Estudio de una estrategia alternativa de ingeniería genética para incrementar la fijación biológica de nitrógeno atmosférico

Para satisfacer los altos rendimientos que impulsan la agricultura moderna la aplicación de fertilizantes nitrogenados ha sido fundamental. Dado que la base de la producción industrial de los fertilizantes químicos esta basado en el uso de combustibles fósiles, estos, actualmente, incrementan el costo económico debido a la disminución constante de las reservas de petróleo. Además, dada la baja eficiencia en el uso del fertilizante aplicado por parte de las plantas y el alto impacto ambiental debido a la emisión de óxido nitroso, resulta necesario emprender la búsqueda de nuevas estrategias para aumentar la concentración del nitrógeno fijado. Una de las propuestas para disminuir la aplicación de fertilizantes es el uso de microorganismos fijadores de nitrógeno; que ya son ampliamente utilizados en leguminosas por su capacidad de establecer asociaciones simbióticas; las cuales, lamentablemente, aún no han sido encontradas entre los principales cultivos de cereales. El objetivo del presente trabajo es la producción de una técnica de ingeniería genética que permita obtener bacterias fijadoras de nitrógeno recombinantes capaces de asociarse a distintos cultivos vegetales incrementando la productividad de los mismos. Para ello, los genes que sintetizan la nitrogenasa (nif), que están co-localizados en una isla genómica, en Pseudomonas stutzeri A1501 se transfirieron, vía el cósmido recombinante X940, a un promotor del crecimiento vegetal, Pseudomonas protegens Pf-5. La bacteria recombinante obtenida, P. protegens Pf-5 X940, fue capaz de crecer en medios de cultivo deficientes en nitrógeno o con el agregado de amonio; mostró una alta actividad nitrogenasa, liberando al medio de cultivo cantidades significativas de amonio y presentó expresión de los genes nif, sugiriendo que el proceso de fijación, en esta bacteria, es constitutivo. Las inoculaciones de especies vegetales (arabidopsis, alfalfa, festuca alta y maíz) con Pf-5 X940 aumentaron la concentración de amonio en el suelo y la productividad de las plantas en condiciones deficientes de nitrógeno. Estos resultados inician un nuevo camino hacia la producción efectiva de inoculantes recombinantes para la fijación de nitrógeno en un amplio rango de cultivos

Variación geográfica y genética en caracteres adaptativos iniciales de Nothofagus pumilio (Poepp. et Endl.) Krasser en una zona de alta heterogeneidad ambiental

La diversidad genética es un requisito para el cambio evolutivo. Por consiguiente, la conservación de la diversidad genética dentro de las especies es importante para asegurar el potencial de adaptación en un medio ambiente cambiante. La variación genética de los rasgos de importancia adaptativa se puede medir mediante la observación de la variación fenotípica en los ensayos de ambiente común. De acuerdo a su área de distribución y productividad potencial, Nothofagus pumilio (Poepp. et Endl.) es la especie arbórea nativa más importante de la Patagonia. Se halla en bosques puros en el límite superior arbóreo a ambos lados de la Cordillera de los Andes. El objetivo de este estudio fue evaluar la variación geográfica y genética de poblaciones naturales de la especie en rasgos cuantitativos potencialmente adaptativos. Se muestrearon poblaciones naturales de la Provincia de Chubut representando los tres gradientes ambientales más relevantes de su área de distribución: latitudinal, altitudinal y de precipitación. Se analizó variación natural en caracteres seminales y se instalaron ensayos de ambiente común en los que se evaluaron variables correspondientes a plántulas en invernadero y plantines en campo. Con los datos obtenidos se estudió variación en caracteres cuantitativos entre y dentro de poblaciones. Los resultados principales muestran evidencias de variación clinal y ecotípica en los gradientes latitudinal y altitudinal, respectivamente, con indicios de adaptación local en el caso del gradiente altitudinal. También se verificó variación genética entre morfotipos. En algunas de las variables consideradas se registró una importante diversidad genética, tanto entre como dentro de poblaciones, mientras que en otras la diversidad fue muy baja. En la discusión se da cuenta del complejo patrón de variación geográfica y genética de la especie, presumiblemente determinado por factores históricos (probablemente relacionado con la última glaciación) y la presión de selección que opera actualmente. Las diferencias fueron evidentes en los gradientes evaluados y entre los diferentes tipos de caracteres, operando procesos de adaptación local y plasticidad fenotípica en un equilibrio variable.

