Dissection of the early steps in the assembly of the 20S proteasome in Saccharomyces cerevisiae

Tese de dout., Bioqu��mica (Biologia Celular e Molecular), Faculdade de Ci��ncias e Tecnologia, Univ. do Algarve, 2010

Exploring an uncommon host-parasite interaction to unveil the uniqueness of Perkinsus sp as a model organism

We report the exploration of some unique metabolic pathways in Perkinsus olseni a marine protist parasite, responsible to significant mortalities in mollusks, especially in bivalves all around the world. In Algarve, south of Portugal carpet shell clam Ruditapes decussatus mortalities can reach up to 70%, causing social and economic losses. The objective of studying those unique pathways, is finding new therapeutic strategies capable of controlling/eliminating P. olseni proliferation in clams. In that sense metabolic pathways, were explored, and drugs affecting these cycles were tested for activity. The first step involved the identification of the genes behind those pathways, the reconstitution of the main steps, and molecular characterization of those genes and later on, the identification of possible targets within the genes studied. Metabolic cycles were screened due to the fact of not being present in host or differ in a critical way, such as the following pathways: shikimate, MEP-����� isoprenoids, Leloir cycle for chitin production, purine biosynthesis (unique among protists), the de novo synthesis of folates (absent in metazoa) and some unique genes like, the alternative oxidase (a branch of respiratory chain) and the hypoxia sensor HPH. All those pathways were covered and possible chemical inhibition using therapeutic drugs was tested with positive results. The relation between the common host Ruditapes decussatus and P. olseni was also explored in a dimension not possible some years ago. With the accessibility to second generation sequencers and microarray analysis platforms, genes involved in host defense or parasite virulence and resistance to the host were deciphered, allowing aiming to new targets (mechanisms and pathways), offering new possibilities for the control of Perkinsus in close environments. The thousands of genes, generated by this work, sequenced and analyzed from this commercial valuable clam and for Perkinsus olseni will be an important and value tool for the scientific community, allowing a better understanding of host-�����parasite interactions, promoting the usage of P. olseni as an emerging model for alveolata parasites.

The role of hypoxia in the regulation of membrane transporters

ATP binding cassette (ABC) and solute carrier (SLC) transporters are responsible for the majority of the transcellular movement of various substrates, including drugs, among epithelial cells. Despite the well characterized regulation of influx (SLC) and efflux (ABC) transporters by endogenous mediators, such as inflammatory cytokines, little is known about how changes in oxygen levels may affect expression of these transporters. In this study we showed that the expression of SLC22A4, SLC22A5, SLC22A1, SLC02B1, SLC10A2, ABCC2 and ABCC3 transporters is upregulated by hypoxia in HT29 colon carcinoma cells, but not in HepG2 hepatocarcinoma cells. Moreover, OCTN1 (SLC22A4), OCT1 (SLC22A1) and OATP-B (SLC02B1) transporter expression is also induced by inflammatory cytokines but in a smaller extent than in hypoxia. Furthermore our experiments indicate that there is no cross talk between HIF-1 and NF-��B pathways in HT-29 cells, but these two pathways act simultaneously activating common genes, such as, some SLC and ABC transporters. Our preliminary results from studies with an in vivo murine model of colitis, suggest that HIF-1������is stabilized and OCTN1 is strongly induced during severe inflammation, which can be relevant for a recovery from the inflammatory process. We have also been interested in the distribution of HIF-1�� variants among different ethnic groups as well as their contribution for cancer risk. Thus, we have demonstrated that there is an ethnicity-related variation in the frequency of the C1772T (P582S) single nucleotide polymorphism (SNP) in the HIF-1�� gene. Furthermore, we performed a case-control study in a breast cancer population and our results suggest that there is no association between this SNP or the rare G1790A (A588T) SNP and the incidence of breast cancer. Taken together, the results obtained in this study contribute to a better knowledge of drug influx and efflux during hypoxia and inflammation as well as to the understanding of the pharmacogenetic variability of the HIF-1���.

