RT-PCR for confirmation of echovirus 30 isolated in Belém, Brazil

Echovirus (Echo) 30 or human enterovirus B is the most frequent enterovirus associated with meningitis cases. Epidemics and outbreaks of this disease caused by Echo 30 have occurred in several countries. In Brazil, Echo 30 has been isolated from sporadic cases and outbreaks that occurred mainly in the south and southeast regions. We used RT-PCR to examine Echo 30 isolates from meningitis cases detected from March 2002 to December 2003 in Belém, state of Pará, in northern Brazil. The patients were attended in a Basic Health Unit (State Health Secretary of Pará), where cerebrospinal fluid (CSF) was collected and stored in liquid nitrogen. Weekly visits were made by technicians from Evandro Chagas Institute to the health unit and samples were stored at -70ºC in the laboratory until use. HEp-2 and RD cell lines were used for viral isolation and neutralization with specific antisera for viral identification. RNA extraction was made using Trizol reagent. The RT-PCR was made in one step, and the total mixture (50 µL) was composed of: RNA, reaction buffer, dNTP, primers, Rnase inhibitor, reverse transcriptase, Taq polymerase and water. The products were visualized in agarose gel stained with ethidium bromide, visualized under UV light. Among the 279 CSF samples examined, 30 (10.7%) were EV positive, 29 being Echo 30 and one was Cox B. Nineteen Echo 30 were examined with RT-PCR; 18 tested positive (762 and 494 base pairs). The use of this technique permitted viral identification in less time than usual, which benefits the patient and is of importance for public-health interventions.

Epidemiologia molecular das infecções por rotavírus G2 ao longo de 16 anos (1992 a 2008) na região amazônica, Brasil

No Brasil, estima-se que os rotavírus causem 3.352.053 episódios de diarreia, 655.853 ambulatoriais, 92.453 hospitalizações e 850 mortes envolvendo crianças menores de 5 anos de idade. Os rotavírus pertencem à família Reoviridae, gênero Rotavirus. A partícula viral é constituída por três camadas proteicas concêntricas e pelo genoma viral reunindo 11 segmentos de RNA com dupla fita. Reconhecem-se 23 genótipos G e 31 genótipos P. Dentre os genótipos G detectados até o momento, o G2 atua como um dos mais importantes, estando geralmente associado ao genótipo P[4]. Nos últimos três anos se tem observado em larga escala global a reemergência do genótipo G2, sendo um dos mais detectados nos anos que sucederam a implantação da vacina contra rotavírus, particularmente no Brasil. Este estudo teve como objetivo a caracterização molecular de amostras do tipo G2 obtidas de crianças participantes de estudos em gastroenterites virais na região amazônica, Brasil, no período de 1992 a 2008. Foram selecionadas 53 amostras positivas para rotavírus genótipo G2 que foram sequenciadas para VP7 e 38 para VP4. Inicialmente, as amostras foram genotipadas por RT-PCR e seus produtos purificados, quantificados e sequenciados. As amostras também foram testadas quanto ao perfil de migração dos segmentos de RNA. As sequências obtidas dos genes VP4 e VP7 foram alinhadas e editadas no programa Bioedit (v.6.05) e comparadas a outras sequências de RV registradas no banco de genes utilizando o programa BLAST. A árvore filogenética foi feita utilizando o programa Mega 2.1. Do total de 53 amostras sequenciadas para o gene VP7, a análise filogenética revelou a existência de duas linhagens (II e III) e três sublinhagens (IIa, IIc, IId) que circularam em períodos diferentes na população. Amostras das sub-linhagem IIa e IIc apresentaram mutação na posição no aminoácido da posição 96 (Asp/ Asn) . Essa modificação pode resultar em uma alteração conformacional dos epítopos reconhecidos por anticorpos neutralizantes. As linhagens de G2 que circularam em Belém foram idênticas àquelas de outros Estados da região amazônica envolvidos no estudo. O gene VP[4] foi sequenciado na região da VP8*, sendo 36 pertencentes do genótipo P[4] e 3 ao P[6]. No genótipo P[4] foi identificada a circulação de duas linhagens, P[4]-4 ocorrendo nos anos de 1998-2000, e P[4]-5 que circulou nos períodos de 1993-1994 e 2006-2008. Nossos resultados reforçam dados de ocorrência continental que evidenciam a reemergência do genótipo G2 com a variante gênica IIc, a qual se estabeleceu na população em associação com o genótipo P[4]-5. A grande homologia entre as cepas de G2 que circularam entre os diferentes estados envolvidos no estudo sugere que as mutações registradas ultrapassaram barreiras geográficas e temporais.

