Caracterização da estrutura populacional de isolados de Escherichia coli provenientes de suiniculturas de produção intensiva e extensiva de Portugal

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

Caracterização molecular de isolados de Enterobacteriaceae produtores de beta-lactamases de espectro alargado (ESBLs) provenientes de suiniculturas de produção intensiva e extensiva de Portugal

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

Vírus e retrovírus

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

Selénio e a importância para o organismo humano

O selénio (Se) é um micronutriente essencial para o crescimento, desenvolvimento e normal metabolismo dos animais, incluindo o ser humano. É parte integrante de um conjunto de proteínas, as selenoproteínas, com ação antioxidante (protegendo as membranas celulares contra danos dos radicais livres), envolvidas no metabolismo das hormonas da tiróide, na regulação do crescimento e viabilidade celular, nas funções do sistema imune e na reprodução. É introduzido na dieta alimentar (principalmente nas formas de selenometionina e selenocisteína) através das plantas, e de produtos que delas derivam, que assimilam os compostos de selénio presentes no solo. Uma vez que a quantidade de selénio existente nos solos é muito variável, o teor nos alimentos vai depender da sua origem geográfica e, por consequência, a ingestão de selénio varia entre regiões e países. Baixos níveis de selénio estão associados a um declínio na função imune e problemas cognitivos. A deficiência de Se pode também ocasionar problemas musculares e cardiomiopatia. Concentrações reduzidas foram observadas em indíviduos com crises epiléticas e também em casos de pré-eclampsia. A deficiência de selénio pode também desenvolver-se durante a nutrição parenteral. Atualmente, a Dose Diária Recomendada (DDR) é de 55 μg/dia para homens e mulheres adultos e saudáveis. No entanto, existem evidências clínicas de que a ingestão em doses superiores (200-300 μg/dia) pode ter um papel benéfico na prevenção de alguns tipos de cancro e doenças cardiovasculares, na melhoria da resposta imunológica, como neuroprotetor e na fertilidade. O Se desempenha um papel importante na fertilidade masculina, sendo necessário na biossíntese da testosterona e na formação e normal desenvolvimento dos espermatozóides. Em mulheres grávidas o Se, ajuda a prevenir complicações antes e durante o parto e promove o normal desenvolvimento do feto. Como antioxidante o selénio vai combater os danos provocados pelos radicais livres, impedindo que estes exerçam o seu papel prejudicial no organismo. Sendo o sistema imunológico muito suscetível aos danos provocados pelo stress oxidativo, o Se vai exercer efeitos benéficos combatendo os danos por ele causados. Relativamente à capacidade viral, não é possível saber com exatidão qual a quantidade de Se necessária ou concentração ideal no plasma para evitar a ocorrência e desenvolvimento de infeções virais. No entanto, sabe-se que tem um efeito benéfico em pacientes HIV positivos e em indivíduos infetados com o vírus da hepatite (B ou C) contra a progressão para o neoplasia de fígado. Em teoria, a nível cardiovascular, este elemento pode exercer um efeito protetor, embora alguns estudos epidemiológicos não tenham mostrado uma associação clara entre o risco cardiovascular e os níveis selénio. A nível cerebral o Se vai atuar como neuroprotetor, prevenindo o aparecimento de patologias como demência e doença de Alzheimer. Apesar destes indicadores, a maioria dos países europeus, incluindo Portugal, regista uma deficiente ingestão de selénio por parte da população. A suplementação poderá constituir uma opção para garantir os níveis nutricionais recomendados e/ou ser utilizada com o objetivo de prevenir algumas doenças e o envelhecimento. No entanto o selénio pode também ser tóxico se ingerido em excesso, estando a dose máxima admissível fixada em 400 μg/dia. A intoxicação por selénio é chamada selenose e os sintomas comuns incluem: hálito a alho, distúrbios gastrointestinais, perda de cabelo, descamação das unhas, danos neurológicos e fadiga. Assim, atualmente acredita-se que enquanto indivíduos com baixo nível de Se podem obter benefícios da suplementação, esta pode ser prejudicial aqueles com valores normais ou elevados.

