Human factors required for mycobacterium tuberculosis macrophage infection

Tese de doutoramento, Farmácia (Biologia Celular e Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2014

Tuberculosis is a pathological manifestation of the infection by Mycobacterium tuberculosis in humans. Facultative intracellular parasites, like M. tuberculosis, evolved mechanisms to subvert the proper functioning of their host cells to their benefit. In this thesis we token advantage of the characteristics of the fluorescent proteins to develop methodologies based on fluorimetry to quantify the macrophage internalization and the number of intracellular mycobacteria. The application of these techniques allowed: 1) to demonstrate that the GFP expressing mycobacteria may be used to test the effects of new drugs namely pyrazinoic acid esters against M. tuberculosis growth in liquid cultures. However GFP is not a good fluorophore to quantify intracellular mycobacteria. Instead we found tdTomato the election fluorophore to this purpose 2) To determine the effect of 120 genes in the host vesicular traffic during macrophage infection with M. tuberculosis. We identified 10 genes, 8 lead to a reduction and 2 an increase of macrophage M. tuberculosis burden. 3) To demonstrate that a reduction in macrophage internalization was the cause for the reduction in intracellular M. tuberculosis observed in some of the genes identified in 2) and the modulation of internalization by the microRNA miR-142-3p. Additionally, we studied the effect of Rab GTPases silencing in exosome secretion. MicroRNAs (miR) are small non-coding RNA molecules that regulate gene expression. Previous studies in our laboratory shown that miR-142-3p was up-regulated during early stages of M. tuberculosis macrophage infection. MiR142-3p binds to Wasl gene controlling the expression of N-wasp protein involved in signal transduction of membrane receptors and actin cytoskeleton. N-wasp silencing reduces M. tuberculosis internalization by macrophage. These studies demonstrate that M. tuberculosis regulates its internalization through N-Wasp. Taken together our results demonstrate the effect of specific host factors in the survival and/or internalization of M. tuberculosis by macrophages. Tuberculosis bacilli apparently modulate some of them. The development of new molecules in formulations that inhibit resistant M. tuberculosis strains is another strategy for the eradication of this pathogen from humans.

