Análise da variabilidade gênica de antígenos de T. cruzi com aplicação para o diagnóstico sorológico da doença de Chagas

A doença de Chagas é uma zoonose causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi. Estima-se que 8 milhões de pessoas estão infectadas com o T. cruzi em todo o mundo, principalmente na América Latina. Testes tradicionais de diagnóstico estão sendo gradualmente substituídos por métodos inovadores. A utilização de antígenos recombinantes foi proposta nos anos 90, e várias combinações foram testadas com soros de pacientes com diferentes formas clínicas de diferentes regiões da América Latina. Apesar do ganho em especificidade, estes testes apresentaram menor sensibilidade, frustrando expectativas. Este estudo objetivou analisar a variabilidade genética dos genes KMP11 e 1F8 que codificam antígenos comumente utilizados em diagnóstico experimental. Cepas de T. cruzi pertencentes a diferentes sub-grupos taxonômicos e de diferentes regiões foram analisadas para avaliar o impacto da variação antigênica em testes de diagnóstico. Maximizando a sensibilidade, evitar reatividade cruzada com epítopos de outros agentes patogênicos deve permitir a concepção de melhores testes rápidos. Num primeiro passo, DNA genômico foi extraído das seguintes cepas: Dm28c, Colombiana, Y, 3663, 4167, LL014 e CL Brener e foi realizada a amplificação dos genes 1F8 e KMP11 que codificam antígenos a partir destas cepas. Em seguida foram realizadas a clonagem, sequenciamento, expressão e detecção dos antígenos recombinantes. Na etapa final, análises de estruturas secundárias e terciárias, a última apenas para o antígeno 1F8, visualizaram as diferenças nas sequências de aminoácidos obtidas a partir de sequenciamento de DNA. Os resultados apresentados neste estudo mostram que o antígeno KMP11 de T. cruzi possui uma similaridade na sequência de aminoácidos muito elevada com o T. rangeli, mostrando a necessidade de um mapeamento antigênico desta proteína em todos os tripanosomatídeos que apresentaram alta similaridade com o antígeno de T. cruzi, como o T. rangeli, para verificar a presença de epítopos específicos de T. cruzi. O antígeno 1F8 pode ser uma ferramenta útil no diagnóstico da doença de Chagas e que será necessário aprofundar os conhecimentos sobre os determinantes antigênicos para futuramente elaborar poli-epítopos sintéticos adaptados de um maior número possível de antígenos, obtendo a maior especificidade e sensibilidade nos testes de diagnóstico sorológico e de teste rápido da doença de Chagas. Este estudo representa um passo crucial para a otimização de antígenos recombinantes para o diagnóstico da doença de Chagas.

Hanseníase neural, aspectos diagnósticos da forma neural pura e mecanismos imunopatogênicos da lesão do nervo na doença. Participação de quimiocinas CCL2 e CXCL10 e metaloproteinases 2 e 9

