Estudio molecular de los genes cdkn1b y cited2 en mujeres con falla ovárica prematura idiopática

En los últimos años el aumento sustancial de la incidencia de la infertilidad humana ha convertido esta patología en un problema real de salud pública: alrededor del 15% de las parejas consultan por esta causa. Entre las causas femeninas de infertilidad, la falla ovárica prematura (FOP) es extremadamente frecuente puesto que afecta entre el 1 y el 3% de las mujeres de la población general. Múltiples etiologías de FOP se han descrito (e.g. autoinmunes, infecciosas, iatrogénicas) pero desafortunadamente en más de 80% de los casos no se conocen las causas, lo que sugiere mecanismos genéticos subyacentes. Algunas causas genéticas se han descrito, especialmente relacionadas con formas sindrómicas de la enfermedad (e.g. síndromes de Turner y BPES). En estos casos se evidencian principalmente alteraciones cromosómicas y mutaciones específicas en genes participantes en la foliculogénesis. En otros casos, la presentación de la enfermedad es aislada y se relaciona con mutaciones en genes específicos localizados en los autosomas y en el cromosoma X. Sin embargo, la complejidad genética, la baja heredabilidad y el carácter cuantitativo de los fenotipos asociados a la reproducción en los mamíferos implica que en casos fisiológicos y patológicos (hipofertilidad e infertilidad) cientos de genes participen en una red de sutil regulación. En este contexto, recientemente se han propuesto una cantidad significativa de genes candidato para la FOP. Por consiguiente el estudio de genes potencialmente candidatos en la etiología de la FOP por aproximaciones gen candidato, entre ellos CDKN1B y CITED2, es de especial interés en la comprensión de los mecanismos subyacentes de esta en enfermedad. Además, es una etapa necesaria en la búsqueda de nuevos marcadores de esta patología que permitan en un futuro mejorar el asesoramiento genético y proponer alternativas terapéuticas. Durante este trabajo de tesis nos hemos focalizado en la búsqueda de variantes en la secuencia codificante de CDKN1B y CITED2 en mujeres FOP. Nuestros resultados sugieren que estos genes son dos nuevos factores etiológicos de la enfermedad.

Secuenciación de siguiente generación en mujeres afectadas por falla ovárica prematura no sindrómica para la identificación de nuevos genes etiológicos de la enfermedad y estudio funcional de la mutación p.thr943ile en adamts19

La infertilidad afecta en la actualidad a aproximadamente 1 de cada 7 parejas a nivel mundial. La falla ovárica prematura (FOP) es una condición común en la población femenina, afectando al 1% de mujeres menores de 40 años. La etiología de la FOP es idiopática entre el 50% y el 80% de los casos, lo que sugiere causas genéticas, epigenéticas y ambientales aún desconocidas. A pesar de los avances en las técnicas de cartografía genética y de sistematización de la técnica de Sanger, pocos genes etiológicos de FOP fueron identificados en los últimos 20 años. Este fracaso relativo se asoció principalmente a que cientos de genes, que abarcan grandes regiones del genoma, son candidatos pero la técnica de secuenciación directa sólo permite el análisis de unas 700bp en cada reacción. En el presente trabajo se empleó la secuenciación de siguiente generación (NGS) para la búsqueda de mutaciones en 70 genes candidatos que potencialmente contribuyen con el desarrollo de la patología. Se identificaron mutaciones en 3 de 12 pacientes. La paciente POF-7 presentaba una mutación no sinónima en el gen ADAMTS19 (c.2828C>T, p.Thr943Ile). La proteína ADAMTS19 se clasifica dentro de la familia ADAMTS como huérfana ya que no se ha identificado su sustrato. Mediante el sistema de doble hibrido en levaduras se buscó identificar las potenciales proteínas que interactúan con ADAMTS19. Permitió identificar, a partir de las versiones murinas, la interacción de Adamts19 y Col6a2. Para comprobar la interacción entre las proteínas ADAMTS19 y COL6A2 humanas se empleó el sistema de doble hibrido en células eucariotas. Los hallazgos no permitieron replicar los resultados obtenidos previamente. En síntesis de identificó una mutación potencialmente causal de FOP en un gen nuevo y una muy probable interacción entre ADAMTS19 y COL6A2.

