Qual o papel das células natural killer na infeção por VIH-SIDA

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

Salivary proteomics and peptidomics of type 1 diabetes Mellitus

A Diabetes Mellitus (DM) compreende um conjunto de desordens metabólicas comuns caracterizadas por hiperglicemia, que afeta diferentes órgãos do organismo. Ao longo do tempo, ocorrem danos microvasculares no glomérulo renal, retina e nervos periféricos, bem como doença macrovascular nas artérias. A composição da saliva também é afetada pela DM, com consequências na homeostasia oral. No entanto, o proteoma e o peptidoma salivar têm sido pouco explorados na DM tipo 1 e nas suas complicações crónicas. Tendo em conta o crescente interesse na saliva como fluido diagnóstico, o objetivo principal deste trabalho foi avaliar os eventos proteolíticos subjacentes à DM tipo 1 e às suas complicações microvasculares, bem como, caracterizar as alterações induzidas pela DM tipo 1 no proteoma e peptidoma salivar. A DM tipo 1 e particularmente as complicações microvasculares associadas modulam o perfil proteolítico dos fluidos biológicos, com diferenças significativas de atividade observadas na urina e saliva, atribuídas principalmente ao complexo Metaloproteinase da Matriz (MMP)-9/lipocalina associada à gelatinase de neutrófilos, aminopeptidase N, azurocidina e calicreína 1. O aumento da atividade proteolítica observado na saliva total dos diabéticos resultou no aumento da percentagem de péptidos, principalmente de um número acrescido de fragmentos de colagénio do tipo I, refletindo possivelmente um estado inflamatório crónico dos tecidos orais e periodontais. O peptidoma também corrobora uma maior suscetibilidade das proteínas salivares, especificamente, das proteínas ricas em prolina básicas (bPRP) 1, bPRP2 e proteínas ricas em prolina ácidas (aPRP) à proteólise, evidenciando a geração de fragmentos de proteínas associadas à ligação a bactérias. A análise do proteoma salivar baseada em iTRAQ mostrou uma sobre-expressão de L-plastina, fator do adenocarcinoma do pâncreas e das proteínas S100-A8 e S100-A9, enfatizando a importância do sistema imune inato na patogénese da DM tipo 1 e das complicações microvasculares associadas. A análise integrada de todas as proteínas expressas diferencialmente entre os pacientes diabéticos com ou sem complicações microvasculares e indivíduos saudáveis foi realizada com o STRING, onde se observam três conjuntos funcionalmente ligados, um compreende a interação entre o colagénio tipo I, colagénio tipo II e MMP-9, um segundo conjunto envolve a MMP-2 e o colagénio de tipo I e um terceiro conjunto composto por proteínas salivares e inflamatórias. Estes conjuntos estão associados com as vias Kegg de interação recetor-matriz extracelular, de adesão focal e migração transendotelial dos leucócitos. Por outro lado, a análise do proteoma e peptidoma salivar destacou potenciais biomarcadores para o diagnóstico e prognóstico da DM tipo 1 e das suas complicações.

Human factors required for mycobacterium tuberculosis macrophage infection

Tese de doutoramento, Farmácia (Biologia Celular e Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2014

Host-symbiont interactions in the deep-sea vent mussel Bathymodiolus azoricus : a molecular approach

Tese de Doutoramento, Ciências do Mar, especialidade de Biologia Marinha, 19 de Dezembro de 2015, Universidade dos Açores.

A Ponta do Iceberg: Manifestações Cutâneas de Patologia Pediátrica com Envolvimento Neurológico

Introdução: Algumas alterações cutâneas podem ser as primeiras manifestações clínicas de diversas entidades nosológicas com atingimento sistémico. O presente trabalho tem como objectivo rever a semiologia dermatológica relevante no contexto das doenças com envolvimento neurológico na infância. Material e Métodos: Revisão dos artigos indexados à MedLine publicados nos últimos 12 anos e com relevância para o tema. Resultados: Os principais grupos nosológicos relevantes para o tema compreendem as genodermatoses (com destaque para as síndromes neurocutâneas), as alterações da pigmentação, as doenças vasculares, as endócrinas, os défices enzimáticos congénitos e os disrafismos espinhais ocultos. Discussão: O reconhecimento da semiologia cutânea específica é importante pois pode permitir um diagnóstico muito mais precoce.