Análise molecular dos genes VP4, VP7 e NSP4 de rotavírus do tipo G1 circulantes em Belém e Marituba, Pará, Brasil, de 1982 a 2008

Os rotavírus são os principais agentes virais causadores de gastrenterite aguda e responsáveis por 36% dos casos hospitalizações entre crianças menores de cinco anos, resultando em 453.000 óbitos anualmente, principalmente em países em desenvolvimento. Pertencem à família Reoviridae, gênero Rotavirus, possui RNA de dupla fita (dsRNA) com 11 segmentos codificando 12 proteínas. O genótipo G1 se apresenta geralmente com maior frequência nas investigações epidemiológicas, circulando em várias partes do mundo sob diferentes prevalências. Este estudo teve como objetivo analisar a variabilidade genética dos genes VP4, VP7 e NSP4 dos rotavírus G1 circulantes nos municípios de Belém e Marituba, Pará, Brasil, no período de 1982 a 2008. Foram selecionadas 83 amostras previamente caracterizadas como G1 e submetidas a RT-PCR. Os espécimes foram provenientes de sete estudos realizados no IEC. Foi possível a amplificação para os três genes em estudo de 63 (75,9%) espécimes. Foram detectadas as linhagens 1 (8/63, 12,7 %), 2 (29/63, 46,0%), 3 (18/63, 28,6%) e 9 (8/63, 12,7%) para o gene VP7. Co-predominaram as sublinhagens 2E e 3A concorrendo com um total de 57,1% (36/63) das amostras. Foram observadas três substituições de aminoácidos (97 [D→E], 147 [S→N] e 218 [I→V]) no gene VP7 nas regiões antigênicas (A, B e C) nas amostras das linhagens 1, 2 e 9. Todas as amostras apresentaram a especificidade P[8] para o gene VP4 e as linhagens 2 (21/63, 33,3%) e 3 (42/63, 66,7%) foram detectadas. No gene da VP4 ocorreram duas alterações (35 [I→V] e 38 [S→G]) na região antigênica em todas as amostras analisadas. Para o gene NSP4, todas as amostras pertenceram ao tipo E1. Houve mudanças de nucleotídeos nas posições 47 (C→T) e 101 (T→C), resultando em alteração aminoacídica nos resíduos 16 (S→P) e 34 (L→P) em todas as amostras analisadas e nove espécimes demonstraram alteração no sítio de toxicidade da NSP4 (aa 131). Tal análise permitiu ampliar o conhecimento da diversidade genética e da circulação de variantes de rotavírus G1, representando o primeiro estudo da epidemiologia molecular deste genótipo no Brasil e confirmar a alta heterogeneidade que este tipo apresenta.

Epidemiologia molecular do Vírus Oropouche (Bunyaviridae: Orthobunyavirus) na Amazônia brasileira