O diagnóstico da hanseníase neural pura baseia-se em dados clínicos e laboratoriais do paciente, incluindo a histopatologia de espécimes de biópsia de nervo e detecção de DNA de Mycobacterium leprae (M. leprae) pelo PCR. Como o exame histopatológico e a técnica PCR podem não ser suficientes para confirmar o diagnóstico, a imunomarcação de lipoarabinomanana (LAM) e/ou Glicolipídio fenólico 1 (PGL1) - componentes de parede celular de M. leprae foi utilizada na primeira etapa deste estudo, na tentativa de detectar qualquer presença vestigial do M. leprae em amostras de nervo sem bacilos. Além disso, sabe-se que a lesão do nervo na hanseníase pode diretamente ser induzida pelo M. leprae nos estágios iniciais da infecção, no entanto, os mecanismos imunomediados adicionam severidade ao comprometimento da função neural em períodos sintomáticos da doença. Este estudo investigou também a expressão imuno-histoquímica de marcadores envolvidos nos mecanismos de patogenicidade do dano ao nervo na hanseníase. Os imunomarcadores selecionados foram: quimiocinas CXCL10, CCL2, CD3, CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, CD68, HLA-DR, e metaloproteinases 2 e 9. O estudo foi desenvolvido em espécimes de biópsias congeladas de nervo coletados de pacientes com HNP (n=23 / 6 BAAR+ e 17 BAAR - PCR +) e pacientes diagnosticados com outras neuropatias (n=5) utilizados como controle. Todas as amostras foram criosseccionadas e submetidas à imunoperoxidase. Os resultados iniciais demonstraram que as 6 amostras de nervos BAAR+ são LAM+/PGL1+. Já entre as 17 amostras de nervos BAAR-, 8 são LAM+ e/ou PGL1+. Nas 17 amostras de nervos BAAR-PCR+, apenas 7 tiveram resultados LAM+ e/ou PGL1+. A detecção de imunorreatividade para LAM e PGL1 nas amostras de nervo do grupo HNP contribuiu para a maior eficiência diagnóstica na ausência recursos a diagnósticos moleculares. Os resultados da segunda parte deste estudo mostraram que foram encontradas imunoreatividade para CXCL10, CCL2, MMP2 e MMP9 nos nervos da hanseníase, mas não em amostras de nervos com outras neuropatias. Além disso, essa imunomarcação foi encontrada predominantemente em células de Schwann e em macrófagos da população celular inflamatória nos nervos HNP. Os outros marcadores de ativação imunológica foram encontrados em leucócitos (linfócitos T e macrófagos) do infiltrado inflamatório encontrados nos nervos. A expressão de todos os marcadores, exceto CXCL10, apresentou associação com a fibrose, no entanto, apenas a CCL2, independentemente dos outros imunomarcadores, estava associada a esse excessivo depósito de matriz extracelular. Nenhuma diferença na frequência da imunomarcação foi detectada entre os subgrupos BAAR+ e BAAR-, exceção feita apenas às células CD68+ e HLA-DR+, que apresentaram discreta diferença entre os grupos BAAR + e BAAR- com granuloma epitelioide. A expressão de MMP9 associada com fibrose é consistente com os resultados anteriores do grupo de pesquisa. Estes resultados indicam que as quimiocinas CCL2 e CXCL10 não são determinantes para o estabelecimento das lesões com ou sem bacilos nos em nervo em estágios avançados da doença, entretanto, a CCL2 está associada com o recrutamento de macrófagos e com o desenvolvimento da fibrose do nervo na lesão neural da hanseníase.

Um limite absoluto para o Direito? O princípio do dano e o problema da coação legítima

O princípio do dano, assim como elaborado por John Stuart Mill em On Liberty, é tido como elemento fundamental à afirmação do liberalismo a partir do século XIX e seu desenvolvimento rumo ao século XX. Diante das nascentes democracias européias foi afirmado como um princípio absoluto de proteção à liberdade individual contra a imposição da moralidade pela opinião pública e pelo Estado. Mill partilhava o apreço de Tocqueville pela democracia sem deixar de temer a tirania das maiorias. Inicialmente, investiga-se o lugar do princípio do dano na filosofia política milliana e as fragilidades apontadas por seus críticos. Em um segundo momento, analisa-se sua influência na defesa das liberdades civis na Inglaterra da década de 1950, especificamente com a edição do Relatório Wolfenden que defendeu a descriminalização de práticas homossexuais, bem como o debate que se lhe seguiu sobre os limites do Direito protagonizado por H.L.A. Hart. Na última parte, o objeto do estudo é o princípio do dano agora inserido em uma doutrina liberal-perfeccionista, assim como formulada por Joseph Raz em A Moralidade da Liberdade. O objetivo final é revelar a existência de incoerências internas no princípio do dano, tanto em sua versão original como nas que lhe sucederam, de modo a impedir a fixação de uma espaço imune ao Direito e à imposição da moralidade. No entanto, visto da perspectiva adequada, o fracasso na elaboração de tal princípio deve ser relativizado, eis que no seu devir o princípio do dano serviu à reflexão acerca dos limites da coerção legítima, bem como ao aprimoramento de conceitos relevantes à filosofia política como moralismo legal, paternalismo e perfeccionismo jurídicos.