SnaPshot based genotyping of the RYR1 mutation in Portuguese breeds of pigs

The porcine stress syndrome or malignant hyperthermia is an inherited autosomic recessive disease, which results in neuromuscular disorders leading to death in homozygous individuals and is associated with deterioration of meat quality. The defect in susceptible animals results from modifications in the calcium release channel or Ryanodine Receptor (RYR1), with a mutation leading to a C to T transition in nucleotide 1843 of the gene. The objective of this work was to develop a method based on analysis of SNPs to detect the mutation described in the RYR1 locus in pigs, and study polymorphisms of the gene in four exotic (Large White, Landrace, Duroc and Pietrain) and three native (Bísaro, Alentejano and Malhado de Alcobaça) breeds of pigs in Portugal. The method was successful in identifying the mutation by analysis of SNPs, and results indicate a high incidence of the mutant allele in Pietrain (0.75) and, to a lesser degree, in Malhado de Alcobaça (0.34) and Landrace (0.28); frequencies in Alentejano, Bísaro and Large White ranged between 0.04 and 0.09. These results suggest the need to establish breeding programs aimed at eliminating the susceptibility allele from those populations.

Factores que influenciam o peso e crescimento de cabritos da raça Murciana-granadina, em aleitamento artificial

A exploração caprina de leite tem evoluído no sentido de alguma intensificação, com recurso a raças de elevado potencial produtivo, de que é exemplo a raça Murciana- Granadina. O leite constitui a principal fonte de receita destas explorações. Complementarmente, vendem animais para carne e, as de melhor nível genético, animais para reprodutores. Analisaram-se os pesos de 241 cabritos da raça Murciana-Granadina, numa exploração comercial, com o objectivo de quantificar os pesos e crescimento de cabritos, e identificar os factores que os influenciam. Os cabritos foram aleitados artificialmente, em regime ad libitum, com leite de substituição comercial, dispondo ainda de concentrado comercial, feno de luzerna e palha. Os cabritos foram pesados ao nascimento e, posteriormente, semanalmente, até aos 60 dias de idade. Calcularam-se os respetivos pesos ajustados, bem como os ganhos médios diários, a diferentes idades padrão. Procedeu-se a uma análise de variância com um modelo linear que incluiu os efeitos da época de parto, tipo de parto, sexo e idade da cabra. Foram registados pesos superiores nos partos simples e duplos, relativamente aos triplos, e nos machos, relativamente às fêmeas. Os ganhos médios diários, a partir do mês de idade, registaram valores inferiores na época inverno-primavera, comparativamente com a época primavera-verão. Dairy goat farming has evolved towards intensification, with increased use of high milk-yielding breeds, including the Murciano-Granadina breed. Milk is the main source of farm income. Secondary income sources are the sale of animals for meat and, in genetically superior herds, the sale of breeding animals. The weights of 241 commercial farms artificially reared Murciano-Granadina kids were analyzed with the objective of quantifying weight and growth and identifying variation factors. Kids were artificially reared to weaning, on ad libitum commercial milk replacer, commercial concentrate, lucerne hay and straw. Kids were weighed at birth and at weekly intervals until 60 days of age. Age adjusted weights and growth-rates were calculated. A variance analysis was performed with a model including the effects of season of birth, number of kids per kidding, sex and age of dam. Single and twin-born kids had higher weights than triplets, and males had higher weights than females. Average daily gain after one month of age was lower for kids born in winter-spring than for those born in spring-summer

Influência de fatores ambientais na condição corporal e produção de leite da cabra serrana – ecótipo ribatejano