O Virus Oropouche (VORO; Bunyaviridae, Orthobunyavirus) é um dos mais importantes arbovírus que infecta humanos na Amazônia brasileira, e é causador da febre do Oropouche. Entre 1961 e 2009, um grande número de epidemias foi registrado em diferentes centros urbanos dos Estados Brasileiros do Acre, Amapá, Amazonas, Maranhão, Pará, Rondônia e Tocantins, e também no Panamá, Peru e Trinidad & Tobago. Este trabalho teve por objetivo desenvolver um estudo retrospectivo dos aspectos epidemiológicos e moleculares do VORO enfatizando sua distribuição, a dinâmica das epidemias ocorridas no período, bem como a dispersão de diferentes genótipos na América Latina e no Brasil como contribuição à epidemiologia molecular do VORO. Para tanto 66 isolamentos do VORO pertencentes ao acervo do Instituto Evandro Chagas foram propagados em camundongos e em cultura de células VERO, seguida da extração do RNA viral e obtenção do cDNA por RTPCR; os amplicons foram purificados e submetidos ao sequenciamento nucleotídico para análises moleculares e evolução, incluindo o rearranjo genético, estudo de relógio molecular e análise de dispersão viral. Foi demonstrada a presença de quatro linhagens distintas do VORO na Amazônia brasileira (genótipos I, II, III e IV), sendo os genótipos I e II, respectivamente os mais frequentemente encontrados em áreas da Amazônia ocidental e oriental. Esses e o genótipo III estão constantemente evoluindo, mediante o mecanismo “boom and boost” que resulta na emergência seguida de substituição das sublinhagens (subgenótipos) circulantes por outras mais recentes. O genótipo III do VORO, previamente encontrado somente no Panamá, foi descrito na Amazônia e Sudeste do Brasil. Os dados obtidos pela análise filogenética comparativa das topologias para os segmentos PRNA e MRNA sugerem que o VORO utiliza o rearranjo genético como mecanismo de geração de biodiversidade viral, sendo o genótipo I o mais estável e o II o mais instável e, portanto, mais sensível às pressões evolutivas; foi reconhecido um novo genótipo do VORO neste estudo em amostras isoladas em Manaus no ano de 1980, que foi denominado de genótipo IV. O estudo do relógio molecular mostrou que a emergência do VORO se deu no Estado do Pará provavelmente há 223 anos e daí ao longo dos anos se dispersou pela PanAmazônia bem como para o Caribe, sendo que o genótipo I foi o que originou os demais genótipos do VORO.

Detecção, epidemiologia e análise molecular de rotavírus, picobirnavírus e reovírus em aves de corte criadas em granjas na mesorregião metropolitana de Belém, Pará, Brasil

Este estudo objetivou investigar a ocorrência de rotavírus aviário (RVA), picobirnavírus (PBV) e reovírus aviário (ARV) em aves de corte criadas em granjas situadas na Mesorregião Metropolitana de Belém, Pará, no período compreendido entre 2008 a 2011. Para tal, foram colhidos 85 pools de amostras fecais provenientes de 37 granjas pertencentes a oito municípios. O RNA viral foi extraído a partir das suspensões fecais e submetido à eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA) seguido da RT-PCR. Foi selecionada pelo menos uma amostra de cada município positivo para o sequenciamento de nucleotídeos dos genes NSP4 (rotavírus), RdRp (picobirnavírus) e S2 (reovírus), sendo que no caso dos picobirnavírus as amostras foram clonadas antes do sequenciamento. A EGPA demonstrou positividade em 0/85 (0%) amostras para RVA do grupo A, 13/85 (15,3%) amostras para PBV e 01/85 (1,2%) amostras para ARV. No caso da RT-PCR foi verificado positividade em 35/85 (41,2%), 42/85 (49,4%) e 28/85 (32,9%) das amostras para RVA, PBV e ARV, respectivamente. Dos oito municípios estudados, sete apresentaram amostras positivas para PBV e seis apresentaram amostras positivas para RVA e ARV. Das 37 granjas estudadas foi observada a presença dessas infecções virais em 19 (51,4%) para RVA e ARV e 21 (56,8%) para PBV. As sequências do gene NSP4 apresentaram entre 86,3 e 90,5% de similaridade ao nível de nucleotídeo (nt) com protótipos de frangos e 93,5 e 100% de similaridade ao nível de nt quando comparadas entre si. As sequências do gene RdRp apresentaram uma grande heterogeneidade genética com variantes gênicas apresentando entre 56,1 e 100% de similaridade ao nível de nt com protótipos pertencentes a várias espécies e fontes de contaminação e entre 50,3 e 100% de similaridade ao nível nt quando comparadas entre si. Na análise das sequências do gene S2 de ARV foi observado entre 90,9 e 94,4% de similaridade ao nível de nt com protótipos de frangos e 90,1 e 100% de similaridade ao nível de nt quando comparadas entre si. Os RVA, PBV e ARV foram detectados em granjas de frangos de corte da Mesorregião Metropolitana de Belém, sendo a detecção por RT-PCR a mais eficiente ao detectar pelo menos um dos vírus nos oito municípios pesquisados. Excetuando-se o PBV, que apresentou relacionamento heterogêneo com os protótipos utilizados, o RVA e ARV deste estudo relacionaram-se especificamente com amostras obtidas em aves. Este é o primeiro estudo envolvendo o sequenciamento gênico do RVA, PBV e ARV em frangos de corte na região norte do Brasil.