Estudo de fatores prognósticos em pacientes submetidos ao transplante de medula óssea para tratamento de leucemia mielóide crônica.

O presente estudo compreende 96 transplantes de medula óssea (TMO) de doadores HLA-idênticos em pacientes portadores de Leucemia Mielóide Crônica, no período de Junho de 1986 a Junho de 1998. A autora selecionou diversas covariáveis para serem estudadas como fatores prognósticos de cinco desfechos principais: ocorrência de doença enxerto contra hospedeiro (DECH) aguda e crônica, incidência de recaída, sobrevida livre de doença (SLD) e sobrevida global (SG). As covariáveis estudadas foram: idade, sexo, escolaridade, tempo entre o diagnóstico e o transplante, fase da doença ao transplante, regime de condicionamente, profilaxia de DECH, compatibilidade de sexo entre doador e receptor, sexo do doador, tamanho do baço e do fígado, percentagem de blastos e número de plaquetas no sangue periférico na primeira consulta ao CEMO, ocorrência e grau de DECH aguda, ocorrência de DECH crônica e tempo para recuperação de plaquetas após o TMO. Não foi encontrada associação estatisticamente significativa num nível de 95% de confiança entre qualquer das covariáveis e a ocorrência de DECH crônica ou de recaída. A ocorrência de DECH aguda mostrou-se associada apenas com a fase da doença ao transplante. As covariáveis que se mostraram associadas com a sobrevida global e a sobrevida livre de doença foram: a percentagem de blastos no sangue periférico e tamanho do baço na primeira consulta ao CEMO, a fase da doença ao transplante, o tipo de profilaxia de DECH, a ocorrência e o grau de DECH aguda e o tempo para recuperação de plaquetas num nível acima de 20 x 103/mm3.

Análise comparativa do reconhecimento celular de antígenos dos subgêneros de Leishmania na leishmaniose tegumentar americana

Células Mononucleares do sangue periférico (CMSP) oriundas de 28 pacientes que residem em áreas endêmicas para Leishmania braziliensis foram estudados. Destes, 10 encontravam-se na fase ativa da doença e 18 curados clinicamente para as lesões de leishmaniose. As células foram cultivadas frente à antígenos de 6 espécies de Leishmania: Leishmania: L. (V.) braziliensis (LbAg), L. (V.) guyanensis (LgAg), L. (V.) lainsoni (LlAg), L. (V.) naiffi (LnAg), L. (L.) amazonensis (LaAg), L. (L.) chagasi (LcAg) e antígeno de concanavalina A como mitógeno. Os resultados foram expressos em índices de estimulação (IE). Temendo uma possível degradação protéica, os antígenos foram preparados com PBS e com PBS tampão antiproteolítico e o perfil eletroforético foi analisado através de SDS-PAGE. Os sobrenadantes das culturas foram estocados para os ensaios de ELISA para detecção de IFN-γ. A análise do perfil eletroforético dos antígenos de diferentes espécies de Leishmania demonstrou um padrão distinto e heterogêneo e aparentemente, não foi observada degradação assim que os antígenos foram preparados e 10 meses de estoque. Entretanto bandas parecem ser compartilhadas entre as espécies, que podem estar associadas a uma conservação de antígenos entre as espécies de Leishmania. A resposta proliferativa dos linfócitos (RPL) dos pacientes da forma ativa foi mais intensa para LbAg (1710,3), seguido de LnAg (177,6), LaAg (16,89,8) e LlAg (1410,1), e menos intenso para LgAg (11,46,6). Quando os IE obtidos para LbAg foram comparadas com outras espécies observou-se diferenças para LgAg (p<0.004) e LlAg (p<0.03). Não foram encontrados diferenças no perfil protéico dos extratos antigênicos produzidos com e sem inibidores de protease. Os estímulos obtidos de CMSP de indivíduos curados clinicamente não demonstraram diferenças quando comparados com aqueles da fase ativa da doença. O índice de estimulação (médiadesvio padrão) frente estímulos antigênicos pouco variou entre as espécies: LbAg - 22,222,2, LnAg - 15,911,5, LgAg - 20,720,6, LlAg - 14,710,1, LaAg - 15,1114,5 e L. chagasi - 13,78). A produção de IFN-γ quantificada nos sobrenadantes das culturas frente aos antígenos totais e solúvel mostrou níveis da citocina mais elevados quando utilizou-se antígenos total de L. guyanensis (568,1544,5; mediana: 518,5 pg/mL) quando comparadas às outras espécies analisadas. Porém quando analisadas o antígeno solúvel, podemos observar que tanto para os antígenos da espécie L. braziliensis quanto para L. naiffi, a fração total obteve os maiores índices de estímulos quando comparadas com a fração solúvel. Estes estudos sugerem que há uma reatividade cruzada entre as espécies dos subgêneros Viannia e Leishmania.