Efecto de la varianza genética aditiva generacional sobre las componentes de la respuesta a la selección en una población con generaciones superpuestas

p.221-230

Estudio de una estrategia alternativa de ingeniería genética para incrementar la fijación biológica de nitrógeno atmosférico

Para satisfacer los altos rendimientos que impulsan la agricultura moderna la aplicación de fertilizantes nitrogenados ha sido fundamental. Dado que la base de la producción industrial de los fertilizantes químicos esta basado en el uso de combustibles fósiles, estos, actualmente, incrementan el costo económico debido a la disminución constante de las reservas de petróleo. Además, dada la baja eficiencia en el uso del fertilizante aplicado por parte de las plantas y el alto impacto ambiental debido a la emisión de óxido nitroso, resulta necesario emprender la búsqueda de nuevas estrategias para aumentar la concentración del nitrógeno fijado. Una de las propuestas para disminuir la aplicación de fertilizantes es el uso de microorganismos fijadores de nitrógeno; que ya son ampliamente utilizados en leguminosas por su capacidad de establecer asociaciones simbióticas; las cuales, lamentablemente, aún no han sido encontradas entre los principales cultivos de cereales. El objetivo del presente trabajo es la producción de una técnica de ingeniería genética que permita obtener bacterias fijadoras de nitrógeno recombinantes capaces de asociarse a distintos cultivos vegetales incrementando la productividad de los mismos. Para ello, los genes que sintetizan la nitrogenasa (nif), que están co-localizados en una isla genómica, en Pseudomonas stutzeri A1501 se transfirieron, vía el cósmido recombinante X940, a un promotor del crecimiento vegetal, Pseudomonas protegens Pf-5. La bacteria recombinante obtenida, P. protegens Pf-5 X940, fue capaz de crecer en medios de cultivo deficientes en nitrógeno o con el agregado de amonio; mostró una alta actividad nitrogenasa, liberando al medio de cultivo cantidades significativas de amonio y presentó expresión de los genes nif, sugiriendo que el proceso de fijación, en esta bacteria, es constitutivo. Las inoculaciones de especies vegetales (arabidopsis, alfalfa, festuca alta y maíz)con Pf-5 X940 aumentaron la concentración de amonio en el suelo y la productividad de las plantas en condiciones deficientes de nitrógeno. Estos resultados inician un nuevo camino hacia la producción efectiva de inoculantes recombinantes para la fijación de nitrógeno en un amplio rango de cultivos

Bases ecofisiológicas de la ganancia genética en el rendimiento del maíz en la Argentina en los últimos 30 años

p.177

Variación geográfica y genética en caracteres adaptativos iniciales de Nothofagus pumilio (Poepp. et Endl.)Krasser en una zona de alta heterogeneidad ambiental

La diversidad genética es un requisito para el cambio evolutivo. Por consiguiente, la conservación de la diversidad genética dentro de las especies es importante para asegurar el potencial de adaptación en un medio ambiente cambiante. La variación genética de los rasgos de importancia adaptativa se puede medir mediante la observación de la variación fenotípica en los ensayos de ambiente común. De acuerdo a su área de distribución y productividad potencial, Nothofagus pumilio (Poepp. et Endl.)es la especie arbórea nativa más importante de la Patagonia. Se halla en bosques puros en el límite superior arbóreo a ambos lados de la Cordillera de los Andes. El objetivo de este estudio fue evaluar la variación geográfica y genética de poblaciones naturales de la especie en rasgos cuantitativos potencialmente adaptativos. Se muestrearon poblaciones naturales de la Provincia de Chubut representando los tres gradientes ambientales más relevantes de su área de distribución: latitudinal, altitudinal y de precipitación. Se analizó variación natural en caracteres seminales y se instalaron ensayos de ambiente común en los que se evaluaron variables correspondientes a plántulas en invernadero y plantines en campo. Con los datos obtenidos se estudió variación en caracteres cuantitativos entre y dentro de poblaciones. Los resultados principales muestran evidencias de variación clinal y ecotípica en los gradientes latitudinal y altitudinal, respectivamente, con indicios de adaptación local en el caso del gradiente altitudinal. También se verificó variación genética entre morfotipos. En algunas de las variables consideradas se registró una importante diversidad genética, tanto entre como dentro de poblaciones, mientras que en otras la diversidad fue muy baja. En la discusión se da cuenta del complejo patrón de variación geográfica y genética de la especie, presumiblemente determinado por factores históricos (probablemente relacionado con la última glaciación)y la presión de selección que opera actualmente. Las diferencias fueron evidentes en los gradientes evaluados y entre los diferentes tipos de caracteres, operando procesos de adaptación local y plasticidad fenotípica en un equilibrio variable.

