Genomic architecture of sickle cell disease clinical variation in children from West Africa : a case-control study design

Contexte : L’anémie falciforme ou drépanocytose est un problème de santé important, particulièrement pour les patients d’origine africaine. La variation phénotypique de l’anémie falciforme est problématique pour le suivi et le traitement des patients. L’architecture génomique responsable de cette variabilité est peu connue. Principe : Mieux saisir la contribution génétique de la variation clinique de cette maladie facilitera l’identification des patients à risque de développer des phénotypes sévères, ainsi que l’adaptation des soins. Objectifs : L’objectif général de cette thèse est de combler les lacunes relatives aux connaissances sur l’épidémiologie génomique de l’anémie falciforme à l’aide d’une cohorte issue au Bénin. Les objectifs spécifiques sont les suivants : 1) caractériser les profils d’expressions génomiques associés à la sévérité de l’anémie falciforme ; 2) identifier des biomarqueurs de la sévérité de l’anémie falciforme ; 3) identifier la régulation génétique des variations transcriptionelles ; 4) identifier des interactions statistiques entre le génotype et le niveau de sévérité associé à l’expression ; 5) identifier des cibles de médicaments pour améliorer l’état des patients atteints d’anémie falciforme. Méthode : Une étude cas-témoins de 250 patients et 61 frères et soeurs non-atteints a été menée au Centre de Prise en charge Médical Intégré du Nourrisson et de la Femme Enceinte atteints de Drépanocytose, au Bénin entre février et décembre 2010. Résultats : Notre analyse a montré que des profils d’expressions sont associés avec la sévérité de l’anémie falciforme. Ces profils sont enrichis de génes des voies biologiques qui contribuent à la progression de la maladie : l’activation plaquettaire, les lymphocytes B, le stress, l’inflammation et la prolifération cellulaire. Des biomarqueurs transcriptionnels ont permis de distinguer les patients ayant des niveaux de sévérité clinique différents. La régulation génétique de la variation de l’expression des gènes a été démontrée et des interactions ont été identifiées. Sur la base de ces résultats génétiques, des cibles de médicaments sont proposées. Conclusion: Ce travail de thèse permet de mieux comprendre l’impact de la génomique sur la sévérité de l’anémie falciforme et ouvre des perspectives de développement de traitements ciblés pour améliorer les soins offerts aux patients.

Identification et caractérisation génétique et phénotypique de deux espèces de Cryptosporidium après divers passages chez le veau

L’étude de la variation du génotype et du phénotype fut réalisée sur deux espèces de parasites intestinaux (Cryptosporidium parvum et C. muris) via une infection expérimentale de 10 passages successifs chez le veau (Bos taurus). L’infection avec C. parvum a bien fonctionné alors qu’aucun signe clinique n’a été observé dans le cadre de cette étude avec C. muris. Pour le génotype, deux gènes (HSP70 et GP60) ont été amplifiés par double PCR puis séquencés. Les résultats ont indiqué que ces gènes n’étaient pas modifiés après 10 passages chez des veaux. Cela montre une faible évolution génétique du parasite lorsqu’il passe dans un animal hôte, facilitant ainsi les études épidémiologiques lors d’épisode de cryptosporidiose. Il faut cependant noter que les parasites utilisés ne provenaient pas de l’environnement mais d’une compagnie spécialisée en parasitologie (WaterBorne®). L’étude de la variation du phénotype a été tentée, sans succès, à l’aide d’un immuno-buvardage en point utilisant le sérum des veaux infectés. Des problèmes liés à la concentration des ookystes de C. parvum placés sur la membrane de l’immuno-buvardage en point furent suspectés.

Destins des S-RNases et interactions moléculaires dans le tube pollinique dans le cadre de l’auto-incompatibilité gamétophytique chez Solanum chacoense