人外周血单核细胞来源的树突状细胞的体外

以人浓缩白细胞来源的CD14+单核细胞为前体,建立体外快速培养树突状细胞(dendritic cell,DC)的方法.采用密度梯度离心和MACS磁珠分选系统,收集高纯度的CD14+单核细胞;以rGM-CSF、rIL-4联合分化2天诱导不成熟DC,再将分化后的细胞以rTNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2共同活化2天得到成熟DC.流式细胞仪检测结果表明,分化2天的不成熟DC具有吞噬能力,且表型HLA-DR、CD40、CD80表达在80%以上,CD83、CD86基本小表达,成熟后的DC能够激活T细胞增殖,HLA-DR表达增高,CD83、CD86表达占85%.

Serological studies on oil sardine (Sardinella longiceps) and mackerel (Rastrelliger kanagurta)

An antiserum was raised in a rabbit against 0 panel red cells of mackerel. The erythrocytes of oil sardine and mackerel were tested against human blood typing sera anti A and B and also the test serum of rabbit which revealed the presence of antigens A and B. In addition, an antigen common to both the fishes and human A, B and 0 panel red cells was noted but not identifiable. The blood group B did not manifest itself clearly either in oil sardine or mackerel. The blood groups A, AB and 0 indicated the existence of genetically different groups of oil sardine and mackerel. Isoagglutinin tests revealed the presence of a reciprocal relationship with antigens A and B in both these fishes.