Estudo da variabilidade genética de marcadores moleculares ligados ao gene da MGP e sua aplicação para paternidades em Sparus aurata

Dissertação de Mestrado, Biologia Marinha, Especialização em Biotecnologia Marinha, Faculdade de Ciências do Mar e do Ambiente, Universidade do Algarve, 2008

Variabilidade genómica de Citrus tristeza virus e transformação genética de Citrus aurantium L. com vista à obtenção de resistência

Tese de dout., Biologia, Faculdade de Engenharia de Recursos Naturais, Univ. do Algarve, 2003

Das ciências naturais à genética : a divulgação científica na revista brotéria (1902-2002) e o ensino científico da companhia de Jesus nos séculos XIX e XX em Portugal

Tese de doutoramento, História e Filosofia das Ciências, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014

Base genética da hipercolesterolemia familiar

Tese de doutoramento, Bioquímica (Genética Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014

Departamento de Genética Humana do INSA e as suas atividades: apresentação no âmbito de uma visita de estudo do ensino secundário

Apresentação das actividades realizadas no Departamento de Genética Humana com particular destaque para a investigação desenvolvida pelo grupo de Toxicologia Genética. Introdução à visita dos alunos aos laboratórios de genética.

PROTECÇÃO INDIVIDUAL À PICADA DE MOSQUITOS: Avaliação Laboratorial e no Campo do Efeito Repelente de Vestuário Tratado com Insecticidas ou Repelentes

RESUMO O controlo vectorial representa uma parte importante da estratégia global actual para a prevenção das principais doenças transmitidas por insectos, como a malária, a febre de dengue ou do West Nile. Uma das vertentes do controlo vectorial é aquela que se associa à protecção individual dos hospedeiros contra a picada de insectos. É no âmbito desta problemática que surge o estudo aqui apresentado. Este teve como um dos objectivos testar em laboratório a eficácia de três compostos diferentes (permetrina, DEET e citronela) contra a picada de mosquitos Anopheles stephensi Liston, 1901, quando aplicados a tecidos de algodão. Com base neste estudo laboratorial, seleccionaram-se os tecidos mais eficientes que foram testados no terreno, na área da Comporta, em ensaios simuladores de uma situação real. Os resultados foram complementados com alguns ensaios preliminares efectuados em laboratório com a espécie Culex theileri Teobald, 1903. Nos primeiros ensaios laboratoriais, tecidos impregnados com permetrina mostraram induzir uma repelência mais eficaz do que tecidos com DEET e citronela micro-encapsulados. O efeito de repelência dos tecidos com permetrina manteve-se, mesmo quando estes foram sujeitos a vários ciclos de lavagem. No entanto, os ensaios de repelência/protecção efectuados no campo demonstraram que a eficácia do tecido impregnado com permetrina é afectada pelo número de lavagens. Testes laboratoriais realizados com Cx. theileri, a espécie mais abundante da área da Comporta, apontam para que a discrepância observada entre os resultados das experiências laboratoriais e de campo possa estar associada a um comportamento diferencial das espécies envolvidas nos dois tipos de ensaio. Em conclusão, embora o uso de vestuário tratado com microcápsulas de repelentes seja um método promissor na protecção contra as picadas de insectos, este terá de beneficiar de algum investimento futuro para que possa vir a ser considerado uma estratégia válida no controlo vectorial a larga escala. Há que melhorar o modo de incorporação e apresentação do composto activo nos tecidos de modo a obter-se um efeito repelente mais efectivo e prolongado e a procura de repelentes naturais, indutores de menor toxicidade e mais repelência, deve ser continuada.