L’auto-incompatibilité (AI) est une barrière reproductive prézygotique qui permet aux pistils d’une fleur de rejeter leur propre pollen. Les systèmes d’AI peuvent prévenir l’autofertilisation et ainsi limiter l’inbreeding. Dans l’AI gamétophytique, le génotype du pollen détermine son propre phénotype d’incompatibilité, et dans ce système, les déterminants mâles et femelles de l’AI sont codés par un locus multigénique et multi-allélique désigné le locus S. Chez les Solanaceae, le déterminant femelle de l’AI est une glycoprotéine stylaire extracellulaire fortement polymorphique possédant une activité ribonucléase et désignée S-RNase. Les S-RNases montrent un patron caractéristique de deux régions hypervariables (HVa et HVb), responsables de leur détermination allélique, et cinq régions hautement conservées (C1 à C5) impliquées dans l’activité catalytique ou la stabilisation structurelle de ces protéines. Dans ce travail, nous avons investigué plusieurs caractéristiques des S-RNases et identifié un nouveau ligand potentiel aux S-RNases chez Solanum chacoense. L’objectif de notre première étude était l’élucidation du rôle de la région C4 des S-RNases. Afin de tester l’hypothèse selon laquelle la région C4 serait impliquée dans le repliement ou la stabilité des S-RNases, nous avons généré un mutant dans lequel les quatre résidus chargés présents en région C4 furent remplacés par des résidus glycine. Cette protéine mutante ne s’accumulant pas à des niveaux détectables, la région C4 semble bien avoir un rôle structurel. Afin de vérifier si C4 est impliquée dans une liaison avec une autre protéine, nous avons généré le mutant R115G, dans lequel un acide aminé chargé fût éliminé afin de réduire les affinités de liaison dans cette région. Ce mutant n’affectant pas le phénotype de rejet pollinique, il est peu probable que la région C4 soit impliquée dans la liaison des S-RNases avec un ligand ou leur pénétration à l’intérieur des tubes polliniques. Enfin, le mutant K113R, dans lequel le seul résidu lysine conservé parmi toutes les S-RNases fût remplacé par un résidu arginine, fût généré afin de vérifier si cette lysine était un site potentiel d’ubiquitination des S-RNases. Toutefois, la dégradation des S-RNases ne fût pas inhibée. Ces résultats indiquent que C4 joue probablement un rôle structurel de stabilisation des S-RNases. Dans une seconde étude, nous avons analysé le rôle de la glycosylation des S-RNases, dont un site, en région C2, est conservé parmi toutes les S-RNases. Afin d’évaluer la possibilité que les sucres conjugués constituent une cible potentielle d’ubiquitination, nous avons généré une S11-RNase dont l‘unique site de glycosylation en C2 fût éliminé. Ce mutant se comporte de manière semblable à une S11-RNase de type sauvage, démontrant que l’absence de glycosylation ne confère pas un phénotype de rejet constitutif du pollen. Afin de déterminer si l’introduction d’un sucre dans la région HVa de la S11-RNase pourrait affecter le rejet pollinique, nous avons généré un second mutant comportant un site additionnel de glycosylation dans la région HVa et une troisième construction qui comporte elle aussi ce nouveau site mais dont le site en région C2 fût éliminé. Le mutant comportant deux sites de glycosylation se comporte de manière semblable à une S11-RNase de type sauvage mais, de manière surprenante, le mutant uniquement glycosylé en région HVa peut aussi rejeter le pollen d’haplotype S13. Nous proposons que la forme non glycosylée de ce mutant constitue un allèle à double spécificité, semblable à un autre allèle à double spécificité préalablement décrit. Il est intéressant de noter que puisque ce phénotype n’est pas observé dans le mutant comportant deux sites de glycosylation, cela suggère que les S-RNases ne sont pas déglycosylées à l’intérieur du pollen. Dans la dernière étude, nous avons réalisé plusieurs expériences d’interactions protéine-protéine afin d’identifier de potentiels interactants polliniques avec les S-RNases. Nous avons démontré que eEF1A, un composant de la machinerie de traduction chez les eucaryotes, peut lier une S11-RNase immobilisée sur résine concanavaline A. Des analyses de type pull-down utilisant la protéine eEF1A de S. chacoense étiquetée avec GST confirment cette interaction. Nous avons aussi montré que la liaison, préalablement constatée, entre eEF1A et l’actine est stimulée en présence de la S11-RNase, bien que cette dernière ne puisse directement lier l’actine. Enfin, nous avons constaté que dans les tubes polliniques incompatibles, l’actine adopte une structure agrégée qui co-localise avec les S-RNases. Ces résultats suggèrent que la liaison entre eEF1A et les S-RNases pourrait constituer un potentiel lien fonctionnel entre les S-RNases et l’altération du cytosquelette d’actine observée lors des réactions d’AI. Par ailleurs, si cette liaison est en mesure de titrer les S-RNases disponibles à l’intérieur du tube pollinique, ce mécanisme pourrait expliquer pourquoi des quantités minimales ou « seuils » de S-RNases sont nécessaires au déclenchement des réactions d’AI.

Syndrome du QT long: étude clinique à l’Institut Cardiologique de Montréal et recherche de nouvelles variantes causales par séquençage à haut débit

Le syndrome du QT long congénital (LQTS) est une canalopathie génétique, à l’origine de syncopes et mort subite. Le dépistage génétique identifie des variantes génétiques dans 50-70% des cas, suggérant l’implication d’autres gènes. Nous avons recueilli les caractéristiques des patients avec un LQTS à l’ICM, et recruté 12 patients avec un génotype négatif pour le LQTS pour un séquençage à haut débit des exons afin d’identifier de nouvelles variantes causales. Nous avons développé une approche analytique par étapes : (1) les gènes connus du, (2) les gènes dans des loci identifiés par des études d’association sur le QT, et (3) les gènes montrant la même variante chez plusieurs patients. L’analyse génétique a identifié de nouvelles variantes dans: (1) KCNJ2, ANK2 et AKAP9, et (2) dans NOS1AP. (3) Deux patientes avec des phénotypes semblables présentent la même variante homozygote dans TECRL, un nouveau gène candidat dont le rôle est inconnu.