树突状细胞与HIV-1 辅助蛋白相互作用的体外研究——新的实验体系的建立与应用

树突状细胞（DC）是免疫系统中具有多种免疫功能的关键细胞，但在HIV/AIDS 患者 体内，虽有大量病毒及抗原存在，却不能有效地激发特异性免疫应答。最新的研究显示， HIV/AIDS 血源和性传染的途径虽有不同，但DC 均是早于T 细胞而最先遭受感染的“第一 靶细胞”。已知辅助蛋白（Nef、Rev、Tat、Vif、Vpr 和Vpu）是HIV-1 在宿主细胞内复制 和致病的根本因素。而哪种辅助蛋白、如何影响DC 功能，至今研究结果甚少，结论杂乱 不一。 本论文作为HIV-1 影响DC 功能研究的实验体系部分，旨在为系统比较研究6 个辅助 蛋白对DC 功能的调节和机理奠定基础。采用分子生物学和免疫学技术方法，把辅助蛋白 基因从DNA 和mRNA 水平导入目的细胞DC，在DC 前体及其分化、成熟的各个时相， 连续、动态地分析辅助蛋白对DC 特征性表面标志及免疫相关基因的表达水平、摄取和处 理抗原、激发和调控免疫应答等功能的影响，以期揭示HIV/AIDS 患者DC 功能明显异常 和失调的原因。 首先，分别将6 个辅助蛋白基因克隆到pEGFP-N2 和pCS2+表达载体，得到具有绿色 荧光蛋白融合基因的表达载体，将分别用于DNA 和mRNA 水平转染DC。再以K562 细胞 为模型建立mRNA 转染细胞的基本方法；以人外周血CD14 单核细胞为前体，建立了体外 “2＋2”快速诱导DC 的方法。最后，利用Amaxa 转染系统，从DNA 水平研究辅助蛋白对 DC 前体（单核细胞）的功能影响。发现单核细胞转染辅助蛋白与GFP 融合基因5h 后，胞 内蛋白大量表达，且能维持表达48h；其中Nef、Tat、Vpu、Rev、Vif、Vpr 表达效率分别 为35.42%、34.42%、43.42%、 17.07%、13.65%、10.29%；单核细胞转染基因后，表型 CD14、HLA-DR、CD80、CD83、CD86、DC-SIGN 没有明显的表达变化；转染Nef、Vpu、 Rev 辅助蛋白后，单核细胞有10％凋亡；Vpr 能抑制单核细胞IL-10 的分泌，Nef 能促进分 泌IL-6。 总之，通过构建辅助蛋白的表达载体，优化DC 的体外培养过程以及mRNA 转染方法， 并成功将辅助蛋白导入DC 前体，鉴定其表型和功能变化。为研究辅助蛋白影响DC 的功 能和机制建立了稳定而可行的实验系统。

A single amino acid defines cross-species reactivity of tree shrew (Tupaia belangeri) CD1d to human invariant natural killer T (iNKT) cells

P>The non-classical major histocompatibility complex (MHC) class I molecule CD1d presents lipid antigens to invariant natural killer T (iNKT) cells, which are an important part of the innate immune system. CD1d/iNKT systems are highly conserved in evoluti

SEROLOGICAL SURVEY OF A CAPTIVE MACAQUE COLONY IN CHINA FOR ANTIBODIES TO SIMIAN TYPE-D RETROVIRUSES

Sera from 510 macaques consisting of Macaca mulatta, Macaca assamensis, Macaca fascicularis, Macaca nemestrina, and Macaca arctoides were investigated for antibodies to simian AIDS type D retrovirus (SRV) by ELISA and Western blot with viral antigens purified from supernatants of SRV-1 infected cell cultures. Of these monkeys, 104 were seropositive by ELISA; only 23 were confirmed by Western blot. The true positive reaction to SRV was found in 15 of 463 (3.2%) M. mulatta and eight of eleven (72.7%) M. assamensis.

SECRETORY MONOCLONAL IGA ANTIBODY TO HUMAN SPERM PRODUCED BY GASTROINTESTINAL IMMUNIZATION INHIBITS HUMAN SPERM ACTIVITY AND MOUSE INVITRO FERTILIZATION

BALB/c mice were immunized intragastrically with human sperm. Cells from the Peyer's patches and spleens of the immunized mice were for the preparation of hybridomas secreting antisperm monoclonal IgA (mcIgA). The specific ratio of IgA-secreting cells in Peyer's patches was much higher than that in spleen. The binding site on human sperm of 9 of 19 mcIgA was in the post-acrosomal region using an immunofluorescent assay. Two of eight selected mcIgA caused strong human sperm agglutination and three of them produced significant inhibition of mouse in vitro fertilization. No mcIgA tested caused obvious human sperm immobilization or inhibited mouse in vivo fertilization. In vitro assembly of selected mcIgA in ascites with mouse secretory component (SC) caused no significant changes in effects on sperm function and in vitro fertilization. By use of Western blotting, dimer or higher polymers were demonstrated in all selected mcIgAs and corresponding protein antigens in 6 of 8 selected mcIgAs. These results suggest that human sperm function may be inhibited and fertilization rate reduced by specific secretory IgA to human sperm and that secretory immunity to protein antigens of human sperm could be induced by intragastrointestinal immunization.

