Src family kinases are required for limb trajectory selection by spinal motor axons

Signal relay by guidance receptors at the axonal growth cone is a process essential for the assembly of a functional nervous system. We investigated the in vivo function of Src family kinases (SFKs) as growth cone guidance signaling intermediates in the context of spinal lateral motor column (LMC) motor axon projection toward the ventral or dorsal limb mesenchyme. Using in situ mRNA detection we determined that Src and Fyn are expressed in LMC motor neurons of chick and mouse embryos at the time of limb trajectory selection. Inhibition of SFK activity by C-terminal Src kinase (Csk) overexpression in chickLMCaxons using in ovo electroporation resulted inLMC axons selecting the inappropriate dorsoventral trajectory within the limb mesenchyme, with medial LMC axon projecting into the dorsal and ventral limb nerve with apparently random incidence. We also detected LMC axon trajectory choice errors in Src mutant mice demonstrating a nonredundant role for Src in motor axon guidance in agreement with gain and loss of Src function in chickLMCneurons which led to the redirection ofLMCaxons. Finally, Csk-mediated SFK inhibition attenuated the retargeting ofLMCaxons caused by EphA or EphB over-expression, implying the participation of SFKs in Eph-mediated LMC motor axon guidance. In summary, our findings demonstrate that SFKs are essential for motor axon guidance and suggest that they play an important role in relaying ephrin:Eph signals that mediate the selection of motor axon trajectory in the limb.

Identification de composé sensibilisant préférentiellement les cellules exprimant les protéines E6 et E7 du VPH à l'irradiation

Le cancer du col utérin (CCU) est dans plus de 99% des cas provoqué par une infection avec le virus du papillome humain (VPH), dont le potentiel oncogénique réside dans l'expression des proto-oncogènes viraux E6/E7. Le potentiel carcinogénique de ces protéines virales réside essentiellement dans leurs actions sur les produits des gènes suppresseurs de tumeur p53 et RB. Les produits de ces gènes, p53 et Rb, font parti des voies de signalisation de réponse aux dommages de l'ADN cellulaire (RDA) et leur perte entraine une perte de fonctionnalité qui mène à une instabilité génomique. À long terme et en présence de d'autres facteurs ceux-ci mèneront au développement d'un cancer. Les protéines E6 et E7 sont constitutivement exprimées dans les cellules du CCU ainsi que dans les cellules de tout autre cancer induit par le VPH et seulement dans ces dernières. La prise en charge des cas avancés de ces cancers se fait principalement par radiothérapie et chimiothérapie concomitante. La chimio-radiothérapie utilisée en traitement est efficace mais résulte en un taux élevé de morbidité et un nombre important de patientes récidiveront. Nous proposons que l'exploitation de l'expression spécifique d’E6 et d’E7 dans les cellules du CCU permette d’envisager une stratégie de létalité synthétique afin d'amplifier l'effet létal de l'irradiation sur les cellules CCU. Ceci permettrait potentiellement d'augmenter l'efficacité du traitement et de diminuer les récidives, ainsi que la morbidité liée au traitement. En s'appuyant sur cette hypothèse, notre objectif est d’identifier des composés dont l'action seule ou couplée à l'irradiation provoquerait préférentiellement la mort des cellules exprimant les protéines E6 et E7 du VPH. Les cellules testées comprennent des cellules isogéniques humaines issues de kératinocytes normaux que nous avons modifiées séquentiellement pour obtenir les modifications associées aux cellules CCU (hTERT, E6 et E7), ainsi que les lignées de cellules de CCU HeLa et CaSki .Nous avons procédé à la mise au point et à la validation du protocole de criblage et des méthodes d’évaluation de la sensibilisation, qui se définit comme une perte de viabilité, un arrêt ou ralentissement de la croissance, par détection d’ATP ainsi que par coloration d’ADN génomique au DRAQ5. Suite à un criblage ciblé impliquant des inhibiteurs connus de la voie de réparation des dommages à l’ADN, nous avons identifié l’inhibiteur de mdm2, Nutlin-3, comme étant un composé sensibilisant et radio-sensibilisant préférentiellement les cellules exprimant E6 et E7 du VPH. La Nutlin-3 a été testée sur des cellules HEKn-hTERT-E6-E7, des cellules CaSki et HeLa. L’effet de sensibilisation et de radio-sensibilisation a été confirmé dans ces trois lignées. Tel que suggéré par son action sur mdmd2, la Nutlin-3 permet la stabilisation de p53 dans les cellules HEKn-hTERT-E6-E7 et CaSki et sa réactivation dans les lignées cellulaires HeLa et CaSki. Malgré cette stabilisation de p53, de façon surprenante, l’effet de la Nutlin-3 sur la sensibilisation et la radio-sensibilisation des cellules HeLa et CaSki semble indépendant de p53, tel qu’observé en utilisant des cellules HeLa-GSE et CaSki-GSE dont le p53 est déficient. In vivo la Nutlin-3a montre dans un essai préliminaire l’inhibition de la croissance tumorale des xénogreffes HeLa chez des souris RAG2γc. Ce résultat reste à confirmer avec un essai impliquant un nombre d’échantillons plus grand. À plus long terme, nous comptons étudier l’implication de mdm2 dans l’effet de sensibilisant de la Nutlin-3 dans les cellules CCUs, ainsi que les autres cibles pouvant être impliquées dans la création de cet effet sensibilisant observé.