Étude pharmacogénomique de la warfarine et de l'activité physique

La warfarine est un médicament anticoagulant possédant un faible index thérapeutique et une grande variabilité intra et interindividuelle dans la réponse au traitement. Les facteurs déterminants de la réponse à la warfarine ne sont pas tous connus et la présente étude vise à tester l'hypothèse que la pratique régulière d’activité physique puisse y être associée. Nous avons évalué si l’activité physique, mesurée à l’aide de 2 questionnaires différents, était associée à la dose de warfarine et au pourcentage de temps passé à l'intérieur de l'intervalle thérapeutique ciblé (time in therapeutic range : TTR). L’étude a été menée chez les 1064 participants de la Cohorte warfarine de l’Institut de Cardiologie de Montréal (ICM) et chez 618 utilisateurs de warfarine issus de la Biobanque de l’ICM. Nous avons trouvé que, dans les deux cohortes, les patients actifs nécessitaient une dose hebdomadaire moyenne plus élevée que les patients inactifs. L’association perdurait lorsque le modèle statistique était ajusté pour différentes variables connues pour influencer la réponse à la warfarine, telles que le génotype aux gènes CYP2C9 et VKORC1, l’âge, la taille, le poids, et l’INR ciblé. L’INR ciblé est décidé par le médecin et il correspond généralement à 2,0 – 3,0 ou 2,5 – 3,5. Les patients de la Cohorte warfarine avaient aussi plus de chances d’avoir un TTR inférieur à 60%, donc d’être moins stables. La pratique régulière d’activité physique est donc un facteur déterminant de la dose thérapeutique de warfarine et la pratique d'activité physique intensive est associée à un TTR plus faible.

Cell lines and animal model in the analysis of pharmacogenomics markers in childhood acute lymphoblastic leukemia

La leucémie aiguë lymphoblastique (LAL) est le cancer pédiatrique le plus fréquent. Elle est la cause principale de mortalité liée au cancer chez les enfants due à un groupe de patient ne répondant pas au traitement. Les patients peuvent aussi souffrir de plusieurs toxicités associées à un traitement intensif de chimiothérapie. Les études en pharmacogénétique de notre groupe ont montré une corrélation tant individuelle que combinée entre les variants génétiques particuliers d’enzymes dépendantes du folate, particulièrement la dihydrofolate réductase (DHFR) ainsi que la thymidylate synthase (TS), principales cibles du méthotrexate (MTX) et le risque élevé de rechute chez les patients atteints de la LAL. En outre, des variations dans le gène ATF5 impliqué dans la régulation de l’asparagine synthetase (ASNS) sont associées à un risque plus élevé de rechute ou à une toxicité ASNase dépendante chez les patients ayant reçu de l’asparaginase d’E.coli (ASNase). Le but principal de mon projet de thèse est de comprendre davantage d’un point de vue fonctionnel, le rôle de variations génétiques dans la réponse thérapeutique chez les patients atteints de la LAL, en se concentrant sur deux composants majeurs du traitement de la LAL soit le MTX ainsi que l’ASNase. Mon objectif spécifique était d’analyser une association trouvée dans des paramètres cliniques par le biais d’essais de prolifération cellulaire de lignées cellulaires lymphoblastoïdes (LCLs, n=93) et d’un modèle murin de xénogreffe de la LAL. Une variation génétique dans le polymorphisme TS (homozygosité de l’allèle de la répétition triple 3R) ainsi que l’haplotype *1b de DHFR (défini par une combinaison particulière d’allèle dérivé de six sites polymorphiques dans le promoteur majeur et mineur de DHFR) et de leurs effets sur la sensibilité au MTX ont été évalués par le biais d’essais de prolifération cellulaire. Des essais in vitro similaires sur la réponse à l’ASNase de E. Coli ont permis d’évaluer l’effet de la variation T1562C de la région 5’UTR de ATF5 ainsi que des haplotypes particuliers du gène ASNS (définis par deux variations génétiques et arbitrairement appelés haplotype *1). Le modèle murin de xénogreffe ont été utilisé pour évaluer l’effet du génotype 3R3R du gène TS. L’analyse de polymorphismes additionnels dans le gène ASNS a révélé une diversification de l’haplotype *1 en 5 sous-types définis par deux polymorphismes (rs10486009 et rs6971012,) et corrélé avec la sensibilité in vitro à l’ASNase et l’un d’eux (rs10486009) semble particulièrement important dans la réduction de la sensibilité in vitro à l’ASNase, pouvant expliquer une sensibilité réduite de l’haplotype *1 dans des paramètres cliniques. Aucune association entre ATF5 T1562C et des essais de prolifération cellulaire en réponse à ASNase de E.Coli n’a été détectée. Nous n’avons pas détecté une association liée au génotype lors d’analyse in vitro de sensibilité au MTX. Par contre, des résultats in vivo issus de modèle murin de xénogreffe ont montré une relation entre le génotype TS 3R/3R et la résistance de manière dose-dépendante au traitement par MTX. Les résultats obtenus ont permis de fournir une explication concernant un haut risque significatif de rechute rencontré chez les patients au génotype TS 3R/3R et suggèrent que ces patients pourraient recevoir une augmentation de leur dose de MTX. À travers ces expériences, nous avons aussi démontré que les modèles murins de xénogreffe peuvent servir comme outil préclinique afin d’explorer l’option d’un traitement individualisé. En conclusion, la connaissance acquise à travers mon projet de thèse a permis de confirmer et/ou d’identifier quelques variants dans la voix d’action du MTX et de l’ASNase qui pourraient faciliter la mise en place de stratégies d’individualisation de la dose, permettant la sélection d’un traitement optimum ou moduler la thérapie basé sur la génétique individuelle.