Búsqueda de mutaciones en el gen foxo4 en pacientes con falla ovárica prematura no-sindrómica

FOXO4 constitutes a coherent candidate gene associated with premature ovarian failure (POF) pathogenesis. This study sequenced the coding and exon-flanking regions of this gene in a panel of 116 POF patients and 143 controls of Tunisian origin. In both groups, the IVS2 + 41T > G sequence variant was identified. It is concluded that coding mutations of FOXO4 should not be a common cause of the disease in women from the Tunisian population. However, this study cannot exclude that FOXO4 dysfunctions, originated from open reading frame or promoter sequence variations, might be associated with the pathogenesis of the disease in other ethnical groups.

La variante c.-9C>G del promotor de BMP15 está asociadad a la etiología de la falla ovárica prematura no-sindrómica

La falla ovárica prematura es una enfermedad común que conduce a la infertilidad femenina y cuya etiología no es identificable en más del 50% de los casos, lo cual sugiere un origen genético en la patogénesis de esta enfermedad. La función crucial del gen BMP15 en la biología de la reproducción fue propuesta cuando modelos KO de ratón y mutaciones naturales en ovejas revelaron fenotipos ováricos específicos. Aunque la secuenciación de la región codificante de BMP15 en grandes paneles de pacientes afectadas con Falla Ovárica Prematura (FOP) ha identificado algunas mutaciones, estas variaciones explican una baja proporción de casos. Nosotros hipotetizamos que una variante en la secuencia reguladora (promotor BMP15) podrían estar asociada a la etiología de la FOP no-sindrómica. Con la evidencia de los estudios previos que sugirieron la potencial implicación de la variante de secuencia c.-9C>G del promotor de BMP15 en los fenotipos reproductivos incluyendo FOP, evaluamos si este polimorfismo podría modificar las propiedades de transactivación de un factor de transcripción específico. Empleamos aproximaciones in-silico para predecir potenciales sitios de unión a factores de transcripción (TFBS: Transcription Factor Binding Sites) en la región 5´ de BMP15. El ensayo reportero de luciferasa se usó para determinar la modificación de la transacativación del promotor de BMP15 causada por la variante de c-9C>G. Se demostró que aunque los dos constructos del promotor de BMP15 (BMP15- prom-G and BMP15-prom-C) fueron transactivados por el factor de transcripción PITX1, el constructo BMP15- prom-G aumentó 1.6 veces la actividad transcripcional del factor de transcripción de una manera estadísticamente significativa. Por otro lado, se demostró por primera vez que BMP15 y PITX1 son co-expresados en tejido ovárico de humano y de ratón.

Insuficiência ovárica prematura

Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2014

"Genome-Wide Linkage in a Highly Consanguineous Pedigree Reveals Two Novel Loci on Chromosome 7 for Non-Syndromic Familial Premature Ovarian Failure"

Background: The human condition known as Premature Ovarian Failure (POF) is characterized by loss of ovarian function before the age of 40. A majority of POF cases are sporadic, but 10–15% are familial, suggesting a genetic origin of the disease. Although several causal mutations have been identified, the etiology of POF is still unknown for about 90% of the patients. Methodology/Principal Findings: We report a genome-wide linkage and homozygosity analysis in one large consanguineous Middle-Eastern POF-affected family presenting an autosomal recessive pattern of inheritance. We identified two regions with a LODmax of 3.26 on chromosome 7p21.1-15.3 and 7q21.3-22.2, which are supported as candidate regions by homozygosity mapping. Sequencing of the coding exons and known regulatory sequences of three candidate genes (DLX5, DLX6 and DSS1) included within the largest region did not reveal any causal mutations. Conclusions/Significance: We detect two novel POF-associated loci on human chromosome 7, opening the way to the identification of new genes involved in the control of ovarian development and function.

