Ecotoxicological tests using Chironomus riparius

Os sistemas aquáticos naturais podem estar sujeitos frequentemente a entrada de tóxicos, quer seja através da lixiviação dos campos agrícolas ou da descarga por parte de unidades industriais. Avaliar o impacto potencial destes contaminantes nos sistemas aquáticos é muito importante, porque pode promover consequências sérias no balanço ecológico dos ecossistemas. Os efeitos de níveis sub-letais destes tóxicos nas populações aquáticas são detectados, em muitos casos, somente após diversas gerações, dependendo da espécie e do contaminante. O comportamento animal é considerado como sendo a primeira linha de defesa perante estímulos ambientais, e pode ser uma representação de alterações fisiológicas no organismo, sendo portanto um indicador excelente de alterações ambientais. O desenvolvimento dos sistemas de aviso prévio que integram parâmetros comportamentais pode ajudar a prever mais rapidamente possíveis alterações ao nível das populações naturais, do que a utilização de testes ecotoxicológicos padrão com a mesma finalidade. O conhecimento acerca de possíveis implicações devido a alterações comportamentais, em organismos bentónicos e em populações do campo sujeitas a tóxicos, é ainda escasso. Sabendo isto, neste estudo pretendeu-se investigar como o comportamento de Chironomus riparius – usando um biomonitor em tempo real – e outros parâmetros tais como crescimento, emergência de adultos, bioacumulação e biomarcadores, são afectados pela exposição a imidacloprid e ao mercúrio, que foram seleccionados como contaminantes. Os resultados demonstraram que a exposição às concentrações sub-letais de imidacloprid afecta o crescimento e o comportamento dos quironomídeos e que estes organismos podem recuperar de uma exposição curta ao insecticida. O comportamento que corresponde à ventilação de C. riparius revelou-se como um parâmetro mais sensível do que a locomoção e do que as respostas bioquímicas, quando as larvas foram sujeitas ao imidacloprid. Larvas de C. riparius expostas a concentrações sub-letais de mercúrio apresentaram uma tendência de diminuição de actividade comportamental, em testes com concentrações crescentes do tóxico; o crescimento das larvas foi também prejudicado, e as taxas de emergência de adultos e o tempo de desenvolvimento apresentaram retardamento. Estes organismos podem bioacumular rapidamente o mercúrio em condições de não alimentação e apresentam uma lenta depuração deste metal. Estes efeitos podem, em último caso, conduzir a prováveis repercussões ao nível da população e das comunidades. As reduções em actividades comportamentais, mesmo em concentrações baixas, podem diminuir a quantidade de tempo gasta na procura de alimento, produzindo efeitos aos níveis morfo-fisiológicos, e assim afectar severamente o desempenho dos quironomídeos no ambiente. O uso destes factores comportamentais como um parâmetro ecotoxicológico sub-letal relevante ao nível da toxicologia aumentará a versatilidade dos testes, permitindo uma resposta comportamental mensurável e quantitativa ao nível do organismo, utilizando uma avaliação não destrutiva, e assim certificando que esta aproximação pode ser usada em testes ecotoxicológicos futuros.