Caractérisation biochimique et fonctionnelle du mutant T179N de l’aquaporine-2 humaine

L’aquaporine-2 (AQP2) est le canal responsable de la réabsorption finale d’eau au niveau du tubule collecteur du rein. À la base, contenue dans des vésicules internes, l’AQP2 est acheminée à la membrane apicale des cellules principales du tubule collecteur suite à une stimulation par l’hormone antidiurétique (ADH). L’incapacité à accomplir cette fonction entraîne le diabète insipide néphrogénique (DIN), une maladie caractérisée par l’inhabileté du rein à concentrer l’urine, entraînant une production de volumes urinaires élevés. Alors que les mutations récessives génèrent des protéines mal structurées et incapables de former des tétramères, les mutations dominantes sont capables de s’associer à leurs homologues sauvages, engendrant ainsi un DIN même chez les patients hétérozygotes. Ce mémoire présente l’analyse biochimique et fonctionnelle d’une nouvelle mutation naturelle de l’AQP2, la mutation T179N, aussi responsable du DIN. Cette dernière est particulièrement intéressante de par son génotype qui implique un caractère dominant, et sa position extracellulaire habituellement réservée aux mutations récessives. Les études comparatives de T179N à deux modèles de mutation récessive et dominante démontrent, tant en ovocytes de Xenopus laevis qu’en lignée cellulaire mpkCCDc14, le caractère récessif de cette nouvelle mutation. Les tests d’immunobuvardage de lysats d’ovocytes en membranes totales et membranes plasmiques purifiées ont révélé que seule la forme sauvage atteint la membrane plasmique alors que le mutant T179N est séquestré dans la cellule. En accord avec ce résultat, les analyses de perméabilité fonctionnelle démontrent aussi une absence d’activité pour T179N. En cellule mpkCCDc14, le mutant T179N exprimé seul n’atteint pas la membrane plasmique suite à l’action de la forskoline, contrairement à la forme sauvage. Cependant, ce mutant peut s’associer à son homologue sauvage en coexpression tant dans les ovocytes qu’en lignée mpkCCDc14 sans toutefois engendrer l’effet typique de dominance négative. En fait, dans ce contexte de coexpression, on remarque une augmentation de la Pf de 83±7 % et une récupération d’adressage à la membrane plasmique en cellule (immunofluorescence). En conclusion, T179N serait un mutant récessif fonctionnellement récupérable lorsqu’en présence de l’AQP2 sauvage.

Analyse de l'effet de la contamination du sol sur la croissance et la physiologie de 11 cultivars de Salix

Mon mémoire de maîtrise a été réalisé dans le cadre du projet Génorem (www.genorem.ca), un projet multidisciplinaire qui réunit différents chercheurs de l'Université de Montréal et de l'Université McGill dans le but d'améliorer les techniques utilisées en bioremédiation. Dans le cadre de l'étude, des saules à croissance rapide (Salix sp.) ont été utilisés comme plantes modèles dans l'étude. Ainsi, 11 cultivars de saule ont été suivis afin de déterminer leur potentiel à produire un bon rendement de biomasse, à tolérer des conditions de stress sévère causé par la présence de HAPs (hydrocarbures aromatiques polycycliques) , BPCs (biphényles polychlorés) et d'hydrocarbures pétroliers C10-C50. L'expérimentation consistait en une plantation de saule à forte densité qui a été mise en place en 2011 sur le site d'une ancienne industrie de pétrochimie à Varennes, dans le sud du Québec. Les boutures des génotypes sélectionnés ont été plantées sur une superficie d'environ 5000 m2. Les plantes ont été suivies pendant les deux saisons de croissance suivant le recépage et une série de paramètres de croissance et de mesures physiologiques ont été récoltés (surface foliaire, taux de chlorophylle, conductance stomatique et statut nutritionnel) dans le but d'évaluer et de comparer les performances de chaque génotype sur un sol pollué. Les analyses statistiques ont démontré que le cultivar S. miyabeana (SX61) était le meilleur producteur de biomasse sur le site contaminé, tandis que S. nigra (S05) et S. acutifolia (S54) présentaient la meilleure capacité photosynthétique. S. dasyclados (SV1), S. purpurea (‘Fish Creek’) et S. caprea (S365) ont semblé particulièrement affectés par la présence de contaminants. La capacité d'établissement et la croissance de S. nigra (S05), S. eriocephala (S25) and S. purpurea x S. miyabeana (‘Millbrook’) indiquent une tolérance globale supérieure à la pollution . Cette analyse comparative des différentes réponses physiologiques des saules cultivés sur un sol contaminé pourra guider le processus de sélection de plantes et les techniques de bioremédiation dans les futurs projets de phytoremédiation.