Risco de falência prematura da função ovárica em doentes com lúpus eritematoso sistémico associada ao tratamento imunomodulador com ciclofosfamida intravenosa : caracterização de uma população e revisão sistemática da literatura

Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2014

Caracterização de alterações epigenéticas no gene JARID1C e desequilíbrios genéticos como causas do retardo mental ligado ao x de etiologia idiopática

O retardo mental (RM) é caracterizado por um funcionamento intelectual significantemente abaixo da média (QI<70). A prevalência de RM varia entre estudos epidemiológicos, sendo estimada em 2-3% da população mundial, constituindo assim, um dos mais importantes problemas de saúde pública. Há um consenso geral de que o RM é mais comum no sexo masculino, um achado atribuído às numerosas mutações nos genes encontrados no cromossomo X, levando ao retardo mental ligado ao X (RMLX). Dentre os genes presentes no cromossomo X, o Jumonji AT-rich interactive domain IC (JARID1C) foi recentemente identificado como um potencial candidato etiológico do RM, quando mutado. O JARID1C codifica uma proteína que atua como uma desmetilase da lisina 4 da histona H3 (H3K4), imprescindível para a regulação epigenética. Tão recente como a identificação do gene JARID1C, é a descoberta de que mudanças no número de cópias de sequências de DNA, caracterizadas por microdeleções e microduplicações, poderiam ser consideradas como razões funcionalmente importantes de RMLX. Atualmente, cerca de 5-10% dos casos de RM em homens são reconhecidos por ocorrerem devido a estas variações do número de cópias no cromossomo X. Neste estudo, investigamos mutações no gene JARID1C, através do rastreamento dos éxons 9, 11, 12, 13, 15 e 16, em 121 homens de famílias com RM provavelmente ligado ao X. Paralelamente, realizamos a análise da variação do número de cópias em 16 genes localizados no cromossomo X através da técnica de MLPA no mesmo grupo de pacientes. Esta metodologia consiste em uma amplificação múltipla que detecta variações no número de cópias de até 50 sequências diferentes de DNA genômico, sendo capaz de distinguir sequências que diferem em apenas um nucleotídeo. O DNA genômico foi extraído a partir de sangue periférico e as amostras foram amplificadas pela técnica de PCR, seguida da análise por sequenciamento direto. Foram identificadas três variantes na sequência do gene JARID1C entre os pacientes analisados: a variante intrônica 2243+11 G>T, que esteve presente em 67% dos pacientes, a variante silenciosa c.1794C>G e a mutação inédita nonsense c.2172C>A, ambas presentes em 0,82% dos indivíduos investigados. A análise através do MLPA revelou uma duplicação em um dos pacientes envolvendo as sondas referentes ao gene GDI1 e ao gene HUWE1. Este trabalho expande o estudo de mutações no gene JARID1C para a população brasileira ereforça a importância da triagem de mutações neste gene em homens portadores de RM familiar de origem idiopática, assim como, é primeiro relato científico relativo à investigação de variações no número de cópias de genes localizados no cromossomo X em homens brasileiros com RM, através da técnica de MLPA.

Níveis elevados de IL-6 no fluido gengival de pacientes com periodontite crônica e retrocolite ulcerativa idiopática

O nosso objetivo foi mensurar os níveis de Interleucina-6 (IL-6) no fluido gengival de pacientes com periodontite e doença inflamatória intestinal (DII), comparando-os com pacientes sistemicamente saudáveis, com periodontite. Como objetivo secundário será avaliada a IL-6 no soro desses pacientes. Foram selecionados 15 pacientes com doença de Crohn (DC, idade média 38.2, DP 11.4 anos), 15 com retrocolite ulcerativa idiopática (RCUI, 45.0 10.5 anos) e 15 pacientes saudáveis (C, 42.1 7.8 anos). A Profundidade de bolsa (PB), nível de inserção clínica (NI), presença de placa e de sangramento a sondagem foram avaliados em seis sítios por dente. O fluido gengival foi coletado de quatro sítios com periodontite (PP: PB ≥ 5mm, NI ≥ 3mm) e quatro sítios com gengivite (GP: PB ≤ 3mm e NI≤ 1mm), em dentes diferentes, com pontas de papel absorvente pré-fabricadas. O soro destes pacientes também foi coletado. A análise da IL-6 foi realizada pelo LUMINEX. A quantidade total e concentração da IL-6 estavam significantemente maiores no fluido gengival dos sítios PP do grupo RCUI quando comparados aos sítios PP do grupo controle (p=0.028; p=0.044, respectivamente). O grupo DC apresentou a quantidade total de IL-6 significantemente maior no sítio PP do que no GP (p=0.028). Já no soro, a IL-6 não diferiu entre os grupos. Sendo assim, pode-se concluir que os indivíduos com retrocolite ulcerativa idiopática apresentavam níveis mais altos de IL-6 nos sítios com periodontite, o que pode indicar um importante papel dessa citocina no estabelecimento e progressão da doença periodontal nesses pacientes.