Caracterização molecular de cepas do vírus respiratório sincicial isoladas de casos de infecção respiratória aguda na cidade de Belém, Pará, Brasil nos anos de 2000 a 2006

As doenças do trato respiratório são as principais queixas nos serviços de atendimento médico, sendo as infecções respiratórias agudas (IRA) as manifestações mais comuns, principalmente em crianças menores de cinco anos de idade. Em países em desenvolvimento as IRA constituem um sério problema de saúde pública. Em todo mundo estima-se que ocorram cerca de dois milhões de mortes devido as IRA a cada ano. Dentre os agentes causais das mesmas, destaca-se o Vírus Respiratório Sincicial (VRS), especialmente por causar doença grave em crianças menores de dois anos. Com o objetivo de gerar dados sobre a epidemiologia molecular deste vírus, foram analisadas amostras colhidas de pacientes com IRA no período de 2000 a 2006 na cidade de Belém, Pará. Foram utilizados testes de imunofluorescência indireta (IFI) para caracterização antigênica dos vírus isolados e RT-PCR para os genes codificadores das proteínas G e F, que foram em seguida parcialmente seqüenciados. Dentro do período estudado, 153 amostras positivas para VRS foram detectadas. A faixa etária de 0-4 anos foi a que concentrou maior número de casos (n=138; 90,19%). Em relação ao perfil sazonal, o pico de atividade do VRS ocorreu nos primeiros seis meses do ano, estando associado principalmente ao período de troca da estação chuvosa para um período de menor pluviosidade. Houve co-circulação dos subgrupos A e B nos anos de 2001 e 2003. Em 2000, 2005 e 2006 somente o subgrupo A circulou. Entretanto no ano de 2004 foi registrada a ocorrência somente do subgrupo B. Dentro do período estudado, genótipos distintos da proteína G do subgrupo A (GA2 e GA5) e do subgrupo B (SAB1 e SAB3) foram detectados, indicando o primeiro relato da circulação do genótipo SAB1 na América do Sul. Em 2004, um cluster diferenciado dos demais genótipos circulantes foi encontrado, sendo este denominado BRB1. A análise do gene codificador da proteína F permitiu a identificação de mutações na sequência nucleotídica resultando em trocas na cadeia aminoacídica da mesma. Este estudo representa o primeiro relato sobre dados da epidemiologia molecular do Vírus Respiratório Sincicial na região Norte do Brasil.

Ocorrência de rotavírus do grupo D em aves criadas em granjas na mesorregião metropolitana de Belém, Pará