Understanding the role of CAP proteins in the polarization process of C. elegans

La division cellulaire asymétrique est un processus crucial dans le développement des organismes multicellulaires puisqu’elle permet la génération de la diversité cellulaire. Les cellules qui se divisent de façon asymétrique doivent tout d’abord se polariser et correctement orienter leur fuseau mitotique pour ségréger des déterminants cellulaires en deux entités distinctes. L’embryon du nématode C. elegans est un modèle robuste et largement utilisé pour étudier la division cellulaire asymétrique. Dans cet embryon, le point d'entrée du spermatozoïde détermine l'axe de polarité antéro-postérieur. Suite à la fécondation, le cortex embryonnaire est uniformément contractile et un complexe conservé formé des protéines PAR-3, PAR-6 et PKC-3 (nommé complexe PAR-3 ci-dessous) est localisé sur l'ensemble du cortex. La complétion de la méiose maternelle induit une relaxation corticale au postétieur et un flux cortical vers l’antérieur de l’embryon. Ces contractions corticales asymétriques mènent à la formation d'un domaine antérieur contenant le complexe PAR-3, tandis que le cortex postérieur, dont le complexe PAR-3 s’est délocalisé, est enrichi avec les protéines PAR-2 et PAR-1. Par conséquent, les domaines formés par les protéines PAR définissent un pôle antérieur et un pôle postérieur dans l'embryon suite au remodelage du cytosquelette. Les protéines PAR-4 et PAR-5 restent localisées de façon uniforme dans l'embryon. Curieusement, les protéines PAR exercent une régulation par rétroaction sur la contractilité corticale. Il a été montré qu’une des protéines PAR récemment identifiée, PAR-5, est orthologue à la protéine adaptatrice 14-3-3 et joue un rôle important dans la contractilité corticale. En dépit de son rôle central dans la contractilité corticale et le processus de polarisation cellulaire, le mécanisme par lequel PAR-5 régule la contractilité corticale n’est pas bien compris. Le but de ce projet est de mieux comprendre comment PAR-5 et ses interacteurs contrôlent la régulation des contractions corticales et, de ce fait, la polarité cellulaire. Dans un essai de capture de la protéine GST (GST pull-down), nous avons identifié plusieurs nouveaux interacteurs de PAR-5. Parmi ceux-ci, nous avons trouvé CAP-2 (protéine de coiffage de l'actine), qui a été identifiée dans des éxpériences de capture de 14-3-3 dans trois systèmes modèles différents. CAP-2 est un hétérodimère des protéines CAP, qui sont impliquées dans la régulation de l'actine. Nous avons trouvé que la déplétion des protéines CAP par interférence à l’ARN dans des vers de type sauvage mène à une augmentation létalité embryonnaire, ce qui suggère que ces protéines jouent un rôle important dans le développement embryonnaire. L'imagerie en temps réel d'embryons déplétés pour les protéines CAP montre qu’ils ont une diminution des contractions corticales avec un sillon de pseudoclivage mois stable, suggérant un défaut dans la régulation du cytosquelette d'actine-myosine. Ceci a également été confirmé par la diminution de la vitesse et du nombre de foci de NMY-2::GFP. En outre, ces embryons montrent une légère diminution de la taille du croissant cortical de PAR-2 lors de la phase d’établissement de la polarité. Les embryons déplétés en CAP-2 montrent également un retard dans la progression du cycle cellulaire, mais le lien entre ce phénotype et la régulation des contractions corticales reste à être précisé. La caractérisation des protéines CAP, des régulateurs du remodelage du cytosquelette, permettra d'améliorer notre compréhension des mécanismes qui sous-tendent l'établissement et le maintien de la polarité cellulaire, et donc la division cellulaire asymétrique.

Étude des interactions protéiques impliquant NPM-MLF1 dans la leucémie myéloïde aiguë.

Différentes translocations génomiques sont fréquemment associées à l'apparition de leucémies myéloïdes aiguës (LMA). Ces translocations génomiques résultent de l’assemblage de deux gènes conduisant à la production d'une protéine de fusion. C'est le cas de la translocation t (3; 5) (q25.1; q34) impliquant le suppresseur tumoral NPM et l'oncogène MLF1 donnant naissance à la protéine de fusion NPM-MLF1. Généralement, les gènes impliqués dans ces translocations contrôlent la croissance cellulaire, la différenciation ou la survie cellulaire. Cependant, pour NPM-MLF1 les causes du gain ou de la perte de fonction associée à la translocation demeurent inconnues car nous ne savons pas comment cette translocation peut favoriser ou participer à l'avènement de la LMA. Le but de ce travail est d’analyser le rôle de NPM-MLF1 dans le cancer et d’examiner comment son activité contribue à la leucémie en faisant des études d’interactions protéine/protéine. En effet, l’étude de la fonction d’une protéine implique souvent de connaître ses partenaires d’interactions. Pour ce faire, la technique de double hybride dans la souche de levure AH109 a été utilisée. Tout d’abord, les ADN complémentaires (ADNc) de MLF1, NPM1 et de NPM-MLF1, MLF1-Like (une partie de MLF1 de l’acide aminé 94 à 157) normaux et mutés du domaine MTG8-Like constitué des acides aminés (a.a.) 151 à 164 de MLF1 (excepté NPM) ont été clonés dans un vecteur d'expression de levure pGBKT7. Les ADNc de GFI-1, mSin3A, PLZF, HDAC1 et HDAC3 ont été clonés dans le plasmide pGADT7 de façon à créer des protéines de fusion synthétiques avec le domaine de liaison à l'ADN et de trans-activation de la protéine GAL4. Le plasmide pGBKT7 possède un gène TRP1 et pGADT7 un gène LEU2 qui permettent la sélection des clones insérés dans la levure. Aussi, le pGBKT7 a un épitope c-myc et pGADT7 un épitope HA qui permet de voir l’expression des protéines par buvardage de type Western. Après la transformation des levures les interactions protéine/protéine ont été observées en vérifiant l’expression des gènes rapporteurs HIS3, LacZ, MEL1, ADE2 de la levure en utilisant des milieux de sélection YPD/-Leu/-Trp, YPD/-Leu/-Trp/-His, YPD/-Leu/-Trp/-His/-Ade, YPD/-Leu/-Trp/+ X-Gal, YPD/-Leu/-Trp/ + X-α-Gal. Ensuite, les interactions trouvées par double-hybride ont été vérifiées dans les cellules érythroleucémiques K562 par immuno-précipitation (IP) de protéines suivies de buvardages Westerns avec les anticorps appropriés. NPM-MLF1, MLF1, MTG8, MLF1-Like surexprimés dans les cellules K562 ont été clonés dans le plasmide pOZ-FH-N. pOZ-FH-N possède un récepteur IL-2 qui permet de sélectionner les cellules qui l’expriment ainsi qu’un tag Flag-HA qui permet de voir l’expression des protéines par buvardage-Western. Les résultats du double-hybride suggèrent une interaction faible de NPM-MLF1 avec HDAC1, HDAC3 et mSin3A ainsi qu’une interaction qui semble plus évidente entre NPM-MLF1 et PLZF, GFI-1. NPM interagit avec GFI-1 et mSin3A. Aussi, MLF1 et MLF1-Like interagissent avec HDAC1, HDAC3, GFI-1, PLZF mais pas avec mSin3A. Les IP suggèrent que NPM-MLF1 interagit avec HDAC1, HDAC3, mSin3A et PLZF. MLF1 et MLF1-Like interagissent avec HDAC1, HDAC3 et mSin3A. L’interaction de NPM-MLF1 avec GFI-1, MLF1 et MLF1-Like avec PLZF et GFI-1 n’a pas encore été vérifiée par IP. Ainsi, nos observations permettent de suggérer que NPM-MF1, MLF1 et NPM pourraient jouer un rôle dans la transcription et la régulation de l’expression de certains gènes importants dans l’hématopoïèse et une variété de processus cellulaires parce qu’ils interagissent avec différents corépresseurs. En déterminant les partenaires protéiques de MLF1, NPM et NPM-MLF1, leurs fonctions et comment NPM-MLF1 influence et modifie le fonctionnement cellulaire normal; il sera possible de renverser le processus de LMA favorisé par la t (3; 5) NPM-MLF1 par la technologie d’interférence à l’ARN.