A cabra Serrana destaca-se, no panorama das raças autóctones, pela sua considerável distribuição geográgica, expressão numérica e desempenho produtivo. A preservação destes recursos genéticos em sistemas produção rentáveis, requer um aprofundamento do conhecimento sobre os fatores que influenciam o seu desempenho produtivo. Observaram-se 51 animais de raça Serrana, ecótipo Ribatejano, inscritos no Registo Zootécnico, em 4ª ou 5ª lactação, provenientes de seis explorações, recolhendo-se dados realativos à idade ao parto, condição corporal e grau de parasitismo (estrongilídeos gastrintestinais, oocistos e larvas de primeiro estadio de estrongilídeos pulmonares). Utilizou-se a informação do contraste leiteiro das cabras, disponibilizada pela Associação de Criadores de Caprinos e Ovinos do Ribatejo e Oeste. A condição corporal foi analisada considerando os efeitos do criador, mês e tipo de parto, e como covariável, o efeito linear da produção de leite, eliminação parasitária e os efeitos linear e quadrático da idade ao parto. Os fatores ambientais idade ao parto, produção de leite e a eliminação de estrongilídeos gastrintestinais, influenciaram significativamente (p<0,05) a condição corporal. A condição corporal registou valores superiores em cabras com idades compreendidas entre 50 e 60 meses de vida, e foi influenciada negativamente pela elevação da produção de leite e pelo nível de estrongilídeos gastrintestinais. The Serrana stands out among autochthonous goat breeds for its wide geographical distribution, large inventory and considerable productive performances. The preservation of animal genetic resources of this kind requires a better knowledge of the factors affecting productive performance. Data has been collected on 51, 4th and 5th lactation registered Serrana goats of the Ribatejano ecotype, from six different herds. Parameters examined were age at kidding, body condition score and parasitic infection level (gastrointestinal strongyles, oocysts and first stage larvae of pulmonary strongyles). Lactation data from the official milk recording service have been supplied by the Associação de Criadores de Caprinos e Ovinos do Ribatejo e Oeste. Body condition score was analysed for the discrete effects of herd, kidding month and number of kids born per kidding, the covariant linear effects of milk yield and parasitic infection and the linear and quadratic effects of age at kidding. Age at kidding, milk yield and gastrointestinal strongyle fecal egg counts have significantly affected body condition scores (p<0,05). Body condition scores were higher for 50 to 60-month old goats, and were negatively influenced by milk yield and gastrointestinal strongyle infection level.

Genetic structure, relationships and admixture with wild relatives in native pig breeds from Iberia and its islands

Background: Native pig breeds in the Iberian Peninsula are broadly classified as belonging to either the Celtic or the Mediterranean breed groups, but there are other local populations that do not fit into any of these groups. Most of the native pig breeds in Iberia are in danger of extinction, and the assessment of their genetic diversity and population structure, relationships and possible admixture between breeds, and the appraisal of conservation alternatives are crucial to adopt appropriate management strategies. Methods: A panel of 24 microsatellite markers was used to genotype 844 animals representing the 17 most important native swine breeds and wild populations existing in Portugal and Spain and various statistical tools were applied to analyze the results. Results: Genetic diversity was high in the breeds studied, with an overall mean of 13.6 alleles per locus and an average expected heterozygosity of 0.80. Signs of genetic bottlenecks were observed in breeds with a small census size, and population substructure was present in some of the breeds with larger census sizes. Variability among breeds accounted for about 20% of the total genetic diversity, and was explained mostly by differences among the Celtic, Mediterranean and Basque breed groups, rather than by differences between domestic and wild pigs. Breeds clustered closely according to group, and proximity was detected between wild pigs and the Mediterranean cluster of breeds. Most breeds had their own structure and identity, with very little evidence of admixture, except for the Retinto and Entrepelado varieties of the Mediterranean group, which are very similar. Genetic influence of the identified breed clusters extends beyond the specific geographical areas across borders throughout the Iberian Peninsula, with a very sharp transition from one breed group to another. Analysis of conservation priorities confirms that the ranking of a breed for conservation depends on the emphasis placed on its contribution to the betweenand within-breed components of genetic diversity. Conclusions: Native pig breeds in Iberia reveal high levels of genetic diversity, a solid breed structure and a clear organization in well-defined clusters.