人类白细胞抗原-DRB1与胃腺癌及其临床特征和幽门螺杆菌感染的相关性

目的　探讨人类白细胞抗原 (HLA) DRB1等位基因与胃腺癌及其临床特征和幽门螺杆菌(Hp)感染的关联性。方法　运用序列特异性引物聚合酶链反应和等位基因序列分析技术 ,检测无亲缘关系湖北省汉族健康人 136例、胃癌组 6 3例的HLA DRB1基因。内镜活检、Giemsa染色和 (或 )外周血ELISA检查胃黏膜Hp感染情况。SAS软件数据处理。 结果　HLA DRB10 90 1、12等位基因均与湖北省汉族人胃腺癌呈正相关 ;HLA DRB115等位基因则呈负相关。携带及非携带上述各等位基因患者 ,分

人类白细胞抗原DRB1和DQB1等位基因多态性与大肠癌的关联性

目的　探讨人类白细胞抗原HLA DRB1, DQB1等位基因与大肠癌遗传关联性。方法　运用序列特异性引物聚合酶链反应 ,结合等位基因序列分析 ,检测无亲缘关系的湖北籍汉族健康人136名、大肠癌组 5 4例患者的HLA DRB1、 DQB1基因。结果　大肠癌患者与正常人比较 ,HLA DRB1 0 90 1等位基因分布频率明显增高 (0 2 315、0 1397,P =0 0 33) ;而 DRB1 0 80X等位基因频率明显降低 (0 0 0 93、0 0 80 9,P =0 0 0 71)。两组间HLA

Establishment of a Chinese sturgeon Acipenser sinensis tail-fin cell line and its susceptibility to frog iridovirus

Chinese sturgeon Acipenser sinensis, a cartilaginous ganoid, is a 'living fossil' on a deeply isolated evolutionary branch. A cell line was established from Chinese sturgeon tail-fin tissue (CSTF) . These epithelial CSTF cells grew well in Dulbecco's modified Eagle's medium at 25 degrees C. Karyotypic analysis revealed a normal diploid karyotype with 2n = 264 and large numbers of punctate chromosomes. A strain of frog iridoviruses [Rana grylio virus (RGV)] was used to test the susceptibility of this cell line to infection. Infection was confirmed by cytopathic effect, immunofluorescence and electron-microscope observations, which detected the viral antigens or particles in the cytoplasm of RGV-infected cells. Molecular analysis further suggested that c. 550 bp DNA fragment could be cloned from the RGV-infected CSTF cells' DNA with major capsid protein gene polymerase chain reaction primers. Furthermore, after transfection with pEGFP vector DNA, the CSTF cell line produced significant fluorescent signals indicating its utility in exogenous studies.

Detection of cutaneous antibodies in excised skin explants from grass carp, Ctenopharyngodon idella (Valenciennes), immune to Scophthalmus maximus rhabdovirus

This study determined whether cutaneous antibodies were present in excised skin explants of grass carp, Ctenopharyngodon idella, immune to Scophthalmus maximus rhabdovirus (SMRV). Culture fluid from immune skin explants were assayed by indirect enzyme-linked immunosorbent assay (iELISA), Western blot, indirect immunofluorescent assay (IFA) and flow cytometry (FCM). iELISA showed that cutaneous antibody titres were much lower (1:12) than antiserum titres (1:1458) from intraperitoneally immunized grass carp. The phosphoprotein and matrix protein antigens of purified SMRV proteins were recognized by cutaneous antibodies from skin culture fluid using Western blot. The skin culture fluid produced staining signals in viral assembly sites and cytoplasm of SMRV-infected epithelioma papulosum cyprini (EPC) cells by IFA. FCM showed that 4.39% SMRV-infected EPC cells were detected, while non-specific reaction was seen in 2% of control cells. This is the first description of cutaneous antibodies against SMRV in grass carp.