Rôle de l’extrémité C-terminale dans l’expression du canal calcique Cav1.2 à la membrane plasmique

Le canal calcique de type L, Cav1.2, joue un rôle clé dans le couplage excitation-contraction des myocytes ventriculaires. Il a été montré que la sous-unité Cavα1 était sujette à l’épissage alternatif et que ce phénomène pouvait mener à une protéine tronquée en C-terminal au niveau de l’exon 45 (Liao, Yong et al. 2005). D’autres groupes ont étudié différentes délétions au niveau de l’extrémité C-terminale (De Jongh, Warner et al. 1991; Gao, Cuadra et al. 2001). Les courants mesurés dans la configuration cellule entière, était significativement plus grands que le canal « pleine longueur ». Nous avons décidé de tester certaines de ces délétions (ΔC2030, ΔC1935, ΔC1856, ΔC1733, ΔC1700) en présence ou en absence de la sous-unité auxiliaire Cavβ3, susceptible d’interagir avec l’extrémité C-terminale de la sous-unité Cavα1 par l’intermédiaire de son domaine SH3 (Lao, Kobrinsky et al. 2008). Les résultats obtenus dans les ovocytes de Xénope ont mis en évidence que les sous-unités Cavα1.2 tronquées montraient des courants globaux plus élevés que le canal « pleine longueur » en présence de la sous-unité auxiliaire Cavβ3 et que les sous-unités Cavα1.2 tronquées donnaient des courants en absence de la sous-unité Cavβ3 contrairement à la sous-unité Cavα1.2 « pleine longueur ». Afin de vérifier si l’augmentation des courants macroscopiques était le résultat d’une augmentation du nombre de sous-unités Cavα1.2 à la membrane, nous avons choisi de quantifier la fluorescence spécifiquement due à cette sous-unité en utilisant la méthode de cytométrie de flux (FACS : « Fluorescence Activated Cell Sorting »). L’épitope HA a été inséré dans une région extracellulaire de la sous-unité Cavα1 du canal calcique Cav1.2 et un anticorps anti-HA couplé au FITC (« Fluorescein IsoThioCyanate ») a été utilisé pour observer la fluorescence. Nos résultats confirment que la sous-unité Cavα1-HA du canal calcique Cav1.2, s’exprime à la membrane plasmique en présence de la sous-unité auxiliaire Cavβ3, et qu’en absence de celle-ci, ne s’exprime que peu ou pas à la membrane. Les mêmes résultats ont été obtenus pour les trois délétions testées dans les mêmes conditions soit Cavα1.2-HA ΔC1935, Cavα1.2-HA ΔC1856 et Cavα1.2-HA ΔC1733. Ensemble, ces résultats suggèrent que l’augmentation des courants macroscopiques observés après une délétion partielle du C-terminal n’est pas causée par une augmentation du nombre de protéines Cavα1.2 à la membrane.

HIV-1 Vpr induces the K48-linked polyubiquitination and proteasomal degradation of target cellular proteins to activate ATR and promote G2 arrest

HIV-1 viral protein R (Vpr) induces a cell cycle arrest at the G2/M phase by a mechanism involving the activation of the DNA damage sensor ATR. We and others recently showed that Vpr performs this function by subverting the activity of the DDB1-CUL4A (VPRBP) E3 ubiquitin ligase. Vpr could thus act as a connector between the E3 ligase and an unknown cellular factor whose ubiquitination would induce G2 arrest. While attractive, this model is solely based on the indirect observation that some mutants of Vpr retain their interaction with the E3 ligase but fail to induce G2 arrest. Using a tandem affinity purification approach, we observed that Vpr interacts with ubiquitinated cellular proteins and that this association requires the recruitment of an active E3 ligase given that depletion of VPRBP by RNA interference or overexpression of a dominant-negative mutant of CUL4A decreased this association. Importantly, G2-arrest-defective mutants of Vpr in the C-terminal putative substrate-interacting domain displayed decreased association with ubiquitinated proteins. We also found that inhibition of proteasomal activity increased this association and that the ubiquitin chains were at least in part constituted of classical K48 linkages. Interestingly, inhibition of K48 polyubiquitination specifically impaired Vpr-induced phosphorylation of H2AX, an early target of ATR, but did not affect UV-induced H2AX phosphorylation. Overall, our results provide direct evidence that association of Vpr with the DDB1-CUL4A (VPRBP) E3 ubiquitin ligase induces the K48-linked polyubiquitination of yet-unknown cellular proteins resulting in their proteasomal degradation and ultimately leading to activation of ATR and G2 arrest.