List of the terrestriaL nematodes (nematoda) from Azores

Os nemátodes são um grupo de invertebrados, não segmentados que formam um Filo (Nematoda) bem definido e claramente distinto dos outros grupos de organismos. Este Filo constitui um dos grupos animais mais disseminados no planeta, e em termos de número de indivíduos os nemátodes são o grupo animal mais abundante na Terra: quatro em cada cinco animais da Biosfera são nemátodes. Apesar de microscópicos, os animais multicelulares que constituem este grupo são capazes de explorar uma enorme variedade de habitats, nos mares, nas águas doces, nos solos, como parasitas de animais ou de plantas, ou mesmo em condições extremas, como nos solos secos da Antárctida ou em fontes termais (Baldwin et al. 1999). A actual informação sobre a nematofauna do arquipélago dos Açores encontra-se fraccionada e espalhada em diversas publicações científicas, mas igualmente em dados ainda não publicados (Sturhan, comunicação pessoal). Entre as diversas publicações de nemátodes para os Açores, há que salientar os trabalhos realizados por Sturhan (1973, 1975, 1983) e Macara (1994), que muito contribuíram para o conhecimento e distribuição actual das espécies de vida livre e parasitas de plantas; bem como os trabalhos de Afonso-Roque (1995) e Casanova et al. (1996) relativamente a espécies parasitas de animais, reportadas para as diferentes ilhas do arquipélago. A lista de nemátodes apresentada neste capítulo, tem como base as publicações conhecidas para o arquipélago (ver listagem de publicações até 2010 em www. naturdata.com), bem como o registo de espécies assinaladas pela primeira vez para o arquipélago (Sturhan, comunicação pessoal). A classificação utilizada baseia-se na recente revisão da sistemática e filogenia proposta por De Ley & Blaxter (2002) para todo o Filo, até ao nível da Família. A classificação dos restantes taxa segue o critério utilizado para a fauna terrestre da Fauna Europaea (http://www. faunaeur.org). É apresentada a distribuição das espécies nas nove ilhas dos Açores, usando-se a seguinte simbologia: COR – Corvo; FLO – Flores; FAI – Faial; PIC – Pico; GRA – Graciosa; SJG – São Jorge; TER – Terceira; SMG – São Miguel e SMR – Santa Maria.

Pesquisa de Campylobacter fetus em amostras prepuciais de touros da região do Alentejo

A bactéria Campylobacter fetus divide-se em duas subespécies C. fetus fetus (Cff) e C. fetus venerealis (Cfv). Cfv é o agente patogénico responsável pela campilobacteriose genital bovina (CGB), uma doença que provoca infertilidade em vacas. Cff pode provocar abortos esporádicos, mas não provoca CGB. Neste trabalho procedeu-se à pesquisa de C. fetus por imunofluorescência direta (IFD) em 117 amostras prepuciais, recolhidas por raspagem, de touros pertencentes a 25 explorações na região do Alentejo. A prevalência real de CGB na amostra, considerando a sensibilidade e especificidade do teste, foi de 52,89% de animais e 80% de explorações. Foi também realizada uma comparação entre dois testes de diagnóstico de CGB, a IFD e o isolamento bacteriológico. O isolamento bacteriológico foi difícil de executar e a presença de bactérias contaminantes foi bastante problemática, levando a resultados falso-negativos. A sua correlação com a IFD foi muito baixa, tendo esta revelado ser muito mais sensível; #### Abstract Search for Campylobacter fetus in preputial samples of bulls from Alentejo region The bacteria Campylobacter fetus comprises two subspecies, C. fetus fetus (Cff) and C. fetus venerealis (Cfv). Cfv is the pathogen responsible for bovine genital campylobacteriosis (BGC), a disease that causes infertility in cows. Cff may lead to sporadic miscarriages, but does not cause BGC. In this work we searched for C. fetus by direct immunofluorescence (DIF) in 117 preputial samples, collected by scraping, from bulls from Alentejo region. The actual prevalence of BGC, considering the sensitivity and specificity of the test was 52.89% of animals and 80 % of farms. It was also performed a comparison between two BGC diagnostic tests, bacterial isolation and DIF. The bacterial isolation was difficult to perform and the presence of bacterial contaminants was very problematic, leading to false-negative results. The presence of bacterial contaminants in bacterial isolation was problematic, leading to false-negative results. Its correlation with DIF was quite low, and DIF proved to be much more sensitive.