Development of a Piggybac based direct reprogramming system for derivation of integration free induced pluripotent stem cells

Induced pluripotent stem cells (iPSc) have great potential for applications in regenerative medicine, disease modeling and basic research. Several methods have been developed for their derivation. The original method of Takahashi and Yamanaka involved the use of retroviral vectors which result in insertional mutagenesis, presence in the genome of potential oncogenes and effects of residual transgene expression on differentiation bias of each particular iPSc line. Other methods have been developed, using different viral vectors (adenovirus and Sendai virus), transient plasmid transfection, mRNA transduction, protein transduction and use of small molecules. However, these methods suffer from low efficiencies; can be extremely labor intensive, or both. An additional method makes use of the piggybac transposon, which has the advantage of inserting its payload into the host genome and being perfectly excised upon re-expression of the transposon transposase. Briefly, a policistronic cassette expressing Oct4, Sox2, Klf4 and C-Myc flanked by piggybac terminal repeats is delivered to the cells along with a plasmid transiently expressing piggybac transposase. Once reprogramming occurs, the cells are re-transfected with transposase and subclones free of tranposon integrations screened for. The procedure is therefore very labor intensive, requiring multiple manipulations and successive rounds of cloning and screening. The original method for reprogramming with the the PiggyBac transposon was created by Woltjen et al in 2009 (schematized here) and describes a process with which it is possible to obtain insert-free iPSc. Insert-free iPSc enables the establishment of better cellular models of iPS and adds a new level of security to the use of these cells in regenerative medicine. Due to the fact that it was based on several low efficiency steps, the overall efficiency of the method is very low (<1%). Moreover, the stochastic transfection, integration, excision and the inexistence of an active way of selection leaves this method in need of extensive characterization and screening of the final clones. In this work we aime to develop a non-integrative iPSc derivation system in which integration and excision of the transgenes can be controlled by simple media manipulations, avoiding labor intensive and potentially mutagenic procedures. To reach our goal we developed a two vector system which is simultaneously delivered to original population of fibroblasts. The first vector, Remo I, carries the reprogramming cassette and GFP under the regulation of a constitutive promoter (CAG). The second vector, Eneas, carries the piggybac transposase associated with an estrogen receptor fragment (ERT2), regulated in a TET-OFF fashion, and its equivalent reverse trans-activator associated with a positive-negative selection cassette under a constitutive promoter. We tested its functionality in HEK 293T cells. The protocol is divided in two the following steps: 1) Obtaining acceptable transfection efficiency into human fibroblasts. 2) Testing the functionality of the construct 3) Determining the ideal concentration of DOX for repressing mPB-ERT2 expression 4) Determining the ideal concentration of TM for transposition into the genome 5) Determining the ideal Windows of no DOX/TM pulse for transposition into the genome 6) 3, 4 and 5) for transposition out of the genome 7) Determination of the ideal concentration of GCV for negative selection We successfully demonstrated that ENEAS behaved as expected in terms of DOX regulation of the expression of mPB-ERT2. We also demonstrated that by delivering the plasmid into 293T HEK cells and manipulating the levels of DOX and TM in the medium, we could obtain puromycin resistant lines. The number of puromycin resistant colonies obtained was significantly higher when DOX as absent, suggesting that the colonies resulted from transposition events. Presence of TM added an extra layer of regulation, albeit weaker. Our PCR analysis, while not a clean as would be desired, suggested that transposition was indeed occurring, although a background level of random integration could not be ruled out. Finally, our attempt to determine whether we could use GVC to select clones that had successfully mobilized PB out of the genome was unsuccessful. Unexpectedly, 293T HEK cells that had been transfected with ENEAS and selected for puromycin resistance were insensitive to GCV.