Caracterização bioquímica de metaloproteinases de parasitas tripanosomatídeos

A identificação e caracterização de processos mediados por metaloproteinases de uma grande variedade de eucariotas está a avançar rapidamente, tanto a nível molecular como celular – e os muitos papéis que as proteases desempenham nestes organismos estão a ser trazidas para o foco. As metaloproteinases de matriz executam tarefas de ―housekeeping” comuns a muitos organismos, bem como funcionam a um nível muito mais específico no ciclo de vida dos parasitas, por exemplo. Papéis pivotais foram propostos em diferentes processos, como invasão e egressão de células, enquistação e desenquistação, catabolismo de proteínas, diferenciação, progressão do ciclo celular, citoaderência, e ainda estimulação e evasão ao sistema imune. No presente estudo, é feito o reconhecimento e a caracterização de metaloproteinases de dois diferentes extractos de parasitas protozoários: Trypanosoma brucei brucei e Leishmania infantum. A classificação de metaloproteases foi obtida a partir da inibição diferencial da actividade destas proteases sobre diferentes substratos (gelatina e caseína), tendo sido efectuada uma prospecção de inibidores selectivos com potencial para serem empregues em novas estratégias de quimioterâpeutica contra estes agentes. Adicionalmente, é feito um estudo bioinformático sobre uma metaloproteinase comum aos parasitas aqui abordados, alargando o estudo a outros organismos relacionados. Os resultados obtidos demonstram a presença de metaloproteinases capazes de degradar proteínas de matriz em ambos os extractos estudados, sendo possível inibir a sua actividade com concentrações relativamente moderadas de inibidores. Além disso, sugerem que em todos os eventos patológicos abordados neste estudo, a presença de metaloproteinases activas é estável no seu ciclo de vida e provavelmente na progressão da patologia provocada pelos diferentes agentes em estudo. A análise de todos os resultados e observações poderá possivelmente levar à identificação e integração de elementos comuns nos processos de invasão celular e progressão parasitária aqui abordados. Por essa razão, a compreensão destas interacções permanece um desafio importante.

Custos indirectos associados à obesidade em Portugal

RESUMO - A obesidade constitui um importante problema de saúde pública com consequências económicas de grande dimensão. Os obesos têm um risco acrescido de contrair doenças e de sofrer morte prematura devido a problemas como a diabetes, hipertensão arterial, AVC, insuficiência cardíaca e algumas neoplasias malignas. O presente estudo tem como objectivo estimar o custo económico indirecto (valor da produção perdida) associado à obesidade em Portugal no ano de 2002. O estudo adopta uma abordagem tipo custos da doença baseada na prevalência. Os dados são retirados do Inquérito Nacional de Saúde e estatísticas de rotina publicadas pelo INE e por outros organismos oficiais. Consideram-se como obesas pessoas com índice de massa corporal (IMC) ≥ 30 kg/m2 e estabelecem-se como limites etários para participação em actividades económicas produtivas as idades compreendidas entre os 15 e os 64 anos. A estratégia de imputação de custos ao factor de risco obesidade caracteriza- se por estimar, para a população portuguesa, as proporções de doença e morte prematura atribuíveis à obesidade e em multiplicar as estimativas populacionais encontradas pelo valor da produtividade económica potencial das pessoas afectadas. O custo indirecto total da obesidade em Portugal no ano de 2002 foi estimado em 199,8 milhões de euros. A mortalidade contribuiu com 58,4% deste valor (117 milhões de euros) e a morbilidade com 41,6% (83 milhões de euros). Os custos da morbilidade advêm de mais de 1,6 milhões de dias de incapacidade anuais, principalmente por faltas ao trabalho associadas a doenças do sistema circulatório e diabetes tipo II. Os custos da mortalidade são o resultado de 18 733 potenciais anos de vida activa perdidos, numa razão de 3 mortes masculinas por cada morte feminina. Os resultados indicam que a obesidade acarreta consideráveis perdas económicas para o país. Comparando os resultados com um estudo complementar que calculou os custos directos (em cuidados de saúde) da obesidade, verifica-se que a componente indirecta representa 40,2% do total dos custos da obesidade. A implementação de estratégias que prevenissem ou reduzissem a incidência e prevalência de obesidade em Portugal poderia gerar ganhos de produtividade elevados. Para conhecer a dimensão destes ganhos é necessária mais investigação sobre os benefícios clínicos e relação custo-efectividade de estratégias para a redução da obesidade.