Hydrogen peroxide enhances the expression and function of Giα proteins in aortic vascular smooth muscle cells from Sprague-Dawley rats : role of growth factor receptors transactivation

Nous avons récemment démontré que les espèces réactives oxygénées induisent une augmentation de l’expression des protéines Giα dans les cellules du muscle lisse vasculaire (CMLV) provenant d’aortes de rats spontanément hypertendus (SHR, de l’anglais spontaneously hypertensive rats). La présente étude a pour but d’étudier les effets du peroxyde d’hydrogène (H2O2), un oxydant qui induit le stress oxydatif, sur l’expression de Giα et sur l’activité de l’adénylate cyclase, et d’explorer les voies de signalisation sous-jacentes responsables de cette réponse. Nos résultats montrent que H2O2 induit une augmentation de l’expression des protéines Giα-2 et Giα-3 de manière dose- et temps-dépendante avec une augmentation maximale de 40-50% à 100 µM après 1 heure, sans affecter l’expression de Gsα. L’expression des protéines Giα a été maintenue au niveau normal en presence de AG 1478, AG1295, PD98059 et la wortmannine, des inhibiteurs d’EGF-R (de l’anglais epidermal growth factor receptor), PDGFR-β (de l’anglais platelet-derived growth factor receptor β), de la voie de signalisation ras-ERK1/2 (de l’anglais extracellular regulated kinase1/2), et de la voie de la PI3Kinase-AKT (de l’anglais phosphatidyl inositol-3 kinase), respectivement. En outre, le traitement des CMLV avec H2O2 a induit une augmentation du degré de phosphorylation d’EGF-R, PDGF-R, ERK1/2 et AKT; et cette expression a été maintenue au niveau témoin par leurs inhibiteurs respectifs. Les inhibiteurs d’EGF-R et PDGF-R ont aussi induit une diminution du degré de phosphorylation de ERK1/2, et AKT/PKB. En outre, la transfection des cellules avec le siRNA (de l’anglais, small interfering ribonucleic acid) de EGF-R et PDGFR-β a atténué la surexpression des protéines Giα-2 et Giα-3 induite par le traitement au H2O2. La surexpression des protéines Giα induite par H2O2 a été corrélée avec une augmentation de la fonction de la protéine Giα. L’inhibition de l’activité de l’adénylate cyclase par de faibles concentrations de GTPγS après stimulation par la forskoline a augmenté de 20% dans les cellules traitées au H2O2. En outre, le traitement des CMLV au H2O2 a aussi accru l’inhibition de l’activité de l’adénylate cyclase par les hormones inhibitrices telles que l’angiotensine II, oxotrémorine et C-ANP4-23. D’autre part, la stimulation de l’adénylate cyclase induite par GTPγS, glucagon, isoprotérénol, forskoline, et le fluorure de sodium (NaF) a été atténuée de façon significative dans les cellules traitées au H2O2. Ces résultats suggèrent que H2O2 induit la surexpression des protéines Giα-2 and Giα-3 via la transactivation des récepteurs des facteurs de croissance EGF-R, PDGFR-β et l’activation des voies de signalisation ras-ERK1/2 et PI3K-AKT Mot-cles: Protéines Giα, peroxyde d’hydrogène, stress oxydant, récepteurs des facteurs de croissance, MAP kinases, adénylate cyclase, hypertension

Étude du mécanisme de régulation de la sénescence et de p53 par la protéine SOCS1