The impact of early intra-articular corticosteroid injections on the outcome of oligoarticular juvenile idiopathic arthritis

Contexte Un objectif important de la prise en charge de l'arthrite juvénile oligoarticulaire serait d'altérer le cours de la maladie à l'aide d'une thérapie hâtive. Nous avons étudié l'effet des injections intra-articulaires de corticostéroïdes hâtives sur les chances d'atteindre un décompte d'articulation active de zéro et une maladie inactive. Méthode Les données démographiques, cliniques et thérapeutiques des patients avec oligoarthrite juvénile enrôlés dans une étude prospective longitudinale pancanadienne ont été collectées pendant 2 ans. Une injection hâtive était définie comme étant reçue dans les 3 premiers mois suivant le diagnostic. Les équations d'estimation généralisées ont été utilisées pour l'analyse statistique. Résultats Trois cent dix patients ont été inclus. Cent onze (35.8%) ont reçu une injection hâtive. Ces derniers avaient une maladie plus active lors de l'entrée dans l'étude. Les patients exposés à une injection hâtive avaient une chance similaire d'obtenir un décompte d'articulation active de zéro, OR 1.52 (IC95% 0.68-3.37), p=0.306 mais étaient significativement moins à risque d'avoir une maladie inactive, OR 0.35 (IC95% 0.14-0.88), p=0.026. Interprétation Dans cette cohorte de 310 patients avec oligoarthrite juvénile, les injections hâtives de corticostéroïdes n'ont pas mené à une probabilité plus élevée d'atteindre un décompte d'articulation active de zéro ou une maladie inactive. Des problématiques méthodologiques intrinsèques à l'utilisation de données observationnelles pour fins d'estimation d'effets thérapeutiques auraient pu biaiser les résultats. Nous ne pouvons affirmer avec certitude que les injections hâtives n'améliorent pas le décours de la maladie. Des études prospectives adressant les limitations soulevées seront requises pour clarifier la question.

Liens entre l'histoire obstétrique, les facteurs de risque nutritionnels et génétiques, la santé mentale périnatale et la durée de la gestation

Problématique : La période périnatale est critique pour la santé et le développement de l’enfant. Les problèmes de santé mentale pendant la grossesse et après l’accouchement peuvent mener à des conséquences néfastes sur le développement de l’enfant et les issues plus tardives de sa santé. Cette thèse se concentre sur deux problèmes de santé mentale périnatale d’intérêt substantiel : le stress psychosocial pendant la grossesse et la dépression postnatale. Méthodes : Dans la première partie, nous donnons un aperçu de la dépression postnatale et effectuons une revue de la littérature portant sur deux facteurs de risque qui suscitent un nouvel intérêt, soit le génotype du transporteur de la sérotonine et l’état des acides gras oméga-3 polyinsaturés. Ensuite, dans le cadre de la deuxième partie, nous effectuons une revue de la littérature sur le stress psychosocial pendant la grossesse et la naissance prématurée, le tout en discutant les mécanismes physiologiques reliant ces deux derniers. Puis, nous examinons les liens existant entre le stress psychosocial et la durée de gestation au sein de la cohorte 3D, une étude longitudinale réalisée au Québec. Pour conclure, nous effectuons une investigation plus détaillée sur les facteurs de risque de l’anxiété liée à la grossesse dans la cohorte 3D, ceci en mettant l’accent sur l’historique des grossesses antérieures. Résultats : Dans la première partie, trois études menées rigoureusement révèlent des associations entre le génotype du transporteur de la sérotonine et la dépression postnatale. De même, les preuves s’accumulent à l’effet qu’une insuffisance en acides gras oméga-3 polyinsaturés soit associée à un risque plus élevé de dépression postnatale. Des données probantes préliminaires suggèrent qu’il pourrait y avoir une interaction entre les deux nouveaux facteurs de risque. Dans la deuxième partie, la littérature montre des liens entre le stress psychosocial pendant la grossesse et la naissance prématurée qui varient selon les dimensions du stress et le moment de mesure de celui-ci. Des associations plus fortes sont généralement trouvées plus tôt durant la gestation, alors que la perception subjective du stress et l’anxiété liée à la grossesse sont les plus étroitement associées à la naissance prématurée. Les voies comportementales, infectieuses, neuroinflammatoires, et neuroendocriniennes sont identifiées comme mécanismes physiologiques potentiels. Dans notre étude sur le stress psychosocial et la durée de la gestation au sein la cohorte 3D, nous avons observé une faible association entre l’anxiété liée à la grossesse au troisième trimestre et la naissance spontanée avant 39 semaines de gestation. Dans notre étude sur l’histoire obstétrique et l’anxiété liée à la grossesse, des liens indépendants ont été observés entre plusieurs issues de grossesses antérieures et l’anxiété liée à une grossesse subséquente. Conclusions : Les données probantes de la première partie soutiennent un programme de recherche ayant pour but de clarifier les liens entre les acides gras oméga-3 polyinsaturés, le génotype du transporteur de la sérotonine et la dépression postnatale. Dans la deuxième partie, nos résultats mettent en lumière l’importance relative du stress psychosocial comme prédicteur de la durée de gestation, tout en faisant une contribution importante pour des méta-analyses futures. Ils suggèrent d’ailleurs de nouvelles pistes de recherche pour les cadres conceptuels liant le stress et les issues de la naissance.

