Variabilidade genómica de Citrus tristeza virus e transformação genética de Citrus aurantium L. com vista à obtenção de resistência

Tese de dout., Biologia, Faculdade de Engenharia de Recursos Naturais, Univ. do Algarve, 2003

No presente trabalho foi estudada a variabilidade genómica da região terminal 3´ do CTV com o objectivo de conhecer quais as regiões mais conservadas que podem ser usadas em transformação genética para obter resistência contra o vírus. A partir de um painel de isolados de diferentes origens geográficas e com diversas características biológicas, foram analisados os genes das proteínas p18, p13, p20, p23 e a região 3´UTR. Na maioria dos isolados analisados foi detectado a existência de múltiplas variantes genómicas com uma estrutura do tipo “quasispecies”, por Single Stranded Conformation Polymorphisms (SSCP). Por sequenciação genómica confirmaram-se os dados de SSCP e foram estabelecidos agrupamentos de sequências de acordo com as características biológicas. A região 3´UTR distinguiu-se como a região genómica mais conservada, sendo assim a mais indicada a usar num processo de transformação genética. Os isolados e clones do gene da p25 (ou gene da proteína do capsídio) foram analisados pela técnica Cleavase Fragment Length Polymorphism (CFLP) e agruparam-se segundo a origem geográfica e as propriedades biológicas. Foi notória a capacidade do CFLP na discriminação e tipificação de isolados diferentes de CTV. A transformação genética do porta-enxerto Citrus aurantium cv. Brazilian, mediada pelo vector natural Agrobacterium tumefaciens, foi conseguida por dois processos distintos. Determinou-se a densidade bacteriana das estirpes C58 (nopalina) ou EHA105 (L,L-succinamopina) transportando o plasmídio p35SGUSINT, associada à frequência mais elevada de transformação. Foram transformados rebentos adventícios com o gene uidA, baseado no estabelecimento de um sistema de regeneração de novo a partir de segmentos de entrenós provenientes de plantas com cerca de 12 meses. Outro processo de transformação genética simplificado e que evita a manutenção de culturas in vitro, foi testado em embriões de sementes com 1, 5 e 7 dias de germinação. As plantas foram transformadas com uma construção que contém o gene da CP do CTV de uma estirpe tipificada de “mild”, sob a acção de uma sequência  e de um “enhancer”, os quais aumentam a tradução e a expressão do gene.