Les mécanismes cellulaires anti-prolifératifs, lesquels comprennent l’apoptose, aussi appelée la mort cellulaire programmée, l’arrêt transitoire du cycle cellulaire et la sénescence, permettent à la cellule de prévenir, en réponse à différents stress, l’accumulation de mutations pouvant conduire à une prolifération incontrôlée et, éventuellement, au développement d’une tumeur. La régulation de ces différents mécanismes requiert l’activation de protéines appelées des suppresseurs de tumeur, dont le principal est p53. p53 est un facteur de transcription dont la stabilisation et l’activation conduit à une hausse de l’expression de gènes directement impliqués dans l’arrêt de la prolifération. Au cours des dernières années, l’ensemble des travaux sur p53 ont permis de mettre en évidence la complexité de sa fonction, de même que la multitude de voies de signalisation et de protéines avec lesquelles il coopère pour maintenir l’intégrité du génome. De ce fait, l’étude des mécanismes d’activation de p53 est de mise pour la compréhension de sa régulation et, éventuellement, pour la prévention et l’élaboration de nouvelles stratégies de traitement contre le cancer. L’objet de cette thèse est la mise en évidence d’un mécanisme d’activation de p53 et de la sénescence par la protéine SOCS1, un suppresseur de la signalisation par les cytokines. Ce mécanisme implique une interaction directe entre les deux protéines, plus précisément entre le domaine SH2 de SOCS1 et le domaine de transactivation de p53. SOCS1 interagit également, au niveau de son SOCS Box, avec les kinases ATM et ATR de la voie du dommage à l’ADN de façon à faciliter la phosphorylation de p53 en sérine 15. Ainsi, en interagissant à la fois avec p53 et ATM/ATR, SOCS1 contribue à la stabilisation et à l’activation de p53. En accord avec ce modèle, l’inhibition de SOCS1 dans des fibroblastes humains normaux tend à diminuer le nombre de cellules sénescentes suite à l’expression de l’oncogène ca-STAT5A et à réduire l’accumulation nucléaire de p53 dans ces cellules. De la même façon, les lymphocytes T provenant de souris Socs1-/-Ifnγ-/- sont moins susceptibles d’entrer en apoptose que les lymphocytes provenant de souris Socs1+/+Ifnγ+/+, suite à une exposition à des radiations. Dans les deux contextes, on observe une baisse de l’expression des gènes cibles de p53, ce qui démontre que SOCS1 est impliquée dans l’activation de p53 in vivo. Cette thèse a également pour but de mettre en évidence l’implication de SOCS1 dans l’activation d’autres facteurs de transcription et, par le fait même, de démontrer qu’elle peut agir comme un régulateur plus général de la transcription. Une étude approfondie de l’interaction entre SOCS1 et p53 a permis de démontrer que le domaine de transactivation II de p53 (acides aminés 36-67) est suffisant pour l’interaction. Plus précisément, il semble que le tryptophane 53 (W53) et la phénylalanine 54 (F54) sont les principaux résidus impliqués. Une analyse structurale de ce domaine de p53 a conduit à l’identification d’un motif conservé dans plusieurs autres facteurs de transcription pourvus d’un domaine de transactivation acide, dont p63, p73 et E2F1. En accord avec ces résultats, SOCS1 est en mesure d’interagir avec chacune des deux protéines. Ainsi, la capacité de SOCS1 d’interagir et de réguler l’activité de p53 peut s’étendre à d’autres facteurs de transcription. En terminant, le mécanisme présenté dans cette thèse contribue à la compréhension de la régulation de p53, le principal suppresseur de tumeur de la cellule. De plus, il met en évidence une nouvelle fonction de SOCS1, laquelle était jusqu’alors essentiellement connue pour inhiber la voie de signalisation JAK/STAT. Ce nouveau rôle pour SOCS1 permet d’expliquer de quelle manière une activation aberrante de la signalisation par les cytokines peut déclencher la sénescence ou l’apoptose. Enfin, le fait que SOCS1 puisse réguler différents facteurs de transcription permet de la qualifier de régulateur général des facteurs de transcription composés d’un domaine de transactivation acide.

Découverte de nouvelles interactions entre le virus de l'Hépatite C et l'hôte par une approche combinée de Spectrométrie de Masse et de Génomique Fonctionnelle

La réplication et l’assemblage du virus de l’hépatite C (VHC) sont régulés finement dans le temps et l’espace par les interactions protéiques entre le virus avec l’hôte. La compréhension de la biologie du virus ainsi que sa pathogénicité passe par les connaissances relatives aux interactions virus/hôte. Afin d’identifier ces interactions, nous avons exploité une approche d’immunoprécipitation (IP) couplée à une détection par spectrométrie de masse (MS), pour ensuite évaluer le rôle des protéines identifiées dans le cycle viral par une technique de silençage génique. Les protéines virales Core, NS2, NS3/4A, NS4B, NS5A et NS5B ont été exprimées individuellement dans les cellules humaines 293T et immunoprécipitées afin d’isoler des complexes protéiques qui ont été soumis à l’analyse MS. Ainsi, 98 protéines de l’hôte ont été identifiées avec un enrichissement significatif et illustrant une spécificité d’interaction. L’enrichissement de protéines connues dans la littérature a démontré la force de l’approche, ainsi que la validation de 6 nouvelles interactions virus/hôte. Enfin, le rôle de ces interactants sur la réplication virale a été évalué dans un criblage génomique par ARN interférant (ARNi). Deux systèmes rapporteurs de la réplication virale ont été utilisés : le système de réplicon sous-génomique (Huh7-Con1-Fluc) et le système infectieux (J6/JFH-1/p7Rluc2a), ainsi qu’un essai de toxicité cellulaire (Alamar Blue). Parmi les protéines de l’hôte interagissant avec le VHC, 28 protéines ont démontré un effet significatif sans effet de toxicité cellulaire, suggérant fortement un rôle dans la réplication du VHC. Globalement, l’étude a mené à l’identification de nouvelles interactions virus/hôte et l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles.

Un criblage ciblant de nouveaux facteurs impliqués dans l’assemblage mitotique des chromosomes dans le nématode C. elegans

La division cellulaire est un processus fondamental des êtres vivants. À chaque division cellulaire, le matériel génétique d'une cellule mère est dupliqué et ségrégé pour produire deux cellules filles identiques; un processus nommé la mitose. Tout d'abord, la cellule doit condenser le matériel génétique pour être en mesure de séparer mécaniquement et également le matériel génétique. Une erreur dans le niveau de compaction ou dans la dynamique de la mitose occasionne une transmission inégale du matériel génétique. Il est suggéré dans la littérature que ces phénomènes pourraient causé la transformation des cellules cancéreuses. Par contre, le mécanisme moléculaire générant la coordination des changements de haut niveau de la condensation des chromosomes est encore incompris. Dans les dernières décennies, plusieurs approches expérimentales ont identifié quelques protéines conservées dans ce processus. Pour déterminer le rôle de ces facteurs dans la compaction des chromosomes, j'ai effectué un criblage par ARNi couplé à de l'imagerie à haute-résolution en temps réel chez l'embryon de C. elegans. Grâce à cette technique, j'ai découvert sept nouvelles protéines requises pour l'assemblage des chromosomes mitotiques, incluant la Ribonucléotide réductase (RNR) et Topoisomérase II (topo-II). Dans cette thèse, je décrirai le rôle structural de topo-II dans l'assemblage des chromosomes mitotiques et ces mécanismes moléculaires. Lors de la condensation des chromosomes, topo-II agit indépendamment comme un facteur d'assemblage local menant par la suite à la formation d'un axe de condensation tout au long du chromosome. Cette localisation est à l'opposé de la position des autres facteurs connus qui sont impliqués dans la condensation des chromosomes. Ceci représente un nouveau mécanisme pour l'assemblage des chromosomes chez C. elegans. De plus, j'ai découvert un rôle non-enzymatique à la protéine RNR lors de l'assemblage des chromosomes. Lors de ce processus, RNR est impliqué dans la stabilité des nucléosomes et alors, permet la compaction de haut niveau de la chromatine. Dans cette thèse, je rapporte également des résultats préliminaires concernant d'autres nouveaux facteurs découverts lors du criblage ARNi. Le plus important est que mon analyse révèle que la déplétion des nouvelles protéines montre des phénotypes distincts, indiquant la fonction de celles-ci lors de l'assemblage des chromosomes. Somme toute, je conclus que les chromosomes en métaphase sont assemblés par trois protéines ayant des activités différentes d'échafaudage: topoisomérase II, les complexes condensines et les protéines centromériques. En conclusion, ces études prouvent le mécanisme moléculaire de certaines protéines qui contribuent à la formation des chromosomes mitotiques.