Qualidade do Leite de Ovelha

O Regulamento (CE) nº 853/2004, que estabelece as regras de higiene específicas para os produtos de origem animal, na Secção IX – III do Anexo III, define os critérios microbiológicos a que deve obedecer o leite cru. Segundo este Regulamento, para o leite de vaca, são estabelecidos critérios para a carga microbiológica, mesófilos viáveis totais (MVT) e para a conta gem de células somá cas (CCS). Já no que se refere a outros leites que não de vaca, onde se inclui o leite de pequenos ruminantes, só é definido um critério para a carga microbio lógica, não havendo qualquer referência a CCS.Parece nos fundamental que seja estabelecido um critério para a CCS no leite de ovelha, pois será a única forma de garan r que o leite que entra na cadeia alimentar não é proveniente de animais com mas te. Eventualmente, pode rão ser implementados incen vos económicos que sirvam de es mulo aos produtores.

Transfusões sanguíneas em cães e gatos: indicações e reações transfusionais

O presente relatório teve como base o estágio curricular no Hospital Veterinário Central, sob a orientação da Professora Cristina Queiroga, e coorientação do Dr. Nuno Paixão. Na primeira parte deste documento são relatadas as atividades desenvolvidas durante o estágio curricular, abrangendo várias áreas de especialidade clínica, em medicina de animais de companhia. A segunda parte do documento consiste numa revisão bibliográfica sobre transfusões sanguíneas, onde são abordados vários pontos, seguida da apresentação e discussão de um estudo sobre as transfusões sanguíneas realizadas no Hospital Veterinário Central, no período de 1 de janeiro de 2012 a 28 de fevereiro de 2013. O estudo tem como objetivos a avaliação da variação do hematócrito, frequência cardíaca e respiratória, coloração das mucosas, temperatura retal, pressões sanguíneas e atitude, em intervalos de tempo estipulados. Outro objetivo do presente estudo, é determinar a prevalência de reações transfusionais adversas e a taxa de sobrevivência dos animais submetidos a transfusão, e avaliar, através de testes estatísticos, se existe associação entre as várias variáveis em estudo; ### ABSTRACT: Blood transfusions in dogs and cats: indications and transfusion reactions This report is based on the internship accomplished in Hospital Veterinário Central, under the orientation of Dr. Cristina Queiroga and co-orientation of Dr. Nuno Paixão. The first part of this report describes the activities undertaken during a traineeship in several areas of clinical specialty, in small animal medicine. The second part of this document consists of a literature review on blood transfusions, which addresses several points, followed by a presentation and discussion of a study of blood transfusions performed at Hospital Veterinário Central, during the period of 1 January 2012 and 28 February 2013. The study aims at assessing the changes in hematocrit, heart and respiratory rate, mucous membrane coloration, retal temperature, blood pressures and attitude, at prescribed time intervals. Another objective of the present study is to determine the prevalence of adverse transfusion reactions and the survival rate of animals subjected to transfusion, and evaluate, through statistical tests, whether an association exists between the different variables under study.

Mastites ovinas: Epidemiologia, factores de virulência e antigénios imunorrelevantes de agentes etiológicos