Anos de vida perdidos por morte prematura por causas externas: análise da tendência e uma proposta metodológica para redistribuição dos códigos-lixo

A violência é considerada uma questão social, ou ainda, um fenômeno social e histórico, que ocorre nas diversas formas de relações humanas e que pode se manifestar em atos individuais ou institucionais, ou seja, realizados por pessoas, grupos, nações, com o objetivo de provocar algum dano físico ou psicológico em outrem. O termo violência, no presente trabalho, refere-se às mortes por causas externas, que incluem as mortes intencionais e as mortes não intencionais, ou seja, agressões, suicídios e acidentes em geral. O objetivo é analisar a evolução da carga de mortalidade no estado do Rio de Janeiro e propor a realocação dos óbitos cuja intenção é indeterminada através de uma nova metodologia. Os dados utilizados são provenientes do Sistema de Informações sobre Mortalidade. Neste estudo, foi utilizado o indicador YLL (Years of Life Lost Anos de Vida Perdidos) na avaliação do comportamento das causas violentas ao longo do tempo, no período de 1996 a 2009, para as macrorregionais de saúde do estado do Rio de Janeiro, através de modelos de efeitos mistos. Foi aplicada a regressão logística multinomial nos óbitos com causa básica conhecida, utilizando as informações como lesões e características individuais das vítimas, para prever qual seria a causa básica de morte nos registros indeterminados com características semelhantes aos óbitos com causas conhecidas. Os resultados encontrados mostram que a violência aumentou em regiões do interior do estado, com destaque para a macrorregional Norte. Na capital e nas regiões metropolitanas, houve uma estabilização das taxas, com exceção para as mortes por agressão que sofreram queda, porém as taxas de YLL permaneceram elevadas. As duas metodologias de realocação, da Carga de Doença e desta nova proposta, aumentam todas as taxas de mortalidade por grupo de causas, porém o grupo que sofreu maior impacto foi o de quedas. Os resultados encontrados, apesar das limitações, apontam para uma proposta de combinação das duas metodologias. Para os óbitos com causa básica de Y10 (Envenenamento [intoxicação] por e exposição a analgésicos, antipiréticos e anti-reumáticos nãoopiáceos, intenção não determinada) a Y33 (Outros fatos ou eventos especificados, intenção não determinada), seria utilizada a metodologia da Carga de Doenças e, para os óbitos de Y34 (Fatos ou eventos não especificados e intenção não determinada), seria utilizado o método proposto.

Mutações no gene JARID1C e rearranjos subteloméricos como causas de deficiência intelectual familiar de etiologia idiopática