A tuberculose (TB) é a manifestação patológica da infecção do Mycobacterium tuberculosis no seu hospedeiro: os humanos. Esta doença afecta os humanos há milénios e constitui ainda um problema de saúde pública a nível global. A reemergência da TB após decadas de declínio resulta sobretudo da co-infecção com o vírus da imunodeficiência humana e do aparecimento de estirpes de M. tuberculosis resistentes aos antibióticos. O M. tuberculosis é um parasita intracelular facultativo, cujo principal nicho de sobrevivência são os macrófagos: as células do sistema imune cuja função é a destruição dos microrganismos. Após fagocitado pelo macrófago, o M. tuberculosis subverte o normal funcionamento do seu hospedeiro. Os fagossomas contendo o bacilo da tuberculose não maturam para fagolisossomas, não fundindo com endossomas tardios ou lisossomas, protegendo o bacilo dos factores microbicidas do macrófago. Apesar de o fagossoma estar bloqueado num estádio precoce da sua maturação este funde com outras vesículas do macrófago hospedeiro, fornecendo à micobactéria recursos para a sobrevivência e replicação. Em particular, multiplas publicações sugerem que diferentes proteínas do hospedeiro reguladoras do tráfego vesicular ou do citoesqueleto da actina poderão desempenhar um papel relevante na sobrevivência deste patogénio. Contudo, os mecanismos através dos quais é estabelecida esta subversão não são conhecidos. O desenvolvimento de metodologias de larga escala para triagem no estudo dos factores do hospedeiro envolvidos na infecção de macrófagos, pelo M. tuberculosis, têm sido refreados pelas características únicas desta micobactéria. A única metodologia disponível para a quantificação de micobactérias intracelulares é a contagem de unidades formadoras de colónias (UFC), uma técnica laboriosa e dispendiosa. Nesta tese aproveitamos as características das proteínas fluorescentes para desenvolvermos metodologias para a quantificação da internalização e sobrevivência de micobactérias em macrófagos e em culturas líquidas. O desenvolvimento dessas técnicas permitiu: 1) Desenvolver uma metodologia baseada nas propriedades das proteínas fluorescentes para a determinação da sobrevivência de M. tuberculosis intracelularmente em macrófagos infectados. 2) Determinar o efeito de cerca de 120 genes humanos do tráfego vesicular na carga do M. tuberculosis em macrófagos humanos. 3) Estudar o efeito dos genes validados no ponto 2) e do micro RNA mIR143-3p na internalização do M. tuberculosis por macrófagos humanos. 4) Adicionalmente foi estudado o efeito do silenciamento de Rab GTPases na secreção de exosomas. De forma a desenvolver um método alternativo ao UFC compatível com a possibilidade de rastreamento em larga escala da sobrevivência de micobactérias aproveitamo-nos das características das proteínas fluorescentes com o objectivo de monitorizar a infecção de macrófagos pelo M. tuberculosis. Numa primeira fase culturas líquidas de M. tuberculosis expressando GFP foram sujeitos à acção microbicida de vários antibióticos e determinadas as suas concentrações mínimas inibitórias por fluorimetria. Posteriormente foram utilizados vários esteres derivados do ácido pirazinóico em M. tuberculosis expressando GFP por fluorimetria tendo-se quantificado a sua actividade biológica. Todos os compostos apresentaram uma maior actividade biológica que a pirazinamida ou o ácido pirazinóico. Compostos com maior comprimento da cadeia linear do álcool e maior lipofilia estão positivamente correlacionados com a actividade biológica. Apesar de adequado para a quantificação da inibição de crescimento de M. tuberculosis em culturas líquidas, a proteína GFP não se demonstrou propicia para a quantificação de micobactérias intracelulares. A quantificação por fluorimetria de M. tuberculosis intracelulares expressando a proteína fluorescente vermelha tdTomato, demonstrou-se uma boa alternativa ao UFC. Adicionalmente, a quantificação da intensidade da fluorescência de macrófagos humanos THP-1 expressando GFP, permitiu quantificar tanto o número como a viabilidade dos macrófagos. O estabelecimento de uma metodologia de rastreamento em larga escala para a quantificação de M. tuberculosis intracelular, permitiu-nos proceder ao silenciamento sistemático de cerca de 120 genes do tráfego vesicular humano e quantificar o seu efeito na carga de M. tuberculosis em macrófagos. Os candidatos obtidos no rastreamento foram posteriormente validados quanto à sua expressão genética. Identificámos 10 genes com efeito na carga intracelular de M. tuberculosis em macrófagos, em 2 genes, foi observado um aumento e em 8 genes, uma redução da carga de M. tuberculosis em macrófagos humanos. Os candidatos foram maioritariamente proteínas Rab, proteínas reguladoras e efectoras de Rab e proteínas do tráfego vesicular não classificadas. De forma a quantificar o contributo da internalização nos resultados observados no rastreamento dos 120 genes, desenvolvemos uma metodologia baseada em citometria de fluxo. Determinamos que, para micobactérias virulentas e avirulentas, a grande maioria dos genes testados são, provavelmente, reguladores positivos da internalização. Estas observações justificaram e confirmaram alguns dos resultados obtidos no rastreamento genómico e propõem um papel activo das micobactérias na modulação da sua internalização por macrófagos humanos. De forma a validar biologicamente alguns dos candidatos, estes foram silenciados novamente e foi quantificada a carga micobacteriana em macrófagos utilizando a metodologia convencional, as unidades formadoras de colónias. Com os resultados observados ficou demonstrado que a proteína Rab7a induz um aumento da carga macrofágica de M. tuberculosis. O silenciamento de Rab34 e Sintaxina 4 induz uma redução da carga de M. tuberculosis em macrófagos humanos sendo esta redução, possivelmente devida à redução da internalização nestas células. Os micro RNAs (miR), recentemente descritos, são uma nova classe de moléculas que controlam eventos pós-transcripcionais durante a expressão genética. Os miR ligam-se a regiões especificas do RNA mensageiro (RNAm) de uma proteína bloqueando a tradução proteica e/ou levando à degradação do RNAm. Os miRs controlam selectivamente a expressão de proteínas de diferentes vias metabólicas das células. Estudos feitos no nosso laboratório demonstraram que o miR-143-3p está sobre-expresso nos estádios iniciais da infecção de M. tuberculosis em macrófagos. O miR-143-3p liga-se ao mRNA do gene Wasl controlando a expressão da proteína N-Wasp, um transdutor de receptores membranares e do citoesqueleto de actina. O silenciamento da N-Wasp reduz a internalização de M. tuberculosis pelos macrófagos. Estes resultados demonstram a regulação de N-Wasp pelo M. tuberculosis para controlar a sua internalização. Os exossomas são vesículas com um diâmetro de 30 a 100 nm que são secretadas por diversos tipos de células. Os exossomas desempenham um papel importante na sinalização entre células e em macrófagos têm um papel de apresentação de antigénios. Os exossomas secretados por macrófagos infectados por M. tuberculosis são pró-inflamatórios in vitro e in vivo. No laboratório do Dr. Amigorena foi desenvolvida uma metodologia para quantificação de exossomas através de pérolas de latex conjugadas dom CD63 e a utilização de citometria de fluxo. Em colaboração com o Dr Ostrwsky, do laboratório do Dr Amigorena, Instituto Curie, Paris, França, efectuei um rastreio de larga escala para determinação dos genes do tráfego intracelular envolvidos na secreção de exossomas em células HeLa B6H4. Nesse estudo a proteína Rab27a e Rab27b foram envolvidas na secreção de exossomas em células humanas. Era nosso objectivo determinar se tal se verificava em macrófagos humanos, no contexto da infecção do M. tuberculosis, não foi possível por razões alheias à nossa vontade. Conjuntamente os dados apresentados nesta tese demonstram o efeito de factores específicos do hospedeiro que influenciam a sobrevivência e/ou internalização do M. tuberculosis por macrófagos, alguns deles aparentemente modulados pelo bacilo da tuberculose. Em particular, os dados sugerem que o M. tuberculosis desenvolveu um mecanismo específico de invasão dos macrófagos alveolares, provavelmente, para estabelecer o seu nicho replicativo sem activar em demasia o sistema imune do hospedeiro. Estes factores do hospedeiro, e em especial as proteínas que as codificam ou regulam são potenciais alvos para o desenvolvimento de drogas orientadas para a modulação do hospedeiro de forma a inibir ou controlar a infecção por M. tuberculosis. O desenvolvimento de novas drogas em formulações que inibam estirpes de M. tuberculosis resistentes é outra estratégia de erradicação deste patogénio nos humano.

Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)