Typage de la classe génotypique du gène PRDM9 à partir de données de séquençage de Nouvelle Génération

Les positions des évènements de recombinaison s’agrègent ensemble, formant des hotspots déterminés en partie par la protéine à évolution rapide PRDM9. En particulier, ces positions de hotspots sont déterminées par le domaine de doigts de zinc (ZnF) de PRDM9 qui reconnait certains motifs d’ADN. Les allèles de PRDM9 contenant le ZnF de type k ont été préalablement associés avec une cohorte de patients affectés par la leucémie aigüe lymphoblastique. Les allèles de PRDM9 sont difficiles à identifier à partir de données de séquençage de nouvelle génération (NGS), en raison de leur nature répétitive. Dans ce projet, nous proposons une méthode permettant la caractérisation d’allèles de PRDM9 à partir de données de NGS, qui identifie le nombre d’allèles contenant un type spécifique de ZnF. Cette méthode est basée sur la corrélation entre les profils représentant le nombre de séquences nucléotidiques uniques à chaque ZnF retrouvés chez les lectures de NGS simulées sans erreur d’une paire d’allèles et chez les lectures d’un échantillon. La validité des prédictions obtenues par notre méthode est confirmée grâce à analyse basée sur les simulations. Nous confirmons également que la méthode peut correctement identifier le génotype d’allèles de PRDM9 qui n’ont pas encore été identifiés. Nous conduisons une analyse préliminaire identifiant le génotype des allèles de PRDM9 contenant un certain type de ZnF dans une cohorte de patients atteints de glioblastomes multiforme pédiatrique, un cancer du cerveau caractérisé par les mutations récurrentes dans le gène codant pour l’histone H3, la cible de l’activité épigénétique de PRDM9. Cette méthode ouvre la possibilité d’identifier des associations entre certains allèles de PRDM9 et d’autres types de cancers pédiatriques, via l’utilisation de bases de données de NGS de cellules tumorales.

Étude de l’évolution du tropisme et de la pression sélective exercée sur le gène de l’enveloppe du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 au cours de la grossesse et à l’échelle de la population.

Introduction. Le VIH-1 évolue en fonction de la réponse immunitaire spécifique de l’hôte. La pression sélective exercée par la réponse immunitaire VIH-spécifique de l’hôte entraine l’évolution des gènes viraux et à terme détermine l’évolution de la maladie. Cette évolution du virus à l’échelle d’un individu façonne également l’évolution du virus à l’échelle de la population et détermine le devenir de l’épidémie. Le VIH utilise les corécepteurs d’entrée CCR5 (virus R5) et CXCR4 (virus X4) afin d’infecter la cellule cible, et l’évolution du tropisme du virus de R5 vers X4, appelé switch du tropisme, est associé à la progression de la maladie. Les virus R5 sont rencontrés en début d’infection tandis que les virus X4 apparaissent en fin de maladie chez un certain de nombre de patients et sont considérés comme plus virulents. La pression sélective immunitaire exercée sur le gène de l’enveloppe (env) peut donc entrainer l’évolution du tropisme du VIH. La grossesse est un état immunitaire particulier considéré comme étant principalement caractérisé par un biais Th2 nécessaire à l’établissement de la tolérance materno-fétale. Le switch de tropisme de R5 vers X4 en grossesse n’a jamais été documenté, de même que l’évolution des déterminants du tropisme à l’échelle de la population. Hypothèses. Les changements immunitaires associés à l’initiation et la progression de la grossesse engendrent des changements dans la pression immunitaire exercée sur l’enveloppe et peuvent favoriser le switch du tropisme. L’évolution du tropisme du VIH-1 peut être observé à l’échelle de la population au même titre que l’évolution de l’enveloppe virale. Objectifs. Analyser l’évolution du tropisme et décrire la pression sélective sur l’enveloppe des femmes enceintes infectées par le VIH-1. Analyser l’évolution des déterminants du tropisme à l’échelle de la population. Méthodes. Nous avons dans un premier temps analysé l’évolution des déterminants du tropisme et déterminé le génotype et phénotype du VIH-1 chez 19 femmes enceintes issues de la cohorte du centre maternel et infantile sur le SIDA de l’hôpital Sainte-Justine (CMIS). Nous avons ensuite caractérisé et comparé la pression sélective exercée sur env, par une méthode bayésienne, chez 31 femmes enceinte et 29 femmes non-enceintes. Enfin, nous avons analysé et comparé des déterminants du tropisme entre des séquences d’enveloppe contemporaines et anciennes, issues des bases de données du NCBI. Résultats. Nos résultats montrent la présence de virus X4 chez la moitié de notre cohorte, et un switch de tropisme de R5 vers X4 chez 5/19 sujets. Les séquences des femmes enceintes présentaient des taux de substitutions plus élevées que celles des femmes non-enceintes. La pression sélective dans la région C2 était plus faible chez les femmes enceintes que chez les femmes non-enceintes, et différait dans 4 positions entre ces 2 groupes. Cette sélection diminuait au cours de la grossesse chez les patientes traitées. Enfin, une accumulation de mutations X4 a été observée dans les séquences R5 contemporaines par rapport aux séquences R5 anciennes. Conclusion. Les changements immunitaires associés à la grossesse semblent induire des modifications subtiles dans la pression sélective exercée sur env, suffisant à influencer l’évolution du tropisme de R5 vers X4. Un switch du tropisme à l’échelle de la population impliquerait une épidémie évoluant vers une plus grande virulence du virus. Nos résultats sont d’importance en ce qui concerne la prophylaxie antirétrovirale pour la santé de la mère et la prévention de la transmission mère-enfant du VIH-1. Ils sont aussi importants concernant l’avenir de la thérapie antirétrovirale dans le contexte d’une épidémie évoluant vers une plus grande virulence