Os rotavírus infectam seres humanos e várias espécies de animais e são constituídos por partículas icosaédricas, não envelopadas, formadas por um genoma de 11 segmentos de dsRNA. São classificados em sete grupos designados de A-G. O rotavírus do grupo D (RVs-D) tem sido documentado em aves, porém existem poucos estudos disponíveis, principalmente com dados de detecção por RT-PCR e obtenção de sequências nucleotídicas. Este estudo objetivou investigar a ocorrência de RVs-D em aves criadas em granjas situadas na Mesorregião Metropolitana de Belém- Pará, no período compreendido entre 2008 a 2011. Foram colhidos 85 pools de amostras fecais provenientes de 37 granjas pertencentes a oito municípios da Mesorregião Metropolitana de Belém. O dsRNA viral foi extraído a partir das suspensões fecais e submetido à eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA) seguido da RT-PCR realizada a partir da construção de iniciadores específicos para os genes VP6 e VP7 do RVs-D. Foi selecionada uma amostra positiva de cada município para o sequenciamento de nucleotídeos dos genes VP6 e VP7, sendo cinco amostras clonadas. A EGPA demonstrou positividade em 14/85 (16,5%) amostras e a RT-PCR em 30/85 (35,3%) amostras. Dos oito municípios estudados, sete apresentaram amostras positivas para RVs-D. Dentre as 37 granjas pertencentes a esses municípios foi observado a presença dessa infecção viral em 17 (45,9%) das granjas estudadas. O intervalo de idade em que o RVs-D foi detectado com maior frequência foi o de aves entre 16 a 30 dias (23/37 – 62%) do total de amostras nesta faixa etária. As sequências nucleotídicas das sete amostras foram classificadas como pertencentes ao RVs-D com bootstrap de 100 corroborando com esse agrupamento. As sequências do gene VP6 apresentaram 90,8-91,3% de similaridade com o protótipo de RVs-D (05V0049) e 98,5-99,9% de similaridade quando comparadas entre si. Para o gene VP7 apresentaram 87-96,1% de similaridade com o protótipo deste grupo e foram 94,1-100% similares quando comparados entre si. A presente análise assume um caráter pioneiro no Brasil e no mundo, permitindo ampliar os conhecimentos acerca do RVs-D.

Análise de polimorfismo na região promotora do gene da Interleucina 18 (-137 G/C e -607 C/A) em pacientes portadores do vírus da hepatite C de Belém, Pará

Desde a sua descoberta, em 1989, o vírus da hepatite C (HCV) tem sido reconhecido como a maior causa de doença hepática crônica no mundo. Considerado um problema de saúde pública mundial que envolve entre 170 a 350 milhões de pessoas infectadas. Fatores genéticos do hospedeiro têm sido implicados na persistência da infecção pelo HCV. Estudos sugerem que dois polimorfismos de nucleotídeos únicos na posição -607 C/A (rs1946518) e -137 G/C (rs187238) na região promotora do gene da IL-18 têm sido encontrados e associados com a atividade de transcrição do promotor da IL-18 e, potencialmente, de IFN-γ, sendo associados ao atraso na depuração viral e na persistência da doença. Foi realizado um estudo do tipo transversal analítico no município de Belém-PA, em 152 amostras sanguíneas de pacientes infectados pelo HCV e 188 controles não infectados. As amostras foram submetidas à RT-PCR, para detecção do RNA viral e, posteriormente, à RFLP-PCR para avaliação do polimorfismo na região promotora do gene da IL-18, nas posições -137 G/C e -607 C/A. Os resultados não revelaram diferença significante para os polimorfismos da IL-18 entre os pacientes e grupo controle. Mas revelou diferença significante para os genótipos homozigotos G/G (39,1%), na posição -137 (OR = 3.00, IC [95%] = 1.24 – 7.22, p = 0.02), e A/A (21,7%), posição -607 (OR = 3.62, IC [95%] = 1.25 – 10.45, p = 0.03), entre as mulheres, em relação aos homens (22,6% e 7,6%). Os resultados demonstraram indícios que entre as mulheres, a presença do polimorfismo homozigoto A/A (-607) atue como fator protetor contra a infecção pelo HCV, já que o genótipo A/A (-607) tem sido relacionado em alguns estudos à doença hepática leve e à depuração viral.