Era uma vez... no ensino da biologia e da geologia

Disserta����o de mest., Biologia e Geologia, Faculdade de Ci��ncias do Mar e do Ambiente, Univ. do Algarve, 2007

Efeito da prote��na anticongelante tipo I (AFP I) na criopreserva����o de embri��es e blast��meros de tele��steos

Disserta����o de mest., Biologia Marinha, Faculdade de Ci��ncias do Mar e do Ambiente, Universidade do Algarve, 2007

Endocrine regulation of extracellular matrix proteins in calcified tissue in teleost fish

Tese dout., Biologia, Universidade do Algarve, 2005

Role of insulin and insulin-like peptides in bone formation: identification of bone-specific target genes and regulatory mechanisms, and characterization of the insulin-mimetic effect of vanadium

Tese de Doutoramento em Biologia, Especialidade em Biologia Molecular, Universidade do Algarve, 2008

Purifica����o e caracteriza����o de prote��nas Gla nos modelos peixe e mam��fero

Disserta����o de Mestrado, Biologia Molecular e Microbiana, Faculdade de Ci��ncias e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2010

Avalia����o da biologia reprodutiva do cagarro Calonectris diomedea borealis no arquip��lago dos A��ores

Disserta����o mest., Biologia Marinha, Universidade do Algarve, 2008

Biologia alimentar do Etmopterus pusillus no Algarve

Disserta����o mest., Biologia Marinha, Universidade do Algarve, 2007

Caract��risation des m��canismes d���action du microARN 169 chez Arabidopsis thaliana

Disserta����o de mest., Engenharia Biol��gica, Faculdade de Ci��ncias e Tecnologia, Univ. do Algarve, 2011

Aspectos da biologia reprodutiva e alimentar da chilreta Sternula albifrons em habitats natural e alternativo na Ria Formosa

Este trabalho descreve a biologia reprodutiva e dieta da chilreta Sternula albifrons no Sul de Portugal, entre 2008 e 2010. Foram analisadas as vari��veis reprodutivas: tamanho m��dio das posturas, sucesso de eclos��o e volume dos ovos entre os v��rios anos e habitats natural (Praias) e alternativo (Salinas). A dieta foi caracterizada a partir da identifica����o dos ot��litos sagitais encontrados nos regurgitos recolhidos perto dos ninhos nas col��nias das salinas. Foram identificados um m��ximo de 11 esp��cies ou g��neros de peixe na dieta da chilreta. O peixe-rei (Atherina spp.) e os g��bios (Pomatoschistus spp.) foram as esp��cies com maior frequ��ncia de ocorr��ncia nos regurgitos (sempre superior a 75% e 25% respectivamente). Foram encontradas diferen��as significativas somente na propor����o da presa ���itens n��o identificados��� o que se deve ��s limita����es do pr��prio m��todo. Os resultados obtidos para as v��rias vari��veis reprodutivas foram comparados com outros estudos anteriores das mesmas col��nias por forma a avaliar a adequabilidade das salinas como habitats alternativos de nidifica����o. N��o foram encontradas diferen��as significativas nas vari��veis reprodutivas entre os habitats natural e alternativo o que suporta a ideia de que as salinas s��o um habitat alternativo adequado para a nidifica����o da chilreta no Sul de Portugal. S��o discutidas algumas ac����es de conserva����o para as col��nias em quest��o.

Biologia pesqueira e din��mica populacional de Diplodus vulgaris (geoffr.) e Spondyliosoma cantharus (L.) (pisces, sparidae) na costa sudoeste de Portugal