Anticoagulothérapie à la warfarine : influence de l’apport alimentaire de vitamine K

Un apport élevé de vitamine K a été associé à une meilleure stabilité du traitement à la warfarine. Toutefois, l’effet du gène VKORC1, codant pour une enzyme impliquée dans le métabolisme de la vitamine K et inhibée par la warfarine, sur cette association a été très peu étudié. De plus, il a été suggéré que les patients anticoagulés sont fréquemment conseillés de restreindre leur consommation d’aliments riches en vitamine K dans le contexte clinique. Néanmoins, l’effet de cette recommandation sur l’apport de vitamine K n’est pas établi. Afin d’examiner ces questions, 317 Québécois anticoagulés à la warfarine provenant de 17 sites hospitaliers ont été sondés sur les recommandations alimentaires reçues en début de traitement. L’apport alimentaire habituel de vitamine K a été évalué rétrospectivement sur une période de 12 mois. La stabilité du traitement a été mesurée par le pourcentage de temps passé dans l’intervalle thérapeutique (n=246) du 3e au 12e mois suivant l’initiation du traitement. La majorité des patients (68%) ont rapporté avoir été conseillés de restreindre leur consommation d’aliments riches en vitamine K. L’adhérence à cette recommandation était associée à de plus faibles apports alimentaires de vitamine K. De plus, l’apport alimentaire de vitamine K était positivement associé à la stabilité du traitement, et cette relation n’était pas modulée par le génotype de VKORC1. Ces données ont permis d’illustrer des lacunes dans l’éducation nutritionnelle prodiguée aux patients anticoagulés à la warfarine, et ont contribué à la recherche portant sur l’interaction entre l’apport de vitamine K et la warfarine.

Étude du polymorphisme rs3846662 de l’HMGCR dans le cerveau et le système périphérique