Soroepidemiologia das hepatites virais B e C nas comunidades ribeirinhas residentes na região do lago da usina hidrelétrica de Tucuruí, estado do Pará

As hepatites virais são doenças causadas por diferentes agentes etiológicos que têm em comum o hepatotropismo. Epidemiologicamente, a relevância dessas doenças se deve à larga distribuição geográfica e o enorme número de indivíduos infectados, em praticamente todos os países do mundo. Para este estudo foram selecionados aleatoriamente 668 moradores das ilhas do lago da hidrelétrica de Tucuruí. Foi coletado amostras sanguíneas para pesquisa dos marcadores sorológicos HBsAg, Anti-HBc total, Anti-HBS e Anti-HCV, utilizando método imunoenzimático. Os pacientes com sorologia reativa para o HCV foram testados por biologia molecular (RT-PCR e RFLP) para a detecção dos genótipos virais. Dos 668 ribeirinhos estudados, 1,95% foram reagentes para o HBsAg, 28% para o Anti-HBc Total e 41,91% para o Anti-HBs. A presença do marcador anti-HBs isoladamente (resposta vacinal) foi observada em 25.75% dos voluntários. O marcador sorológico para o HCV foi observado em 2,24%, sendo que destes 70% apresentavam o genótipo 1. Os resultados indicam nível intermediário de endemicidade nessa região para HBV e HCV. Adicionalmente a cobertura vacinal contra o HBV é baixa.

Caracterização dos genes codificadores da hemaglutinina e PB2 do vírus Influenza A (H1N1) pandêmico isolado na mesorregião metropolitana de Belém

A recente pandemia de gripe de 2009/2010 causada pelo vírus A (H1N1) pandêmico mostrou um perfil de gravidade diferente da gripe sazonal, pois um percentual considerável de casos graves e fatais ocorreu em indivíduos adultos jovens, sem comorbidade. A virulência dos vírus Influenza A (H1N1) pandêmico resulta de interações protéicas complexas e depende essencialmente de alguns genes virais. O objetivo deste estudo foi caracterizar os genes codificadores da hemaglutinina (H1) e polimerase básica 2 (PB2) do vírus Influenza A (H1N1) pandêmico mediante a obtenção de cepas provenientes de pacientes com gripe procedente da mesorregião metropolitana de Belém-PA. O tamanho amostral foi constituído de 87 amostras aleatórias de ambos os sexos de 0 a 96 anos, com síndrome respiratória aguda grave (SRAG) sem nenhuma comorbidade relatada, no período de maio de 2009 a agosto de 2010. As amostras foram isoladas em cultura de célula MDCK e analisadas por técnicas de biologia molecular que compreenderam três etapas principais: a) extração do RNA viral (RNAv) a partir do sobrenadante celular; b) amplificação do RNAv pela técnica de Reação em Cadeia mediada pela Polimerase precedida de Transcrição Reversa (RT-PCR); c) sequenciamento completo dos genes codificadores da H1 e PB2. Das 87 cepas amplificadas pelo RT-PCR, em 82 tornou-se possível a obtenção e análise de sequências para o gene HA, enquanto que de 81 amostras virais obteve-se sequências para o gene PB2. A análise comparativa das sequências obtidas com a sequência da cepa vacinal (A/California/07/2009(H1N1)) revelou substituições aminoacídicas na HA (P83S; D97N; S203T; D222G; Q293H e I321V) e na PB2 (K340N; K526R e M631L), no entanto sem associação a hospitalização. Ao nível de substituição na HA, a D97N isolada ou associada com a S203T, foi detectada com mais frequência na primeira onda. Já ao nível da PB2 a substituição K526R foi mais encontrada em cepas que circularam na primeira onda, enquanto que, a M631L foi mais evidenciada na segunda. A substituição D222G na HA só foi encontrada em casos de óbitos. Por fim, observou-se uma tendência de alterações nos sítios antigênicos da HA. Sendo assim, a contínua vigilância genética e antigênica do vírus Influenza A (H1N1) pdm em circulação, bem como o compartilhamento de informações é de extrema importância para a melhor recomendação possível para os vírus que entram na composição vacinal evitando assim maior risco de epidemias severas no futuro.