Elucidating the role of glycans in leucocyte function

RESUMO:O processo de glicosilação é a modificação pós-traducional de proteínas mais comum e está envolvido em vários processos fisiológicos e patológicos. Especificamente, certos perfis glicosídeos estão correlacionados a estados específicos de diferenciação celular, e podem modular vários eventos celulares, como sinalização celular, migração celular e interações hospedeiro-patogénio. Assim sendo, a glicosilação desempenha um papel crucial na modulação de vários processos imunológicos. No entanto, permanece por esclarecer como as estruturas glicosídicas influenciam a imunidade. Especificamente, algumas estruturas glicosídicas terminais que estão modificadas pela ligação de ácido siálico desempenham um papel importante em várias funções do sistema imune, nomeadamente migração leucocitária em contexto de inflamação e ativação de células imunes. Como tal, este trabalho teve como objectivo investigar como a expressão de certos glicanos influencia componentes importantes da resposta imune inata e adaptativa. Este trabalho está dividido em três componentes principais: 1) A imunidade está amplamente dependente da habilidade das células circulantes migrarem para os tecidos inflamados, sendo que a ligação de leucócitos à Eselectina endotelial é o primeiro passo. Assim, nós analisámos a estrutura e função dos ligandos de E-selectina que são expressos pelas células humanas mononucleares de sangue periférico (PBMCs), fornecendo novos conhecimentos para a compreensão dos intervenientes moleculares que mediam a ligação dos monócitos, células CD4+ e CD8+T e células B ao endotélio vascular. Surpreendentemente, os monócitos apresentaram maior capacidade de ligação à E-selectina comparativamente aos linfócitos. Esta observação pode ser explicada pelo facto de os monócitos humanos expressarem, uniformemente, um vasto reportório de glicoproteínas que exibem afinidade de ligação à E-selectina, nomeadamente: as glicoformas do CD43 (CD43E) e do CD44 (HCELL), em adição à já previamente reportada glicoforma da PSGL-1 (CLA). Consistentemente, a diferente capacidade que as diversas populações linfocitárias apresentam de se ligar à E-selectina, está integralmente relacionada com a sua expressão de glicoproteínas com afinidade de ligação à E-selectina. Enquanto que as células CD4+T apresentam uma elevada reatividade à E-selectina, as células CD8+T e B demonstram pouca ou nenhuma capacidade de ligação à E-selectina. Esta atividade de ligação à E-selectina das células CD4+T é conferida pela expressão de HCELL, em adição às já previamente reportadas CLA e CD43E. As células CD8+ T não expressam HCELL e apenas expressam pequenas quantidades de CLA e CD43E, enquanto que as células B não expressam ligandos de Eselectina. Mais, a exofucosilação da superfície destas células, levou ao dramático aumento da expressão dos ligandos de E-selectina em todos as populações leucocitárias, verificando-se que a criação de certos ligandos de E-selectina está dependente do tipo de célula, após fucosilação. Colectivamente, estes resultados redefinem o nosso conhecimento acerca dos mecanismos moleculares que governam o tráfico das células mononucleares de sangue periférico em contexto de inflamação. 2) A habilidade das células dendríticas (DCs) para extravasarem em locais de inflamação é crucial para o sucesso da terapia com DCs. Assim, analisámos a estrutura e função das moléculas de adesão que mediam a migração transendotelial (TEM) das DCs. Para isso, foram usadas DCs geradas a partir da diferenciação de monócitos (mo-DCS), obtidos quer pelo métodos de separação imuno-magnética de células CD14+ (CD14-S) ou por isolamento por aderência ao plástico (PA-S). Os resultados obtidos indicam que as glicoformas de ligação à Eselectina de PSGL-1, CD43 e CD44 são expressas pelas CD14-S mo-DCs, enquanto que as PA-S mo-DCs expressam apenas CLA. É importante notar que a ligação do CD44 nas mo-DCs, mas não nas PA-S mo-DCs, desencadeia a ativação e consequente adesão da VLA-4 ao endotélio na