Recognition of hepatitis C virus RNA by toll like receptors 7 and 8 : implications for the initiation of innate immune response

Le virus de l’hépatite C (VHC) est un virus à ARN simple brin positif (ssARN) qui se replique dans le foie. Deux cents millions de personnes sont infectées par le virus dans le monde et environ 80% d’entre elles progresseront vers un stade chronique de l’infection. Les thérapies anti-virales actuelles comme l’interféron (IFN) ou la ribavirin sont de plus en plus utilisées mais ne sont efficaces que dans la moitié des individus traités et sont souvent accompagnées d’une toxicité ou d’effets secondaires indésirables. Le système immunitaire inné est essentiel au contrôle des infections virales. Les réponses immunitaires innées sont activées suite à la reconnaissance par les Pathogen Recognition Receptors (PRRs), de motifs macromoléculaires dérivés du virus appelés Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs). Bien que l'activation du système immunitaire par l'ARN ou les protéines du VHC ait été largement étudiée, très peu de choses sont actuellement connues concernant la détection du virus par le système immunitaire inné. Et même si l’on peut très rapidement déceler des réponses immunes in vivo après infection par le VHC, l’augmentation progressive et continue de la charge virale met en évidence une incapacité du système immunitaire à contrôler l’infection virale. Une meilleure compréhension des mécanismes d’activation du système immunitaire par le VHC semble, par conséquent, essentielle au développement de stratégies antivirales plus efficaces. Dans le présent travail nous montrons, dans un modèle de cellule primaire, que le génome ARN du VHC contient des séquences riches en GU capables de stimuler spécifiquement les récepteurs de type Toll (TLR) 7 et 8. Cette stimulation a pour conséquence la maturation des cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDCs), le production d’interféron de type I (IFN) ainsi que l’induction de chémokines et cytokines inflammatoires par les différentes types de cellules présentatrices d’antigènes (APCs). Les cytokines produites après stimulation de monocytes ou de pDCs par ces séquences ssARN virales, inhibent la production du virus de façon dépendante de l’IFN. En revanche, les cytokines produites après stimulation de cellules dendritiques myéloïdes (mDCs) ou de macrophages par ces mêmes séquences n’ont pas d’effet inhibiteur sur la production virale car les séquences ssARN virales n’induisent pas la production d’IFN par ces cellules. Les cytokines produites après stimulation des TLR 7/8 ont également pour effet de diminuer, de façon indépendante de l’IFN, l’expression du récepteur au VHC (CD81) sur la lignée cellulaire Huh7.5, ce qui pourrait avoir pour conséquence de restreindre l’infection par le VHC. Quoiqu’il en soit, même si les récepteurs au VHC comme le CD81 sont largement exprimés à la surface de différentes sous populations lymphocytaires, les DCs et les monocytes ne répondent pas aux VHC, Nos résultats indiquent que seuls les macrophages sont capables de reconnaître le VHC et de produire des cytokines inflammatoires en réponse à ce dernier. La reconnaissance du VHC par les macrophages est liée à l’expression membranaire de DC-SIGN et l’engagement des TLR 7/8 qui en résulte. Comme d’autres agonistes du TLR 7/8, le VHC stimule la production de cytokines inflammatoires (TNF-α, IL-8, IL-6 et IL-1b) mais n’induit pas la production d’interféron-beta par les macrophages. De manière attendue, la production de cytokines par des macrophages stimulés par les ligands du TLR 7/8 ou les séquences ssARN virales n’inhibent pas la réplication virale. Nos résultats mettent en évidence la capacité des séquences ssARN dérivées du VHC à stimuler les TLR 7/8 dans différentes populations de DC et à initier une réponse immunitaire innée qui aboutit à la suppression de la réplication virale de façon dépendante de l’IFN. Quoiqu’il en soit, le VHC est capable d’échapper à sa reconnaissance par les monocytes et les DCs qui ont le potentiel pour produire de l’IFN et inhiber la réplication virale après engagement des TLR 7/8. Les macrophages possèdent quant à eux la capacité de reconnaître le VHC grâce en partie à l’expression de DC-SIGN à leur surface, mais n’inhibent pas la réplication du virus car ils ne produisent pas d’IFN. L’échappement du VHC aux défenses antivirales pourrait ainsi expliquer l’échec du système immunitaire inné à contrôler l’infection par le VHC. De plus, la production de cytokines inflammatoires observée après stimulation in vitro des macrophages par le VHC suggère leur potentielle contribution dans l’inflammation que l’on retrouve chez les individus infectés par le VHC.