As esp��cies da fam��lia Sparidae ocupam um lugar de destaque na actividade pesqueira da Costa Sudoeste de Portugal, sendo das principais subsidi��rias da pesca artesanal nesta regi��o. Com o presente trabalho pretendeu-se clarificar aspectos b��sicos da biologia de dois espar��deos, Diplodus vulgaris (safia) e Spondyliosoma cantharus (choupa), nas ��reas da ecologia alimentar, reprodu����o, idade, crescimento e mortalidade; estimar os par��metros de selectividade das artes de pesca mais importantes sobre estas esp��cies e avaliar preliminarmente o estado da pescaria destes dois espar��deos. Para atingir estes objectivos cumpriu-se um plano de amostragem de frequ��ncias de comprimento nas lotas de Sagres e Sines, de Julho de 1992 a Mar��o de 1994; estudos laboratoriais com amostras recolhidas em Sagres de Dezembro de 1992 a Mar��o de 1994 e um estudo de selectividade de aparelho de anzol e redes de emalhar realizado em 1997/98. Os h��bitos alimentares foram estudados a partir da an��lise de conte��dos estomacais, utilizando-se 3 m��todos de avalia����o da composi����o da dieta, 5 ��ndices combinados da bibliografia e 3 propostos. Da an��lise comparativa entre os v��rios ��ndices concluiu-se que o ��ndice de import��ncia relativa (IRI) e o ��ndice de alimenta����o ponderado (IPO2) ser��o os mais adequados para descrever as dietas destas esp��cies. Registaram-se elevados coeficientes de vacuidade, motivados em grande parte pela natureza da arte de pesca. A dieta de D. vulgaris �� composta essencialmente por ofiur��deos, poliquetas, anf��podes e equin��ides, enquanto que S. cantharus consome principalmente poliquetas, anf��podes e hidrozo��rios. As duas dietas s��o significativamente diferentes, principalmente pelo maior consumo de equinodermes no caso de D. vulgaris. A estrutura e dimens��es da boca nestes espar��deos s��o distintas, podendo influenciar o seu comportamento tr��fico. �� semelhan��a de grande parte dos espar��deos, D. vulgaris e S. cantharus s��o esp��cies bent��voras, que adoptam uma estrat��gia alimentar generalista, com fortes afinidades com o alimento dispon��vel no meio. Da an��lise do ciclo reprodutivo verificou-se que as ��pocas de postura s��o extensas: D. vulgaris: Dezembro a Mar��o com maior intensidade em Janeiro/Fevereiro; S. cantharus: Fevereiro a Abril, com m��xima intensidade em Mar��o. N��o existiram diferen��as significativas na propor����o entre os sexos (M:F = 1.01) ao longo do ano e por tamanho em D. vulgaris, enquanto que em S. cantharus as f��meas foram mais abundantes ao longo do ano (M:F=0.57) e nas classes de comprimento inferiores. Os tamanhos de 1�� matura����o (L50%) para o conjunto dos sexos e indiv��duos indeterminados foram de: D. vulgaris, 18.33 cm, n��o existindo diferen��as significativas entre machos e f��meas; S. cantharus, 20.10 cm, existindo diferen��as significativas entre machos (22.41 cm, TL) e f��meas (19.98 cm, TL). Os tamanhos de 1�� matura����o estimados foram consideravelmente superiores aos tamanhos m��nimo legais de desembarque (TML) em Portugal, para D. vulgaris (TML=15.0 cm) e ligeiramente inferiores no caso de S. cantharus (TML=23 cm). A fecundidade m��dia absoluta (Fa) e a fecundidade relativa (Fr) foram de: D. vulgaris - Fa = 131127 ovos; Fr = 526 ovos/g; S. cantharus - Fa = 61396 ovos; Fr = 346 ovos/g. As rela����es entre a fecundidade absoluta e o comprimento total (TL) e o peso som��tico (SW) foram as seguintes: D. vulgaris: Fa = 0.1853TL4.1903; Fa = 57.715SW1.4067; S. cantharus: Fa = 436.27TL1.5747; Fa = 2979.7SW0.585. A estrat��gia reprodutiva destas esp��cies �� caracterizada por hermafroditismo, rudimentar com eventual prot��ndria parcial em D. vulgaris e protog��nia em S. cantharus. A determina����o da idade foi efectuada pela an��lise de estruturas duras, ot��litos para D. vulgaris e ot��litos e escamas para S. cantharus. As estima����es do comprimento �� idade ajustaram-se bem ao modelo de Von Bertalanffy. De entre os m��todos de estima����o dos par��metros de crescimento, escolheu-se o ajuste n��o linear aplicado a todos os pares de comprimentos �� idade, sendo esta corrigida pela data de captura. Para al��m do maior rigor desta an��lise, os resultados produzidos foram considerados os mais aproximados da realidade: D. vulgaris (ot��litos): L���=28.1 cm K=0.30 ano-1 e t0= -1.618 anos (validade: 12.5-30.5 cm; 1-10 anos); S. cantharus (escamas): L���=35 cm, K=0.32 ano-1 e t0=-0.481 anos (validade: 14.3-33.5 cm; 1-9 anos). A an��lise de distribui����o de frequ��ncias de comprimento, apresentou um L��� mais pr��ximo da realidade: L���=39.6 cm, K=0.32 ano-1 e t0=-0.481 anos (D. vulgaris); L���=40.0 cm, K=0.24 ano-1 e t0=-0.646 anos (S. cantharus). As rela����es peso-comprimento de D. vulgaris e S. cantharus para a Costa Sudoeste foram do tipo potencial W=a Lb, sendo definidas pelos seguintes par��metros: a=0.0223 e b= 2.895, r2=0.89 (D. vulgaris); a=0.0106 e b= 3.085, r2= 0.89 (S. cantharus). Os valores de mortalidade natural (M), estimados por m��todos indirectos, para D. vulgaris e S. cantharus foram de 0.39 e 0.30 ano-1, respectivamente. O valor de M de espar��deos pode ser estimado preliminarmente mediante a utiliza����o de uma regress��o multilinear que integra as tr��s vari��veis (M, K e L���): M = -0.162 + 1.714K + 0.00273L��� (r2=0.77). A an��lise das curvas de captura permitiu obter os seguintes valores de mortalidade total (Z): D. vulgaris: Z=0.642 (ot��litos) e 0.727 ano-1 (frequ��ncias de comprimento); S. cantharus: Z=0.676 (escamas) e 0.576 ano-1 (frequ��ncias de comprimento). As artes de pesca mais importantes para D vulgaris e S. cantharus e para a regi��o considerada s��o, por ordem de grandeza, o aparelho de anzol e redes de emalhar, e em menor escala a arte do cerco. Os espar��deos diversos e dentro destes a choupa, que deveria ser discriminada nas estat��sticas oficiais, constitu��ram os ��nicos espar��deos que apresentaram uma evolu����o com tend��ncia negativa de 1987 a 1998. A estrutura demogr��fica de desembarques de safia �� caracterizada por cerca de 86.9 % indiv��duos entre 20.5 a 27.5 cm (2 a 6 anos), enquanto que para a choupa, 85.0% dos indiv��duos desembarcados est��o compreendidos entre 21.5 e 27.5 cm (2 a 6 anos). No estudo de selectividade foram realizadas 40 pescas experimentais em que se testaram 4 tamanhos de anzol (n��11, 12, 13 e 15) e de malha (80, 70, 60 e 50mm). D. vulgaris e S. cantharus s��o das esp��cies mais abundantes na pescaria com aparelho de anzol, tendo uma representa����o inferior quer em termos relativos, quer absolutos nas capturas das redes de emalhar. Existiu um decr��scimo geral das taxas de captura com o tamanho do anzol e uma maior efici��ncia para os tamanhos interm��dios da malha nas redes de emalhar. Paralelamente, existiu para ambas as esp��cies uma sobreposi����o de comprimentos m��dios com o tamanho dos anz��is e uma separa����o clara de comprimentos m��dios de ambas as esp��cies com a malhagem. Adoptaram-se, com bom ajuste, uma curva de selectividade do tipo log��stica para o aparelho de anzol e normal para as redes de emalhar, para ambas as esp��cies. Atendendo a uma eventual revis��o dos tamanhos m��nimos legais de desembarque, em fun����o dos tamanhos de primeira matura����o e �� estrutura das capturas, as malhas de 70 e 80mm s��o as mais adequadas na pescaria de D. vulgaris e S. cantharus, respectivamente. O anzol n��mero 13 ser�� o mais apropriado a D. vulgaris, dada a pouca praticabilidade do anzol 15. Em rela����o a S. cantharus o anzol n�� 11 apresenta a menor propor����o de indiv��duos com tamanho ilegal, sendo ent��o o mais indicado �� pescaria desta esp��cie. Para o aparelho de anzol e de acordo com os modelos de rendimento por recruta a pescaria de safia processa-se de forma moderada, a n��veis inferiores a uma taxa de explora����o m��xima (Emax) suport��vel pelo "stock". A pescaria de choupa apresenta ind��cios de uma explora����o intensa, pr��xima dos valores m��ximos comportados pelo "stock". Uma altera����o nos valores actuais da taxa de explora����o e/ou de comprimento de 1�� captura ter�� de ter em considera����o o car��cter multiespecifico desta pescaria. Visando a gest��o destes recursos pesqueiros, dever-se-�� controlar principalmente o n��vel do esfor��o de pesca praticado e rever os tamanhos m��nimos de desembarque, de modo a evitar que esta pescaria entre numa fase de sobreexplora����o. O estabelecimento de reservas marinhas e de recifes artificiais poder�� ser um contributo para uma explora����o pesqueira sustentada e para a conserva����o da biodiversidade.