ausência de um gradiente de quimiocinas. Procedeu-se também à análise dos ligandos E-selectina expressos em mo-DCs geradas a partir de monócitos do sangue do cordão umbilical (UCB) e, inesperadamente, as UCB mo-DCs não expressam qualquer glicoproteína com reatividade à E-selectina. Além disso, a exofucosilação das mo- DCs humanas utilizando uma α(1,3)-fucosiltransferase aumenta significativamente a expressão de HCELL e, portanto, estas células apresentam uma capacidade aumentada para se ligarem à E-selectina em condições de fluxo hemodinâmico. Estes resultados destacam o papel do HCELL no desencadeamento do TEM das CD14-S mo-DCs e sugerem que estratégias para potenciar a expressão de HCELL poderão impulsionar o recrutamento de mo-DCs para locais de inflamação. 3) Outro obstáculo para alcançar o sucesso promissor de vacinas baseadas em DCs é o estabelecimento de abordagens eficientes que poderão melhorar o estado de maturação e apresentação antigénica das DCs. Por conseguinte, foram investigadas abordagens alternativas que podem superar este obstáculo. Através da remoção de ácido siálico de superfície celular das DCs, conseguiu-se induzir a maturação de DC humanas e de ratinhos. Notavelmente, tanto as DCs humanas como as de ratinho, ao serem desialiladas mostraram uma capacidade aumentada para induzir a proliferação de células T, para secretar citocinas Th1 e para induzir a morte específica de células tumorais. Em adição, as DCs desialiladas apresentam uma maior capacidade de apresentação cruzada de antigénios tumorais às células T citotóxicas. Colectivamente, o presente estudo oferece uma visão chave para optimizar a capacidade das DCs em induzir respostas imunitárias anti-tumorais, e indica que o tratamento com sialidase é uma nova tecnologia para melhorar a eficácia e aplicabilidade das vacinas baseadas em DCs. Coletivamente, os nossos resultados demostram como a glicosilação e a sua manipulação podem modular a imunidade. Concretamente, através de uma reação de exofucosilação conseguimos aumentar fortemente a capacidade de os leucócitos extravasarem para os tecidos afectados, enquanto que a remoção dos níveis de ácido siálico da superfície celular das DCs, induz potentes respostas anti-tumorais mediadas por células T citotóxicas. ---------------------------- ABSTRACT: Glycosylation is the most widely form of protein post-translational modification and is involved in many physiological and pathological processes. Specifically, certain patterns of glycosylation are associated with determined stages of cell differentiation and can modulate processes like cell-signaling and migration and host-pathogen interactions. As such, glycosylation plays a crucial role in the modulation of several immune events. However, how glycans execute this immune-modulation and, therefore, influence immunity is still poorly unknown. Specifically, some terminal sialic acid-modified determinants are known to be involved in several physiological immune processes, including leukocyte trafficking into sites of inflammation and cell immune activation. Therefore, in this work, we sought to investigate more deeply how the expression of these glycosidic structures affects events form both innate and adaptive immune responses. To this end, we divided our work into three main parts: 1) Immunity critically depends on the ability of sentinel circulating cells to infiltrate injured sites, of which leukocyte binding to endothelial E-selectin is the critical first step. Thus, we first analyzed the structure and function of the E-selectin ligands expressed on native human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), providing novel insights into the molecular effectors governing adhesion of circulating monocytes, and of circulating CD4+T, CD8+T and B cells, to vascular endothelium under hemodynamic shear conditions. Strikingly, monocytes show a higher ability to tether and roll on endothelial cells than lymphocyte subsets. This is due to the fact that human circulating monocytes uniformly display a wide repertoire