Rôle du métabolisme énergétique dans un contexte de vieillissement chez C. elegans

L’incidence constante des maladies liées à l’âge reflète un réel enjeu dans nos sociétés actuelles, principalement lorsqu’il est question des cas de cancers, d’accidents cérébraux et de maladies neurodégénératives. Ces désordres sont liés à l’augmentation de l’espérance de vie et à un vieillissement de la population. Les coûts, estimés en milliards de dollars, représentent des sommes de plus en plus importantes. Bien que les efforts déployés soient importants, aucun traitement n’a encore été trouvé. Les maladies neurodégénératives, telles que la maladie d’Alzheimer, de Parkinson, d’Huntington ou la sclérose latérale amyotrophique (SLA), caractérisées par la dégénérescence d’un type neuronal spécifique à chaque pathologie, représentent un défi important. Les mécanismes de déclenchement de la pathologie sont encore nébuleux, de plus il est maintenant clair que certains de ces désordres impliquent de nombreux gènes impliqués dans diverses voies de signalisation induisant le dysfonctionnement de processus biologiques importants, tel que le métabolisme. Dans nos sociétés occidentales, une problématique, directement lié à notre style de vie s’ajoute. L’augmentation des quantités de sucre et de gras dans nos diètes a amené à un accroissement des cas de diabètes de type II, d’obésité et de maladies coronariennes. Néanmoins, le métabolisme du glucose, principale source énergétique du cerveau, est primordial à la survie de n’importe quel organisme. Lors de ces travaux, deux études effectuées à l’aide de l’organisme Caenorhabditis elegans ont porté sur un rôle protecteur du glucose dans un contexte de vieillissement pathologique et dans des conditions de stress cellulaire. Le vieillissement semble accéléré dans un environnement enrichi en glucose. Cependant, les sujets traités ont démontré une résistance importante à différents stress et aussi à la présence de protéines toxiques impliquées dans la SLA et la maladie de Huntington. Dans un deuxième temps, nous avons démontré que ces effets peuvent aussi être transmis à la génération suivante. Un environnement enrichi en glucose a pour bénéfice de permettre une meilleure résistance de la progéniture, sans pour autant transmettre les effets néfastes dû au vieillissement accéléré.

The role of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus structural and non-structural proteins in virus pathogenesis.

Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) is an economically devastating viral disease affecting the swine industry worldwide. The etiological agent, PRRS virus (PRRSV), possesses a RNA viral genome with nine open reading frames (ORFs). The ORF1a and ORF1b replicase-associated genes encode the polyproteins pp1a and pp1ab, respectively. The pp1a is processed in nine non-structural proteins (nsps): nsp1a, nsp1b, and nsp2 to nsp8. Proteolytic cleavage of pp1ab generates products nsp9 to nsp12. The proteolytic pp1a cleavage products process and cleave pp1a and pp1ab into nsp products. The nsp9 to nsp12 are involved in virus genome transcription and replication. The 30 end of the viral genome encodes four minor and three major structural proteins. The GP2a, GP3 and GP4 (encoded by ORF2a, 3 and 4), are glycosylated membrane associated minor structural proteins. The fourth minor structural protein, the E protein (encoded by ORF2b), is an unglycosylated membrane associated protein. The viral envelope contains two major structural proteins: a glycosylated major envelope protein GP5 (encoded by ORF5) and an unglycosylated membrane M protein (encoded by ORF6). The third major structural protein is the nucleocapsid N protein (encoded by ORF7). All PRRSV non-structural and structural proteins are essential for virus replication, and PRRSV infectivity is relatively intolerant to subtle changes within the structural proteins. PRRSV virulence is multigenic and resides in both the non-structural and structural viral proteins. This review discusses the molecular characteristics, biological and immunological functions of the PRRSV structural and nsps and their involvement in the virus pathogenesis.

Régulation de la division asymétrique chez C. elegans

La division asymétrique est essentielle pour générer la diversité au cours du développement et permet aussi de réguler la balance entre renouvellement et différenciation des cellules souches chez l’adulte. Dans ces deux cas de figure, elle dépend respectivement d’une polarité intrinsèque ou d’une polarité extrinsèque. C. elegans est un excellent modèle pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de la division asymétrique in vivo. Chez l’embryon, le maintien d’un axe de polarité antéro-postérieur dépend des protéines PAR conservées et localisées de façon asymétrique en deux groupes mutuellement exclusifs; le groupe antérieur avec PAR-3, PAR-6, PKC-3 et le groupe postérieur avec PAR-2 et PAR-1. L’absence d’une protéine PAR entraine une perte de polarité et une létalité embryonnaire. Lors d’un crible par ARN interférence mené par Jean-Claude Labbé pour identifier les suppresseurs de la létalité associée à la perte de PAR-2, deux cyclines de type B, CYB-2.1 et CYB-2.2 ont été trouvées. J’ai déterminé que CYB-2.1 et CYB-2.2 interviennent dans la polarité sans perturber le cycle cellulaire et agissent vraisemblablement avec leur kinase associée, CDK-1, pour stabiliser les niveaux protéiques de PAR-6. Ces travaux permettent de mieux définir les liens étroits entre polarité et cycle cellulaire. La lignée germinale de C. elegans est un excellent modèle pour étudier les divisions des cellules souches germinales in vivo. Par contre, l’absence d’orientation préférentielle de ces divisions laisse envisager que la complexité morphologique de la niche pourrait engendrer une diversité d’axe possible. J’ai étudié la régulation morphologique de cette niche, une unique cellule somatique appelée distal tip cell (DTC), qui arborise de longues extensions au stade adulte. Mes résultats préliminaires favorisent un modèle dans lequel les cellules souches et progéniteurs germinaux (CSPG) supportent la formation de ces extensions. Enfin, j’ai obtenu des conditions favorables à l’étude de la division asymétrique extrinsèque dans ce modèle, en simplifiant l’architecture de la niche dans des conditions qui préservent les divisions cellulaires des cellules souches. Mes travaux ont permis de mieux comprendre les liens unissant les différents processus biologiques impliqués dans la division asymétrique, d’une part par l’étude du rôle qu’y jouent des régulateurs clés du cycle cellulaire au cours du développement et d’autre part par la caractérisation d’une communication bidirectionnelle entre la niche et les cellules souches chez l’adulte.