Filodin��mica do v��rus da tristeza dos citrinos: epidemiologia molecular e biologia evolutiva

O Citrus tristeza virus (CTV), respons��vel por v��rias doen��as em citrinos, �� um dos maiores condicionantes da citricultura a n��vel mundial. Existem diversos isolados de CTV com diferentes caracter��sticas biol��gicas e moleculares, sendo que os sintomas causados pelo v��rus dependem essencialmente do isolado viral e da combina����o variedade/porta-enxerto. A implementa����o de medidas de controlo da doen��a depende, em grande parte, do tipo de isolados presentes numa dada regi��o. No Cap��tulo 2, efetuou-se uma an��lise comparativa entre dois m��todos de tipifica����o de isolados de CTV e verificou-se que a caracteriza����o por PCR assim��trico-ELISA, que considera a exist��ncia de sete grupos, �� mais adequada �� descri����o da estrutura gen��tica de CTV. Estes resultados foram complementados com o estudo da din��mica de coloniza����o de cada grupo filogen��tico atrav��s de um imuno-ensaio in situ (Cap��tulo 3). Os resultados obtidos sugerem que os isolados de CTV diferem na quantidade de c��lulas infetadas e que essa diferen��a parece estar relacionada com a severidade do isolado. No Cap��tulo 4, o estudo da variabilidade gen��mica da regi��o 3��� terminal permitiu verificar que a estrutura de grupos obtida para o gene da prote��na da c��pside (CP) �� extens��vel a toda a regi��o 3��� terminal que cont��m os genes mais fortemente implicados na intera����o com o hospedeiro. A estabilidade da estrutura gen��tica nesta regi��o foi tamb��m inferida a partir da pesquisa de eventos de recombina����o. Os resultados sugerem uma baixa frequ��ncia de recombina����o entre isolados de CTV, mesmo em isolados contendo mistura de hapl��tipos e mantidos h�� mais de 12 anos no mesmo hospedeiro. Adicionalmente, foi estimada a taxa de evolu����o de CTV atrav��s de um m��todo estat��stico Bayesiano (Cap��tulo 5). Para tal, foram usadas sequ��ncias do gene da CP de isolados de diversas regi��es do mundo, pertencentes a diferentes grupos filogen��ticos e obtidas entre 1990 e 2010. A taxa m��dia de evolu����o estimada foi de 1,58 X 10-4 substitui����es nucleot��dicas / ano. No geral, os resultados destes dois cap��tulos mostram que os isolados de CTV mant��m uma elevada estabilidade gen��tica ao longo do tempo. Finalmente, no Cap��tulo 6, foi estudada a situa����o epidemiol��gica de CTV em Portugal continental a partir de isolados de CTV recolhidos no campo, onde se verificou que a maioria das ��rvores infetadas era composta por isolados de CTV pertencentes ao grupo M, ou seja isolados considerados suaves e que n��o provocam sintomas severos.