of E-selectin binding glycoproteins, namely the E-selectin-binding glycoforms of CD43 (CD43E) and CD44 (HCELL), in addition to the previously described E-selectin-binding glycoform of PSGL-1 (CLA). In addition, we also observed a differential ability of the different lymphocyte subsets to bind to Eselectin under hemodynamic shear stress conditions, and these differences were highly correlated with their individual expression of E-selectin binding glycoproteins. While CD4+T cells show a robust E-selectin binding ability, CD8+T and B cells show little to no E-selectin reactivity. CD4+T cell potent Eselectin rolling activity is conferred by HCELL expression, in addition to the previously reported E-selectin-binding glycoproteins CD43E and CLA. CD8+T cells display no HCELL and low amounts of CLA and CD43E, whereas B cells lack E-selectin ligand expression. Moreover, enforced exofucosylation of cell surface of these cells noticeably increases expression of functional E-selectin ligands among all leukocytes subsets, with cell type-dependent specificity in the protein scaffolds that are modified. Taken together, these findings redefine our understanding of the molecular mechanisms governing the trafficking patterns of PBMCs that are relevant in the context of acute or chronic inflammatory conditions. 2) The ability of circulating dendritic cells (DCs) to extravasate at inflammatory sites is critical to the success of DC-based therapies. Therefore, we assessed the structure and function of adhesion molecules mediating the transendothelial migration (TEM) of human monocyte derived-DCs (mo-DCs), obtained either by CD14 positive immune-magnetic selection (CD14-S) or by plastic adherence of blood monocytes (PA-S). We report for the first time that the E-selectin binding glycoforms of PSGL-1, CD43 and CD44 are all expressed on CD14-S mo-DCs, in contrast to PA-S mo-DCs that express only CLA. Importantly, CD44 engagement on CD14-S mo-DCs, but not on PA-S mo-DCs, triggers VLA-4-dependent adhesiveness and programs TEM in absence of chemokine gradient. We also analyzed the E-selectin ligands expressed on mo-DCs generated from umbilical cord blood (UCB) monocytes, and unexpectedly, UCB mo-DCs do not express any glycoprotein with E-selectin reactivity. Furthermore, exoglycosylation of human mo-DCs using an α(1,3)-fucosyltransferase significantly increases expression of HCELL, and therefore exofucosylated mo-DCs exhibit an augmented ability to bind to E-selectin under hemodynamic shear stress conditions. These findings highlight a role for HCELL engagement in priming TEM of CD14-S mo-DCs, and suggest that strategies to enforce HCELL expression could boost mo-DC recruitment to inflammatory sites.3) Another obstacle to achieve the promising success of DC-based vaccines is the establishment of efficient approaches that could successfully enhance maturation and cross-presentation ability of DCs. Therefore, we investigated an alternative approach that can overcome this problem. Through removal of sialic acid content from DC cell surface we are able to elicit maturation of both human and mouse DCs. Notably, desialylated human and murine DCs showed enhanced ability to induce autologous T cell to proliferate, to secrete Th1 cytokines and to kill tumor cells. Moreover, desialylated DCs display enhanced cross-presentation of tumor antigens to cytotoxic CD8+ T cells. Collectively, this study offers key insight to optimize the ability of DCs to boost anti-tumor immune responses, and indicates that the treatment with an exogenous sialidase is a powerful new technology to improve the efficacy and applicability of DC-based vaccines. Overall, our findings show how glycosylation and its manipulation can modulate immunity. Concretely, through an exofucosylation reaction we are able to greatly augment the ability of leukocytes to extravasate into injured tissues, while removal of sialic acid moieties from cell surface of DCs, significantly potentiate their ability to induce anti-tumor cytotoxic T cell-mediate responses.