A Deficiência Intelectual (DI) é uma condição complexa, que acomete 2-3% da população mundial, constituindo um importante problema de saúde pública. No entanto, uma parcela significativa dos casos de DI permanece sem um diagnóstico definitivo, o que demonstra que muitos fatores etiológicos associados a esta condição ainda precisam ser elucidados. Há um consenso de que o número de homens com DI supera em 30% o número de mulheres, um achado atribuído à presença de mutações em genes localizados no cromossomo X. Dentre os genes presentes neste cromossomo que são expressos no cérebro, o Jumonji AT-rich interactive domain 1C (JARID1C) foi identificado como um potencial candidato a estar relacionado à DI ligada ao X (DILX). O gene JARID1C codifica uma desmetilase da lisina 4 da histona H3 (H3K4), imprescindível para a regulação epigenética. Tão importante quanto o estudo do gene JARID1C em pacientes com DI é a busca por variações no número de cópias gênicas (VNCs) em regiões cromossômicas subteloméricas. Genes relacionados ao desenvolvimento cerebral são enriquecidos em VNCs e as regiões subteloméricas são mais susceptíveis à formação destes rearranjos. Diante do exposto, neste estudo, investigamos mutações no gene JARID1C (exons 3, 4, 5, 8, 10, 14 e 23) em 148 homens portadores de DI pertencentes a famílias com padrão de segregação sugestivo de DILX. Paralelamente, analisamos VNCs subteloméricas em 174 homens com DI familiar de etiologia idiopática, independente do padrão de segregação. Para todos os indivíduos selecionados, amostras de DNA genômico foram extraídas a partir de sangue periférico e alterações genéticas frequentemente relacionadas à DI foram previamente excluídas (expansões trinucleotídicas nos loci FRAXA e FRAXE e mutações nos genes MECP2 e ARX). A análise do gene JARID1C foi realizada pela técnica de PCR, seguida da análise dos produtos amplificados por sequenciamento. Foram identificadas quatro variantes silenciosas (c.564G>A, c.633G>C, c.1884G>A, c.1902C>A). Através da análise in silico de sequências exônicas acentuadoras de splicing (ESEs) localizadas nas posições das variantes encontradas, foi possível classificar a variante c.1884G>A como neutra e as três variantes restantes como possíveis criadoras de ESEs. Já para a investigação das VNCs subteloméricas, foi utilizada a metodologia de Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA), capaz de identificar microdeleções e microduplicações nas 46 regiões subteloméricas. Para este fim, inicialmente, os indivíduos foram investigados pelo kit de MLPA P036, enquanto que para aqueles que exibiram alterações também foi utilizado o kit P070. A validação das VNCs encontradas foi realizada por PCR quantitativo em Tempo Real. A análise por MLPA revelou um indivíduo apresentando duas deleções (9p e 13q), um indivíduo apresentando duas amplificações (1p e 2p), dois indivíduos apresentando uma deleção e uma amplificação (18p e 18q; 4p e 8p), quatro indivíduos portadores de uma deleção cada (10p, 20p, 3q e 22q) e dois indivíduos com uma amplificação cada (7q e 20p). Algumas das alterações subteloméricas encontradas (2,87%) representam VNCs de relevância clínica para o estudo da DI, reforçando a importância do rastreamento de rotina de VNCs subteloméricas na DI familiar. Consideramos que a elucidação de novos genes ou mecanismos moleculares diretamente relacionados à DI é um caminho promissor e urgente para o estabelecimento de novas estratégias terapêuticas possíveis.

Estudio de la etiología genética de la insuficiencia ovárica primaria (POI): genes FMR1 Y FMR2

243 p.

Análise clínica e molecular em indivíduos com deficiência mental idiopática no Maranhão: diagnóstico diferencial da síndrome do X frágil

O retardo mental (RM) representa um problema de saúde pública mundial ainda negligenciado no Brasil e, em especial nas regiões mais pobres como o Nordeste. A síndrome do X frágil (SXF) é uma das formas mais estudadas de RM hereditário em seres humanos. Esta doença monogênica, de herança ligada ao X dominante, é decorrente de uma mutação no exon 1 do gene FMR1, localizado na região Xq27.3. A mutação no FMR1 se caracteriza pelo aumento de repetições de trinucleotídios CGG em tandem na região 5 UTR desse gene, sendo a expansão dessas trincas o principal evento mutacional responsável pela SXF. De maneira geral, os fenótipos cognitivos de indivíduos do sexo masculino com a síndrome incluem deficiência intelectual de moderada à grave. No presente trabalho, realizamos um estudo transversal da SXF em indivíduos portadores de retardo mental de causa desconhecida, engajados em Programas de Educação Especial e em instituições psiquiátricas de São Luís-MA, rastreando amplificações de sequências trinucleotídicas no gene FMR1. A amostra foi composta por 238 indivíduos do sexo masculino, não aparentados, na faixa etária de 4 a 60 anos (média = 21 9 anos). O DNA dos participantes foi obtido a partir de 5 mL de sangue coletados em tubos com anti-coagulante EDTA e a análise molecular da região gênica de interesse foi realizada através da reação em cadeia da polimerase, utilizando-se três primers. Dentre os indivíduos triados quanto à presença de mutações no gene FMR1, apenas um apresentou um resultado inconclusivo e 2 (0,84%) foram positivos para a SXF, sendo que um deles (3503) apresentou mais de 200 repetições CGG no locus FRAXA e o outro indivíduo (3660) apresentou uma deleção de ~197 pb envolvendo parte das repetições CGG e uma região proximal às repetições CGG. Ambos possuíam história familiar de RM ligado ao X. No indivíduo 3503 observamos as seguintes características clínicas: temperamento dócil, orelhas grandes, mandíbula proeminente e flacidez ligamentar. O indivíduo 3660 apresentava hiperatividade, contato pobre com os olhos, orelhas grandes, mandíbula proeminente, pectus excavatum, macroorquidismo e pouca comunicação. O esclarecimento sobre a doença oferecido às famílias de ambos contribuiu sobremaneira para o entendimento da condição, do prognóstico e dos riscos de recorrência. A prevalência da SXF em nossa amostra, 0,84%, embora relativamente baixa, encontra-se na faixa de incidência de casos diagnosticados em outras populações que, em sua maioria, relatam incidências variando de 0 a 3%. Em parte, atribuímos o percentual encontrado aos critérios de inclusão utilizados em nosso estudo. Concluímos que o protocolo de triagem molecular utilizado em nosso estudo se mostrou eficiente e adequado para a realidade do Maranhão, podendo constituir uma ferramenta auxiliar a ser aplicada na avaliação de rotina dos portadores de RM, com grandes benefícios para o Estado.