Epidemiologia da malária em Cabo Verde - Factores genéticos humanos e estrutura populacional do mosquito vector

A malária, doença parasitária complexa que resulta da interacção entre parasita, hospedeiros humano e vector, constitui um dos principais problemas de saúde a nível mundial. À semelhança de outras doenças parasitárias e infecciosas a malária tem um papel importante na evolução, tendo já sido demonstrado o papel da variação genética humana na resistência à infecção. Após quase meio século de controlo, a malária persiste na ilha de Santiago onde, apesar da baixa endemicidade, os indivíduos apresentam geralmente manifestações moderadas, são diagnosticadas infecções abaixo do nível detectável pela microscopia e o vector se encontra muito próximo da população supostamente susceptível, desconhecendo-se a frequência dos principais polimorfismos genéticos humanos mais relacionados com a doença e a estrutura populacional do mosquito vector. Os objectivos gerais de trabalho desta tese assentam 1) no estudo dos dois clássicos factores genéticos do hospedeiro humano relacionados com a malária, nomeadamente os afectos à anemia das células falciformes, à deficiência em G6PD e a análise dum provável envolvimento da PK e 2) na análise genética das populações do mosquito vector, tentando contribuir para a compreensão da epidemiologia da doença na Ilha, e para a escolha de medidas de controlo apropriadas. Os trabalhos incidiram na detecção do alelo responsável pela hemoglobina S, de polimorfismos no gene da G6PD e da PK em indivíduos não aparentados (Infectados e não Infectados) com análise da sua provável associação com a infecção e, ainda, na genotipagem de loci microssatélites de Anopheles arabiensis com recurso a técnicas baseadas na PCR. Relativamente à anemia falciforme, a frequência dos portadores do traço (indivíduos HbAS) e do alelo HbS foi 6% e 5%, respectivamente, e para as variantes da G6PD, 0,8% para G6PDA- e 0,0% para a G6PDMed, não tendo sido encontrado associação entre os genótipos desses dois factores e a presença de infecção. No que concerne ao gene PKLR não foi encontrada uma associação clara entre os polimorfismos analisados e o estado de infecção, mas foi detectado um acentuado desequilíbrio de linkage entre os loci, apenas nos Não Infectados, o que pode significar que essa região do gene, aparentemente conservada, tenha sido seleccionada por fornecer protecção contra a infecção e/ou doença. A diversidade genética das populações de A. arabiensis em onze loci microssatélites foi moderada com valores médio de He, variando de 0,481 a 0,522 e a Rs de 4 a 5. O valor da diferenciação genética baseado em 7 loci polimórficos foi baixo (FST=0,012; p<0,001) mas significativo, variando entre 0,001 e 0,023 entre os pares de populações. Não foram detectados os alelos de resistência associados ao gene Kdr. A baixa frequência dos alelos associados à G6PD (A- e Med) tem implicações importantes nas estratégias de controlo definidas pelo Programa Nacional de Luta contra o Paludismo (PNLP), uma vez que a primaquina pode continuar a ser administrada como complemento aos regimes terapêuticos, em caso de necessidade. A população de A. arabiensis em Santiago revelou-se relativamente homogénea e com uma estrutura reduzida o que pode, por um lado, representar uma desvantagem por permitir uma provável dispersão dos genes de resistência. Por outro lado, essa relativa homogeneidade poderá representar uma vantagem para a introdução de um programa de controlo baseado na libertação de mosquitos transgénicos.

Estrutura Genética de Populações de Glossina palpalis gambiensis (Diptera: Glossinidae) na República da Guiné-Bissau

Glossina palpalis gambiensis é o principal vector de Tripanossomose Humana Africana (THA) na África Ocidental e a mosca tsé-tsé mais comum na Guiné-Bissau. Apesar da sua ampla distribuição, nenhum caso de THA tem sido reportado no país desde finais dos anos 70 do século XX. Populações naturais do Grupo palpalis demonstraram diferentes níveis de variação intraespecífica que podem influenciar a sua capacidade vectorial. Portanto, o conhecimento exacto acerca da identidade das espécies e estrutura populacional é essencial para prever o possível restabelecimento e propagação da transmissão de THA na Guiné-Bissau. A variação genética foi analisada em amostras de Glossina palpalis gambiensis de cinco regiões da Guiné-Bissau, com recurso a microssatélites. Três das regiões pertencem à parte continental e duas representam a parte insular do país. No total, 261 moscas tsé-tsé do sexo feminino foram genotipadas para 11 loci microssatélites. Baixos níveis de diferenciação genética foram observados entre as populações de G. p. gambiensis da Guiné-Bissau (FST = 0,006, P = 0,002). Este resultado está de acordo com a análise de agrupamentos, que revelou a presença de um único cluster agrupando todas as amostras, independentemente da origem geográfica. De um modo geral, estes resultados sugerem uma baixa subestruturação populacional em G. p. gambiensis nesta região. Análises de equilíbrio mutação-deriva sugerem ainda a ocorrência de expansão populacional recente. As evidências genéticas sugerem consideráveis níveis de fluxo genético entre as populações continentais e entre as populações insulares e continentais da Guiné-Bissau. No caso do restabelecimento de focos de transmissão de THA, a possibilidade de disseminação do protozoário Trypanosoma, através da dispersão activa das moscas tsé-tsé, deve ser tida em conta no planeamento de estratégias de controlo vectorial na Guiné-Bissau. PALAVRAS-CHAVE: Glossina, Tripanossomose Humana Africana, microssatélites, diferenciação genética.

