP-CD2AP aglomera e forma grandes e brilhantes vesiculas. Verificamos também que os dois primeiros domínios do GFP-CD2AP(SH3) alteraram a dispersão do CD2AP pelas células. Tendo em conta a hipotese colocada utilizámos a técnica de transfecção de DNA e RNA de interferência alteramos a expressão do CD2AP nas células e analisámos os níveis de Aβ42 em células a sobrexpressar o CD2AP ou tratadas com siRNA contra CD2AP (subexpressando CD2AP). Detectámos um aumento significativo dos níveis de Aβ42 nas células a sobrexpressar CD2AP, de igual forma se registou o aumento de Aβ42 nas células a subexpressar CD2AP. Este resultado sugere que para CD2AP funcionar normalmente os seus níveis são regulados com precisão pelos neurónios sendo que excesso ou falta de CD2AP induz um aumento de Aβ42. Seguidamente, investigámos se o CD2AP regula o processamento do APP em PN e em células N2a, em células a sobrexpressar ou a subexpressar o CD2AP. Comprovámos por western blot que o CD2AP tem tendência a diminuir o processamento do APP. Sugerindo que o CD2AP regula o processamento do APP pela γ-secretase, reacção enzimática que forma o péptido Aβ. Por imunofluorescência analisámos o efeito do CD2AP na localização endossomal do APP e da BACE1 nas células N2a. Destacamos que em células N2a tratadas com siRNA-CD2AP ocorre um aumento do APP/CTFs transportado por endossomas positivos para Lamp1. Sugerimos que nas células que subexpressam CD2AP ocorre um aumento do encontro do APP/CTFs com a γ-secretase, levando ao aumento de produção do Aβ40/42. Porque o CD2AP esta descrito como tendo uma função reguladora da estrutura F-actina e que a F-actina participa na dinamica dos endosomas.Verificamos por imunofluorescência o efeito do CD2AP na regulação da F-actina nas células N2a e PN, comprovamos que as células tratadas com siRNA-CD2AP assumem uma morfologia differente com a presença de longas extensões da membrana plasmática, que poderam ser enormes filopodia ricas em F-actina, semelhantes às que se observam em zonas de crescimento de processos neuronais. Verificàmos também que os níveis de F-actina estão aumentados nas células que subexpressam siRNA-CD2AP. Em suma, comprovamos que o CD2AP é uma proteína com os níveis de expressão altamente regulados pela célula, que uma alteração dos níveis de expressão do CD2AP provoca um aumento da acumulação do Aβ42 nas células, possivelmente associado ao efeito do CD2AP na maturação dos endossomas e na regulação do citosqueleto de actina.

CD2AP is a cytoplasmatic protein known to be an effector of maturation of endosomes. Studies of genetic associations recognized CD2AP as a risk factor of Alzheimer’s disease. The intraneuronal accumulation of beta-amyloid 42 (Aβ42) peptide is a hallmark of early stage of Alzheimer’s disease. In this dissertation we studied the effect of CD2AP on the accumulation of cell associated Aβ42, in primary mouse neuronal culture (PN) from cerebral cortices of BALB/c mice with 16 days of gestation and a cell line of mouse neuroblastoma cells (N2a). Using cells, transiently transfected with CD2AP or treated with siRNA against CD2AP, we describe CD2AP effects on cells that may lead to development of Alzheimer’s disease. We found that the deregulation of CD2AP expression level lead to increase of Aβ42 in the cells. The Aβ42 is product from sequential processing of the amyloid precursor protein (APP) by β-secretase enzyme (BACE1) and next γ-secretase. Cells overexpressing or depleted for CD2AP have tendency to decrease mainly the levels of the C-terminal fragments (CTFs) of APP. We described in cells depleted for CD2AP an increase of APP/CTFs in late endosomes, suggesting that an increase in the meeting of APP with the γ-secretase. We analyzed the BACE1 endocytosis pathway in cells overexpressing CD2AP, we did not find significant differences in the distribution of BACE1. Knowing that CD2AP regulates actin polimerization, we studied the effect of CD2AP depletion in cells. CD2AP knockdown caused an increase in F-actin level and altered the morphology of cells. I suggest that the level of expression of CD2AP is highly regulated in the cell, and that the interaction of CD2AP in the maturation of cells leads to increase on cell associated Aβ42. Justifying CD2AP as risk factor for the AD.