Artrite idiopática juvenil

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Medicina Dentária

O impacto de um programa de exercícios com o Inspirómetro de Incentivo na função pulmonar em doentes com Escoliose Idiopática

Introdução: A escoliose é uma deformidade vertebral muito comum e de grande importância social. A etiologia da escoliose idiopática da adolescência é desconhecida e descrita como multifatorial. Segundo a literatura existe uma forte correlação entre a função pulmonar anormal e a gravidade da deformidade da coluna vertebral. Tem sido proposto como abordagem terapêutica o uso de Inspirómetro de Incentivo, contudo, ainda se encontra incerto a sua eficácia nesta patologia. Objetivo: Analisar o impacto de um programa de exercícios domiciliários com o Inspirómetro de Incentivo em doentes com Escoliose Idiopática nos volumes pulmonares e na força muscular dos músculos respiratórios. Metodologia: Foram avaliados, por meio de um estudo experimental, 12 indivíduos do sexo feminino (com média e desvio padrão correspondentes a 15,1 e 1,6 respetivamente) com diagnóstico de Escoliose Idiopática antes e 3meses após a cirurgia corretiva e 12 indivíduos saudáveis também do sexo feminino (com média e desvio padrão correspondentes a 15,2 e 1,4 respetivamente). A função pulmonar foi avaliada através do espirómetro computorizado Spinolab®, a força dos músculos respiratórios avaliou-se através da mensuração da PImáx e PEmáx com o Microrpm®. Para finalizar a avaliação o participante foi sujeito a aplicação do THRESHOLD® com 30% da PImáx obtida. O protocolo domiciliário, referente à parte experimental, baseou-se no uso bi-diário do Inspirómetro de Incentivo Respiflo FS®, que foi fornecido aos participantes no dia da alta hospitalar. Resultados: Foram encontrados valores menores da função respiratória e força muscular (p<0,05) no grupo de doentes com Escoliose em relação ao grupo dos Saudáveis, excepto em relação ao Índice de Tiffeneau (p=0,17). No entanto, quando se comparou o grupo Controlo e o Grupo Experimental não severificaram diferenças estatisticamente significativas em relação às variáveis estudadas. Por fim, na análise dos parâmetros nos dois momentos de avaliação (inicial e final) entre o grupo dos Saudáveis e grupo Experimental verificou-se que existiam diferenças estatisticamente significativas ao nível da CFV (pi=0,02; pf=0,00), FEV1 (pi=0,01; pf=0,00) e PImáx inicial (p=0,02) e PImáx th inicial (p=0,03). Conclusão: A função pulmonar e a força dos músculos respiratórios em indivíduos com diagnóstico de Escoliose Idiopática encontra-se diminuída quando comparada com uma população saudável. Dentro das condições propostas no presente estudo, verificou-se que a aplicação de um programa de exercícios com o Inspirómetro de Incentivo com duração de 3 meses não revela resultados significativos ao nível da função pulmonar e da força dos músculos respiratórios.