Flaviviruses in mosquitoes from Southern Portugal, 2009-2010

Os flavivírus são vírus pertencentes à família Flaviviridae, género Flavivirus. Estes formam um grande grupo caraterizado pela sua ampla distribuição e diversidade genética. Os flavivírus são, na sua maioria, transmitidos por artrópodes vectores incluíndo agentes patogénicos para humanos e animais que podem potencialmente provocar grandes epidemias e causar elevadas taxas de mortalidade e morbidade. Nos últimos anos, tem-se registado uma grande expansão a nível da distribuição geográfica dos flavivirus e diversidade dos seus hospedeiros. O vírus do Nilo Ocidental tem sido continuamente detectado em toda a Europa recentemente, e também isolado de mosquitos colhidos no Sul de Portugal, onde já foram registados casos humanos e animais. O principal objectivo deste trabalho é o rastreio de flavivírus em mosquitos colhidos em duas regiões do Sul de Portugal, onde os mesmos foram anteriormente detectados. As colheitas de mosquitos foram realizadas em 24 locais em zonas húmidas nos districtos de Faro e Setúbal, através de armadilhas luminosas tipo CDC com CO2 e aspiradores mecânicos manuais para colheita de mosquitos em repouso em abrigos de animais. Os mosquitos colhidos foram agrupados por lotes contendo aproximadamente 50 espécimens cada, e rastreados para a presença de flavivírus por heminested RT-PCR, direccionado à amplificação de um pequeno fragmento do gene NS5 usando oligonucleótidos degenerados específicos para flavivírus. Entre Abril e Outubro de 2009 e 2010 foram colhidos no total 36273 mosquitos pertencentes às seguintes espécies: Anopheles algeriensis, An.atroparvus, Aedes berlandi, Ae.caspius, Ae.detritus, Coquillettidia richiardii, Culex laticinctus, Cx.pipiens, Cx.theileri, Cx.univittatus, Culiseta annulata, Cs.longiareolata, Cs.subochrea, e Uranotaenia unguiculata. As espécies mais abundantes foram Ae.caspius, Cx.theileri e Cx.pipiens, respectivamente. Contudo, as densidades de mosquitos foram variáveis de acordo com o método de colheita e área de amostragem. As densidades de mosquitos colhidos em 2010 foram quatro vezes superior às registadas no ano anterior. No total foram analisados 745 lotes dos quais 31% testaram positivos para a presença de sequências de flavivirus. As espécies que apresentaram taxas de positividade mais elevadas foram: An.algeriensis com uma Taxa Mínima de Infecção (TMI) de 56/1000 no Algarve em 2009, Cs.annulata TMI =22/1000 no Algarve em 2010, Cx.theileri e Cx.pipiens em Setúbal em 2010, TMI =20/1000. An. atroparvus, Ae. caspius, Ae. detritus e Cx. univittatus também produziram lotes positives. No geral, a positividade foi maior no Algarve. Análise das sequências virais obtidas revelou homologia das nossas sequências virais com sequências de referência de flavivírus específicos de mosquitos depositadas em bases de dados de acesso livre. A análise filogenética reflectiu a variabilidade genética dos flavivírus e revelou a relação genética das nossas sequências com as de outros flavivírus, especialmente os específicos de insectos. Tendo em consideração os anteriores isolamentos do vírus do Nilo Ocidental, o aumento acentuado nas densidades de mosquitos, o aumento de temperaturas que se tem vindo a registar, os casos recentes de transmissão de flavivírus por toda a Europa e o padrão desconhecido e imprevisível dos surtos destes vírus, os programas contínuos de vigilância epidemiológica têm-se revelado uma ferramenta indispensável para a Saúde Pública.