Dans cette thèse, l’impact du polymorphisme rs3846662 sur l’épissage alternatif de la 3-hydroxy-3-méthylglutaryl coenzyme A réductase (HMGCR) a été investigué in vivo, chez des patients atteints d’hypercholestérolémie familiale (HF) ou de maladie d’Alzheimer (MA). Le premier manuscrit adresse la problématique de la normalisation de la quantification relative des ARNm par PCR quantitative. Les découvertes présentées dans ce manuscrit nous ont permis de déterminer avec un haut niveau de confiance les gènes de référence à utiliser pour la quantification relative des niveaux d’ARNm de l’HMGCR dans des échantillons de sang (troisième manuscrit) et de tissus cérébraux post-mortem (quatrième manuscrit). Dans le deuxième manuscrit, nous démontrons grâce à l’emploi de trois cohortes de patients distinctes, soit la population canadienne française du Québec et les deux populations nord américaines « Alzheimer’s Disease Cooperative Study (ADCS) » et « Alzheimer’s Disease Neuroimaging Initiative (ADNI) », que le génotype AA au locus rs3846662 confère à ces porteurs une protection considérable contre la MA. Les femmes porteuses de ce génotype voient leur risque de MA diminuer de près de 50% et l’âge d’apparition de leurs premiers symptômes retarder de 3.6 ans. Les porteurs de l’allèle à risque APOE4 voient pour leur part leurs niveaux de plaques séniles et dégénérescences neurofibrillaires diminuer significativement en présence du génotype AA. Enfin, les individus atteints de déficit cognitif léger et porteurs à la fois de l’allèle APOE4 et du génotype protecteur AA voient leur risque de convertir vers la MA chuter de 76 à 27%. Dans le troisième manuscrit, nous constatons que les individus atteints d’HF et porteurs du génotype AA ont, contrairement au modèle établi chez les gens normaux, des niveaux plus élevés de cholestérol total et de LDL-C avant traitement comparativement aux porteurs de l’allèle G. Le fait que cette association n’est observée que chez les non porteurs de l’APOE4 et que les femmes porteuses du génotype AA présentent à la fois une augmentation des niveaux d’ARNm totaux et une résistance aux traitements par statines, nous indique que ce génotype influencerait non seulement l’épissage alternatif, mais également la transcription de l’HMGCR. Comme une revue exhaustive de la littérature ne révèle aucune étude abondant dans ce sens, nos résultats suggèrent l’existence de joueurs encore inconnus qui viennent influencer la relation entre le génotype AA, l’épissage alternatif et les niveaux d’ARNm de l’HMGCR. Dans le quatrième manuscrit, l’absence d’associations entre le génotype AA et les niveaux d’ARNm Δ13 ou de protéines HMGCR nous suggère fortement que ce polymorphisme est non fonctionnel dans le SNC affecté par la MA. Une étude approfondie de la littérature nous a permis d’étayer cette hypothèse puisque les niveaux de HNRNPA1, la ribonucléoprotéine influencée par l’allèle au locus rs3846662, sont considérablement réduits dans la MA et le vieillissement. Il est donc proposé que les effets protecteurs contre la MA associés au génotype AA soient le résultat d’une action indirecte sur le processus physiopathologique.

Étude du polymorphisme rs3846662 de l’HMGCR dans le cerveau et le système périphérique

Dans cette thèse, l’impact du polymorphisme rs3846662 sur l’épissage alternatif de la 3-hydroxy-3-méthylglutaryl coenzyme A réductase (HMGCR) a été investigué in vivo, chez des patients atteints d’hypercholestérolémie familiale (HF) ou de maladie d’Alzheimer (MA). Le premier manuscrit adresse la problématique de la normalisation de la quantification relative des ARNm par PCR quantitative. Les découvertes présentées dans ce manuscrit nous ont permis de déterminer avec un haut niveau de confiance les gènes de référence à utiliser pour la quantification relative des niveaux d’ARNm de l’HMGCR dans des échantillons de sang (troisième manuscrit) et de tissus cérébraux post-mortem (quatrième manuscrit). Dans le deuxième manuscrit, nous démontrons grâce à l’emploi de trois cohortes de patients distinctes, soit la population canadienne française du Québec et les deux populations nord américaines « Alzheimer’s Disease Cooperative Study (ADCS) » et « Alzheimer’s Disease Neuroimaging Initiative (ADNI) », que le génotype AA au locus rs3846662 confère à ces porteurs une protection considérable contre la MA. Les femmes porteuses de ce génotype voient leur risque de MA diminuer de près de 50% et l’âge d’apparition de leurs premiers symptômes retarder de 3.6 ans. Les porteurs de l’allèle à risque APOE4 voient pour leur part leurs niveaux de plaques séniles et dégénérescences neurofibrillaires diminuer significativement en présence du génotype AA. Enfin, les individus atteints de déficit cognitif léger et porteurs à la fois de l’allèle APOE4 et du génotype protecteur AA voient leur risque de convertir vers la MA chuter de 76 à 27%. Dans le troisième manuscrit, nous constatons que les individus atteints d’HF et porteurs du génotype AA ont, contrairement au modèle établi chez les gens normaux, des niveaux plus élevés de cholestérol total et de LDL-C avant traitement comparativement aux porteurs de l’allèle G. Le fait que cette association n’est observée que chez les non porteurs de l’APOE4 et que les femmes porteuses du génotype AA présentent à la fois une augmentation des niveaux d’ARNm totaux et une résistance aux traitements par statines, nous indique que ce génotype influencerait non seulement l’épissage alternatif, mais également la transcription de l’HMGCR. Comme une revue exhaustive de la littérature ne révèle aucune étude abondant dans ce sens, nos résultats suggèrent l’existence de joueurs encore inconnus qui viennent influencer la relation entre le génotype AA, l’épissage alternatif et les niveaux d’ARNm de l’HMGCR. Dans le quatrième manuscrit, l’absence d’associations entre le génotype AA et les niveaux d’ARNm Δ13 ou de protéines HMGCR nous suggère fortement que ce polymorphisme est non fonctionnel dans le SNC affecté par la MA. Une étude approfondie de la littérature nous a permis d’étayer cette hypothèse puisque les niveaux de HNRNPA1, la ribonucléoprotéine influencée par l’allèle au locus rs3846662, sont considérablement réduits dans la MA et le vieillissement. Il est donc proposé que les effets protecteurs contre la MA associés au génotype AA soient le résultat d’une action indirecte sur le processus physiopathologique.