Biogenesis of the C. elegans germline syncytium: from nucleation to maturation

La vie commence par la fusion des gamètes pour générer un zygote, dans lequel les constituants à la fois de l'ovocyte et des spermatozoïdes sont partagés au sein d'un syncytium. Le syncytium consiste en des cellules ou tissus dans lesquels des cellules nucléées individuelles distinctes partagent un cytoplasme commun. Alors que l’avantage du syncytium durant la fécondation est tout à fait évident, les syncytia se produisent également dans de nombreux contextes de développement différents dans les plantes, les champignons et dans le règne animal, des insectes aux humains, pour des raisons qui ne sont pas immédiatement évidentes. Par exemple, la lignée germinale de nombreuses espèces de vertébrés et d'invertébrés, des insectes aux humains, présente une structure syncytiale, suggérant que les syncytia constituent des phases conservées de développement de la lignée germinale. Malgré la prévalence commune des syncytia, ces derniers ont cependant confondu les scientifiques depuis des décennies avec des questions telles que la façon dont ils sont formés et maintenus en concurrence avec leurs homologues diploïdes, et quels sont les avantages et les inconvénients qu'ils apportent. Cette thèse va décrire l'utilisation de la lignée germinale syncytiale de C. elegans afin d'approfondir notre compréhension de l'architecture, la fonction et le mode de formation des tissus syncytiaux. Les cellules germinales (CGs) dans la lignée germinale de C. elegans sont interconnectées les unes aux autres par l'intermédiaire de structures appelées des anneaux de CG. En utilisant l'imagerie des cellules vivantes, nous avons d'abord analysé l'architecture syncytiale de la lignée germinale au long du développement et démontré que la maturation de l'anneau de CG se produit progressivement au cours de la croissance des larves et que les anneaux de CG sont composés de myosine II, de l'anilline canonique ANI-1, et de la courte isoforme d’anilline ANI-2, qui n'a pas les domaines de liaison à l’actine et à la myosine, depuis le premier stade larvaire, L1. Parmi les composants de l'anneau de CG, ANI-2 est exprimé au cours du développement et exclusivement enrichi entre les deux CGs primordiales (CGPs) au cours de l'embryogenèse de C. elegans, indiquant qu’ANI-2 est un composant bona fide des anneaux de CG. Nous avons en outre montré que les anneaux de CG sont largement absents dans les animaux mutants pour ani-2, montrant que leur maintien repose sur l'activité d'ANI-2. Contrairement à cela, nous avons trouvé que la déplétion d’ANI-1 a augmenté à la fois le diamètre des anneaux de CG et la largeur du rachis. Fait intéressant, la déplétion d’ANI-1 dans les mutants d’ani-2 a sauvé les défauts d'anneaux de CG des gonades déficientes en ani-2, ce qui suggère que l'architecture syncytiale de la lignée germinale de C. elegans repose sur un équilibre de l'activité de ces deux protéines Anilline. En outre, nous avons montré que lors de leur entrée à l'âge adulte, les mutants ani-2 présentent de sévères défauts de multinucléation des CGs qui découlent de l'effondrement des membranes de séparation des CGs individuelles. Cette multinucléation a coïncidé avec le début de la diffusion cytoplasmique, dont le blocage réduit la multinucléation des gonades mutantes pour ani-2, suggérant que les anneaux de CG résistent au stress mécanique associé au processus de diffusion cytoplasmique. En accord avec cela, nous avons trouvé aussi que la gonade peut soutenir la déformation élastique en réponse au stress mécanique et que cette propriété repose sur la malléabilité des anneaux de CGs. Dans une étude séparée afin de comprendre le mécanisme de formation du syncytium, nous avons suivi la dynamique de division de la cellule précurseur de la lignée germinale, P4 en deux CGP dans l’embryon de C. elegans. Nous avons démontré que les CGPs commencent la cytocinèse de manière similaire aux cellules somatiques, en formant un sillon de clivage, qui migre correctement et transforme ainsi l'anneau contractile en anneau de « midbody ring » (MBR), une structure qui relie de manière transitoire les cellules en division. Malgré cela, les CGPs, contrairement à leurs homologues somatiques, ne parviennent pas à accomplir la dernière étape de la cytocinèse, qui est la libération abscission-dépendante du MBR. Au lieu de cela, le MBR persiste à la frontière entre les CGPs en division et subit une réorganisation et une maturation pour se transformer finalement en structures en forme d'anneau qui relient les cellules en division. Nous montrons en outre que les composants du MB/MBR; UNC-59Septin, CYK-7, ZEN-4Mklp1, RHO-1RhoA sont localisés à des anneaux de CG au long du développement de la lignée germinale du stade L1 à l'âge adulte, ce qui suggère que les anneaux de CG sont dérivés des MBR. Bien qu'il reste encore beaucoup à faire pour comprendre pleinement le mécanisme précis de la formation du syncytium, le maintien, ainsi que la fonction du syncytium, nos résultats appuient un modèle dans lequel la stabilisation du MBR et la cytocinèse incomplète pourraient être une option conservée dans l’évolution pour la formation du syncytium. En outre, notre travail démontre que les régulateurs de la contractilité peuvent jouer un rôle dans la maturation et l’élasticité de l'anneau de CG au cours du développement de la lignée germinale, fournissant un ajout précieux pour une plus ample compréhension de la syncytiogenèse et de sa fonction.