Caractérisation des mécanismes d’action du microARN 169 chez Arabidopsis thaliana

Dissertação de mest., Engenharia Biológica, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Univ. do Algarve, 2011

Todo um novo mundo de pequenos RNA não-codificantes (ncRNA) foi descoberto nos finais dos anos 90. Existem três classes: os microRNA, os piwiRNA e os siRNA (pequenos RNA de interferência), que vão diferir no seu modo de biogénese. Os fenómenos de silenciamento de genes relacionados com esses últimos RNA não-codificantes de pequeno tamanho são denominados PTGS (Post-transcriptional Gene Silencing). Este trabalho está relacionado com a terceira classe desses pequenos RNA não-codificantes: os microRNA (miRNA). Estes são moléculas de RNA não-codificante de cerca de 20 à 24 nucleóticos, recentemente descobertos, capazes de regular a expressão de genes em nível pós-transcricional através da clivagem ou inibição da tradução de moléculas-alvo de RNA mensageiro. Foram descobertos até à data milhares de miRNA em dezenas de plantas e animais. O primeiro microRNA foi identificado em 1993, com a descoberta de dois loci genéticos chamados lin-4 e lin-14 envolvidos no desenvolvimento de um verme, o nemátodo Caenorhabditis elegans. Rosalind Lee e sua equipa mostraram que o produto do gene lin-4 não era uma proteína, mas sim um pequeno RNA não-codificante de 22 pares de bases (Lee et al., 1993). Foi apenas no ano 2000 que se descobriu um segundo microRNA, let-7, de 21 nucleóticos (Reinhart et al., 2000). O grande interesse das pesquisas sobre os miRNA ao longo das últimas décadas reside no papel dos miRNA na regulação do genoma e do metabolismo celular. É de destacar a sua função na modulação da biologia de sistemas, e as suas implicações, por exemplo, em patologia ou fisiologia. Em 2002, foi demonstrado que os miRNA também existiam em plantas, tendo sido descritos 16 miRNA diferentes em Arabidopsis thaliana (Reinhart et al., 2002). Os miRNA de plantas estão envolvidos, tal como nos animais, em processos de desenvolvimento e differenciação, tendo um papel em diversos processos de desenvolvimento, tal como, a floração, o desenvolvimento radicular e do embrião, na função dos meristemas e na resposta hormonal. Os miRNA desempenham também um papel importante na resposta das plantas a stresses abióticos e deficiências nutricionais. A compreensão da biogénese dos miRNA nas plantas teve uma grande evolução ao longo dos últimos anos. Verificou-se que os genes que codificam os miRNA estão geralmente situados em regiões não codificantes do genoma e são transcritos pela RNA polimerase II. Os transcritos primários, denominados pri-miRNA, são convertidos em miRNA precursores (pré-miRNA) pela proteína Dicer-like 1 (DCL1) com a ação concertada das proteínas HYL1 e SE. DCL1 cliva o pré-miRNA, resultando um miRNA de cadeia dupla, que comporta uma cadeia guia miR e uma cadeia miR* que será degradada. Este miRNA maduro será então metilado pela proteína HEN1, que o vai proteger de eventuais ataques por nucléases. Em seguida, o miRNA maduro é exportado do núcleo para o citoplasma e a cadeia guia miR será então incorporada num complexo proteico chamada RISC ligado a uma proteína Argonaute. Este complexo vai então regular a expressão genética por meio de três mecanismos: clivagem do RNAm e/ou inibição da tradução do RNAm (Vaucheret, 2008). Nos últimos anos, têm sido feitos notáveis progressos na compreensão da biogénese dos miRNA e das suas funções, no entanto, os mecanismos de ação usados para regular a expressão genética das moléculas-alvo permanecem obscuros e controversos. Nas plantas, os alvos dos miRNA são principalmente fatores de transcrição. Esses fatores são conhecidos por terem um papel importante no desenvolvimento ou na resposta das plantas aos stresses ambientais. Este projeto consistiu em estudar os mecanismos de ação do microRNA169 (miR169), o qual é importante devido ao seu papel no desenvolvimento das plantas. Como exemplo, um estudo na planta Medicago truncatula revelou que o desenvolvimento de nódulos simbióticos foi regulado pelo miR169 (Combier et al., 2006). Também foi demonstrado que o miR169 estava envolvido na resposta à deficiência de nitrogénio em A. thaliana (Zhao et al., 2011), na qual existem quatro formas alélicas do miR169 gerados a partir de 14 loci (a,b,c,d,e,f,g,h,I,j,k,l,m,n) e dez genes codificando fatores de transcrição da família "Nuclear Factor Y - A" (NF-YA). Sete dos genes de NF-YA (NF-YA1, NF-YA2, NF-YA3, NF-YA5, NF-YA8, NF-YA9 e NF-YA10) têm uma sequência de reconhecimento para miR169 e são, portanto, potencialmente regulados por, pelo menos, uma das formas alélicas do miRNA (Rhoades & Bartel, 2004). Neste trabalho estudámos o modo de ação das isoformas a, b e d de miR169 sob os alvos NF-YA1 e NF-YA2. Este estudo foi realizado por transformação transitória de plantas de tabaco após agroinfiltração de diferentes combinações de construções [miRNA + alvo]. Todas as construções de interesse estavam disponíveis, exceto o 35S:miR169b que eu criei, tendo a particularidade de serem fundidos a um promotor forte (promotor 35S), que permitiu a sobre-expressão das nossas sequências de interesse: miR169a, miR169b, miR169d, GFP-3'UTR-NFYA1wt, GFP-3'UTR-NFYA1mut, GFP-3'UTR-NFYA2wt e GFP-3'UTR-NFYA2mut. As sequências mutadas (mut) do 3'UTR (regiões não coficantes) sofreram uma eliminação do sítio de reconhecimento para o miR169 e as sequências do tipo selvagem (wt) são as sequências sem mutação. As sequências encontram-se acoplados à sequência que codifica a GFP (gene repórter). Co-infiltrando uma planta com a combinação [miR169 + NFYAwt], podemos comparar a acumulação de GFP obtido com uma planta que foi co-infiltrada com a mesma construção de miR169, mas desta vez contendo o gene NF-YA mutado [miR169 + NFYAmut], ou seja, sem o sítio de fixação a miR169. Para verificar se o modo de regulação de NF-YA por miR169 é feito por inibição da tradução, medimos a atividade do gene repórter num extrato de proteína proveniente das folhas agroinfiltradas. Em seguida, estimámos a quantidade de transcritos obtidos por PCR quantitativa em tempo real (qPCR) para analisar se o efeito de miRNA resulta na clivagem dos transcritos. Para verificar se o microRNA se encontra acumulado nas folhas agroinfiltradas, foi necessário realizar Northern Blot aos RNA extraídos. As experiências de agroinfiltração demonstraram que os transcritos de NF-YA1 são poucos ou não regulados por miR169a, que são regulados por clivagem pela isoforma b e que não são alvos de miR169d. No caso dos transcritos de NF-YA2, os resultados obtidos revelaram que não são alvos de miR169a, que são poucos ou não regulados pela isoforma b de miR169. E finalmente miR169d parece regular os transcritos NF-YA2 por clivagem e por inibição da tradução.