O presente trabalho teve como objectivo o estudo da prevalência de mastites ovinas em explorações do Alentejo e a identificação dos agentes etiológicos, seus factores de virulência e epitopos imunorrelevantes. A prevalência de mastite clínica e subclínica foi 1,7% e 32,2%, respectivamente. O agente etiológico mais prevalente foi Staphylococcus epidermidis (N=115), tendo sido também identificados Staphylococcus aureus (N=27) e Streptococcus agalactiae (N=17). A pesquisa de factores de virulência permitiu identificar os padrões de susceptibilidade (N=404) e as Concentrações Inibitórias Mínimas de princípios activos (N=130). De 109 isolados de Staphylococcus epidermidis; oito revelaram capacidade para produzir biofilme in vitro. Os isolados estudados aderiam e eram internalizados por células epiteliais mamárias (N=12). A pesquisa de cinco superantigénios resultou negativa (N=27). Foram estudados os perfis proteicos de Staphylococcus epidermidis, tendo sido identificados os epitopos imunorrelevantes, reconhecidos por imunoglobulinas séricas e mamárias. Verificou-se uma resposta imunológica local específica nos animais infectados./SUMMARY - OVINE MASTITIS: EPIDEMIOLOGY, VIRULENCE FACTORS AND IMMUNORELEVANT ANTIGENES OF AETIOLOGICAL MICRORGANISMS The present work aimed at investigating the prevaleance of ovine mastitis in farms from Aletenjo and the identification of causative microrganisms, their virulence factors and immunorelevant epitopes. The preva lence of clinical and subclinical mastitis was 1.7% and 32.2%,respect ively. The most preva lent aet iologica l agent was Staphylococcus epidermidis (N=115); Staphylococcus aureus (N=27) and Streptococcus agalactiae (N=17) were also identified. The investigation of virulence factors allowed the identification of susceptibility patterns (N=404) and drug Minimal Inhibitory Concentrations (N=130). From 109 Staphylococcus epidermidis isolates; eight showed the ability to produce biofilm in vitro. The isolates studied adhered and were internalised by mammary epithelial cells (N=12). None of the five superantigens studied was detected (N=27). The protein profile of Staphylococcus epidermidis was determined, and the immunorelevant epitopes, recognised by blood and milk immunoglobulins, were identified. It was possible to detect a specific local immune response in infected animals.

Analgesia em modelo animal superior para ortopedia

O teste de novos biomateriais para aplicações clínicas em ortopedia, ou noutras áreas da medicina, em modelos animais vivos e sencientes, em prol do benefício humano, deve ser objecto de planeamento cuidado e ponderado, dado o conflito ético que se coloca. Compete-nos, enquanto investigadores, garantir que as condições de vida, saúde e bem-estar são asseguradas. O uso de ovinos como modelo superior pré-clínico, para investigação em Ortopedia, tem-se evidenciado devido às suas características translacionais para a espécie humana. Neste estudo retrospectivo deu-se ênfase ao plano anestésico/ analgésico instituído em três tipos de técnicas cirúrgicas ortopédicas, realizadas em ovinos. Os animais intervencionados foram adquiridos com 2 meses de antecedência em relação às cirurgias e mantidos em rebanho, com condições adequadas de abrigo, alimentação e maneio. As técnicas cirúrgicas inovadoras foram treinadas previamente em peças anatómicas adquiridas no matadouro. Todas as cirurgias e anestesias foram realizadas por médicos veterinários devidamente qualificados. Durante os períodos pós-operatórios os animais foram mantidos no Hospital Veterinário, sob vigilância e tratamento, após o que regressaram ao pasto. Considera-se que os protocolos anestésico e analgésico instituídos foram suficientes para eliminar a dor ortopédica/ neuropática causada pelas técnicas cirúrgicas referidas.

Modelo animal ex vivo para vertebroplastia percutânea

O teste de novos biomateriais para vertebroplastia percutânea (VP), depende da escolha de um modelo animal adequado. O objectivo deste estudo foi o desenvolvimento ex vivo de um modelo animal reprodutível e fiável para VP, para posterior aplicação in vivo, tendo em consideração a necessidade de evitar o derrame de cimento para o canal vertebral e estruturas vasculares adjacentes. Foi seleccionado um modelo animal superior (ovino), pelas suas reconhecidas propriedades translacionais para a espécie humana. Foram realizadas VP’s em vértebras lombares sob controlo táctil e fluoroscópico, através de uma abordagem parapedicular bilateral. O volume médio de defeito obtido foi 1234±240 mm3, o que assegura defeitos viáveis para o teste de novos biomateriais injectáveis. Seis vértebras foram injectadas com um cimento comercial (Cerament®, Bone Support, Suécia) tendo-se observado preenchimento adequado dos defeitos em todas as vértebras. Todas as vértebras foram avaliadas por microtomografia axial computorizada (microTAC) antes e após a criação dos defeitos e após injecção dos cimentos. Realizaram-se testes mecânicos de compressão, tendo as vértebras sido sujeitas a cargas superiores às fisiológicas e inspeccionadas macroscopicamente. Em conclusão considera-se este modelo adequado para estudos in vivo pré-clínicos, mimetizando aplicações clínicas.