Análise da variabilidade imunológica e da expressão dos genes FREPs entre as espécies Biomphalaria glabrata e B. straminea com diferentes perfis de suscetibilidade ao parasito Schistosoma mansoni

Algumas espécies do gênero Biomphalaria se apresentam como potenciais hospedeiras ao parasito Schistosoma mansoni, estando a suscetibilidade a este parasito, neste gênero, ligada ao sistema interno de defesa de cada espécie de Biomphalaria. Um dos componentes importantes no sistema imune de invertebrados é a enzima fenoloxidase, que ainda apresenta muitos aspectos desconhecidos no sistema de defesa do gênero Biomphalaria. Foi relatado também que os genes de proteínas relacionadas ao fibrinogênio (FREPs) possuem importância na resposta imune de Biomphalaria glabrata, entre esses, as subfamílias dos FREPs 3 e 4 são diferencialmente expressas em linhagens susceptíveis e resistentes frente a infecção com trematódeos. No entanto os trabalhos existentes em sua maioria estudam a espécie Biomphalaria glabrata, excluindo a espécie Biomphalaria straminea, amplamente distribuída no Brasil e principal responsável pela disseminação da esquistossomose. Tendo em vista a falta de conhecimento sobre a resposta imune destes moluscos hospedeiros, principalmente em relação à expressão de genes imune relevantes e ao tipo de resposta, o presente trabalho se propôs a estudar a variação do número de hemócitos, da produção de fenoloxidase e da expressão dos genes dos FREP 3 e FREP 4 envolvidos com a ligação a antígenos de trematódeos, nas espécies Biomphalaria glabrata, Biomphalaria straminea pós-infecção com S. mansoni, bem como em caramujos pré-expostos a antígenos de S. mansoni. Para isso, os caramujos de cada espécie foram divididos em 2 grupos: pré-expostos e não expostos a antígenos de S. mansoni. Esses grupos foram divididos em sadios e infectados com a cepa LE de S. mansoni. Em B. glabrata não houve alteração no número de hemócitos, porém B. straminea mostrou uma queda após duas horas de infecção. A atividade da fenoloxidase variou após a sensibilização na espécie menos susceptível (B. straminea) e não variou em B. glabrata, também foi identificado que os hemócitos produtores da fenoloxidase são os granulócitos e hialinócitos. Quanto à expressão dos genes, o FREP 3 e 4 apresentaram níveis basais de expressão aumentados após a sensibilização, com perfil de expressão diferente entre as espécies estudadas. Esses resultados confirmam que a resposta imune varia em diversos aspectos entre as espécies do gênero Biomphalaria, e que nas espécies estudadas a enzima fenoloxidase não parece ter o mesmo papel que no sistema de defesa de insetos, diferindo apenas após a sensibilização, que tem influência na expressão dos genes imuno relevantes do FREPs

Estudo da associação entre neuropatia periférica e a capacidade de abertura dos dedos dos pés em pacientes diabéticos

Resumo não disponível.

Metabolismo da glutationa e atividade ATPase de S-conjugados de glutationa no câncer

Pacientes terminais de câncer apresentam um quadro de caquexia que está associado ao estado de imunossupressão que acompanha esta patologia. Nestes pacientes é possível detectar aumento das taxas de prostaglandinas ciclopentenônicas plasmáticas, as quais são reconhecidamente antiproliferativas. Na presença de câncer ocorre a superprodução destas CP-PGs, que são rapidamente captadas pelas células, tanto do sistema imune quanto do próprio tumor. Porém, esta atividade antiproliferativa é mais significativa nas células do tecido imune, enquanto as células de tecido tumoral seguem seu crescimento, aparentemente sem sofrer os distúrbios de proliferação inferidos pelas CP-PGs. É sabido que estas CP-PGs de anel ciclopentano α,β-insaturado são eletrofílicas, o que permite sua conjugação com substâncias nucleofílicas, como a glutationa (GSH). A presença da ATPase MRP/bomba GS-X, responsável pela extrusão de conjugados de glutationa para o espaço extracelular seria uma explicação razoável para o fato das células tumorais serem resistentes à ação antiproliferativa das CP-PGs. Estas ponderações foram confirmadas, anteriormente, através de estudos in vitro, porém ainda não haviam sido determinadas in vivo. Neste estudo foi investigado o papel da MRP/bomba GS-X em animais normais e portadores do tumor de Walker 256. Verificou-se que os animais com tumor, ao longo de, aproximadamente, 21 dias perderam massa corporal, que se fez acompanhar por um quadro de caquexia. Observou-se que a capacidade de exportação de S-conjugados de GSH através da MRP/bomba GS-X (um indicativo da capacidade de eliminação de CP-PG para o espaço extracelular) foi 21 vezes menor em linfócitos que nas células do tumor de Walker 256. Identificou-se que as taxas de GSH estavam diminuídas nas células do tecido imune mas esta depleção não teve caráter oxidativo, uma vez que estiveram mantidos os níveis de GSSG. Isto sugere que linfócitos devam estar sendo desafiados com alguma substância eletrofílica não oxidante que depleta GSH (por exemplo, uma CP-PG). Não houve diferença entre a atividade da glutationa-S-transferase e da γ-glutamilcisteína sintetase (enzimas responsáveis, respectivamente, pela conjugação e síntese de GSH) entre linfócitos de animais normais e portadores do tumor de Walker 256. Como dado corroborante, foi observada, em linfócitos de animais com tumor, indução da expressão de proteínas de choque térmico (HSP70), as quais são induzidas, entre outros agentes, pelas CP-PGs. Os resultados sugerem que a MRP/bomba GS-X, responsável pela extrusão de conjugados de GSH/CP-PG, tem baixa atividade nos linfócitos o que pode ser uma das causas do quadro de imunossupressão nos estágios terminais de câncer.

Expressão gênica dos receptores toll-símele e sua relação com citocinas potencialmente envolvidas em lesão de reperfusão durante a fase inicial do transplante pulmonar em humanos

Introdução: Imunidade inata é a primeira linha de defesa do hospedeiro contra microorganismos invasores, a qual é mediada por moléculas específicas que reconhecem patógenos, chamadas receptores toll-símile (TLRs). Os TLRs são também capazes de reconhecer ligantes endógenos, tais como conteúdos de células necróticas e proteínas de choque térmico (HSP), resultando na produção de citocinas e ativação do sistema imune adquirido. A função exata dos TLRs ainda é pouco entendida em transplante de órgãos. No entanto, tem sido sugerido que eles podem estar envolvidos na rejeição aguda ou crônica e atuar na resposta do enxerto a lesão por isquemia e reperfusão. Objetivo: Examinar as alterações na expressão gênica dos TLRs durante a fase inicial do transplante pulmonar em humanos e sua relação com citocinas potencialmente envolvidas na lesão por isquemia e reperfusão em transplante de órgãos. Métodos: Foram analisadas biópsias pulmonares de 14 pacientes submetidos a transplante pulmonar (LTx). Estas amostras foram coletadas no final do período de isquemia fria (TIF, n=14), no final do período de isquemia quente (TIQ, n=13),1 hora (n=12) e 2 horas (n=8) após a reperfusão do enxerto. RNA total foi isolado a partir de tecido pulmonar e os níveis de RNA mensageiro (mRNA) dos TLRs (1-10) bem como citocinas (IL-8, IL-6, IL-10, IFN-γ, IL-1β) e proteína de choque térmico 70 (HSP70) foram medidos por reação em cadeia pela polimerase em tempo real. Resultados: Foi detectada a expressão de mRNA de todos TLRs em tecido pulmonar. Nas amostras no TIF, os níveis de mRNA dos TLRs apresentaram-se com diferentes expressões gênicas. Os níveis de expressão dos TLRs, com exceção para o TLR3, estavam altamente correlacionados entre si no TIF e com os níveis de mRNA de IFN-γ, IL-10 e IL-1β e menos significativamente com os níveis de IL-6 e IL-8. Houve diminuição dos níveis de mRNA na grande maioria dos TLRs após reperfusão, o que foi diferente para a maioria das citocinas e HSP70, que apresentaram tendência a aumentar após transplante. A expressão gênica de TLR4 apresentou-se correlacionada com os níveis de IL-8 e IL-1β antes e após transplante (P<0.05). Pulmões de doadores que foram intubados por períodos acima de 72 horas (n=5) apresentaram níveis mais elevados de TLR2 e TLR10 (P<0.05). Conclusão: Pela primeira vez, foi demonstrado que a expressão dos TLRs altera-se durante o período de isquemia e reperfusão em transplante pulmonar em humanos. O tempo de intubação dos doadores pulmonares pode influenciar a expressão de receptores Toll-símile específicos. A correlação entre TLR4 e IL-8/IL-1β sugere que os TLRs pulmonares podem ter alguma função na resposta precoce do enxerto.