Embryonic and larval ecology and biochemistry of offshore decapods

Understanding the biology of offshore species is hardened by the difficulties of sampling in the deep-sea environment. Additionally, due to the vastness of the open ocean, knowledge of early life histories of pelagic larvae is still relatively scarce. In decapod species with bentho-pelagic lifestyle, the transition from life in the seafloor to the water column not only is associated with drastic morphological metamorphosis, but also with changes in behavior and feeding ecology. The purpose of the present thesis was to investigate physiological, biochemical and behavioral adaptation occurring during early development of such species. The Norway lobster, Nephrops norvegicus, and the crab Monodaeus couchi were used as a model as these two species are encountered off the NE Atlantic shelf at depth greater than 300 m. Chapter 1 introduces the challenges faced by both adult and larvae inhabiting such remote habitats, including the effect of food availability on development and oceanographic processes on dispersal and recruitment. The thesis follows early life histories, starting with within-brood variability in the fatty acid (FA) profile displayed by developing N. norvegicus embryos. There were no differences in the FA composition of embryos sampled from both sides of the brooding chamber in most females. However, all females exhibited significant differences in the FA profiles of embryos sampled from different pleopods. Potential causes for the variations recorded may be differential female investment during oocyte production or shifts in FA catabolism during the incubation period promoted by embryo’s location within the brooding chamber. Next, feeding rates and digestive enzymes activity of the early stage larvae was investigated in N. norvegicus. Both stages were able to maximize food intake when larvae were scarce and showed increased feeding rate following periods of starvation. Amylase activity indicated that carbohydrates are not the primary energy reserve and that feeding may be required soon after hatching to trigger amylase activity. Protease activity indicated that protein reserves are catabolized under starvation. These results indicate that larvae may maximize prey ingestion in the presence of plankton patches with higher food abundance and minimize the deleterious effects induced by previous periods of intermittent starvation or unsuitable prey densities/types. Additionally, changes in enzymatic activity may allow newly hatched N. norvegicus larvae to metabolize protein reserves to overcome short-term starvation. Vertical migration behavior and the influence of oceanographic properties were studied next. All zoeal stages of M. couchi displayed reverse diel vertical migration. Abundance of early stages was correlated with chlorophyll a levels. An ontogenic shift in vertical distribution explained the results; earlier zoeal stages remain in the food-rich upper water column while later stages migrate to the bottom for settlement. This vertical migration behavior is likely to affect horizontal distribution of larvae. Indeed, global current patterns will result in low inter-annual variations in decapod larvae recruitment, but short term variations such as upwelling events will cause deviation from the expected dispersal pattern. Throughout development, from the embryo to metamorphosis into benthic juvenile, offshore decapods face many challenges. For the developing individual survivorship will depend heavily on food availability but also on the reserves passed on by the mother. Even though vertical migration behavior can allow the larvae to take advantage of depth varying currents for transport, the effect of general circulation pattern will superimpose local current and influence feeding conditions and affect dispersal and recruitment.

A alimentação suplementar de aves necrófagas em comedouros

A alimentação artificial de aves necrófagas tem sido alvo de atenção e as suas vantagens e desvantagens ainda são discutidas. A habituação por parte dos abutres e a atracção de espécies oportunistas são vistas como um problema. Foi disponibilizado alimento em quatro comedouros durante três anos, de 2010 a 2012. Registaram-se todas as aves observadas nos comedouros, anotando-se a espécie, o número de indivíduos e o comportamento alimentar e/ou não alimentar a cada 5 minutos. Também foi monitorizado o número de casais e o sucesso reprodutor do Grifo e do Abutre do Egipto. Notou-se uma aparente relação positiva entre estas duas espécies. A frequência de alimentação e o número de indivíduos das duas espécies aumentou gradualmente ao longo dos três anos, enquanto os tempos de detecção e alimentação diminuíram. Uma tendência oposta foi obtida para espécies oportunistas como o Milhafre-preto e o Milhafre-real. Não foi possível concluir sobre o efeito da alimentação artificial na produtividade mas pode existir uma relação da frequência de alimentação com a fase da época de reprodução na qual as crias são um factor determinante. O máximo da frequência de alimentação e o mínimo geral de tempos coincidem com as primeiras semanas das crias, para o Abutre do Egipto, e com a fase de maior requerimento destas, para o Grifo. A evolução destes parâmetros pode definir habituação. Os nossos resultados mostram que esta habituação tornou a alimentação artificial mais eficaz, com pouca quantidade de alimento, maioritariamente obtido pelo Abutre do Egipto e pelo Grifo com menor presença de espécies oportunistas. As espécies que se alimentam nos comedouros apresentam diferentes estratégias na obtenção do alimento, contornando a monopolização apresentada pelo Grifo. Desta forma o Abutre do Egipto parece estar a conseguir tirar proveito do alimento que lhe é dirigido. A disponibilização de alimento regular em poucas quantidades, nas primeiras horas de luz do dia, alternando o local onde o alimento é colocado, podem ser estratégias acertadas na alimentação suplementar dirigida ao Abutre do Egipto e ao Grifo.

Pre- and post-settlement processes regulating recruitment of the shore crab Carcinus maenas

O sucesso do recrutamento em espécies com ciclos de vida complexos, i.e. com duas ou mais fases de desenvolvimento, depende do fornecimento de larvas aos locais apropriados do assentamento (mecanismos de pré-assentamento) e na consequente sobrevivência destas larvas até aos estágios bentónicos iniciais (mecanismos de pós-assentamento). O estudo dos principais processos físicos que controlam a variabilidade intra-anual do recrutamento do caranguejo Carcinus maenas foi possível com à obtenção em séries diárias da abundância de megalopas no plâncton e do seu assentamento em substratos artificiais de assentamento, e de parâmetros físicos relacionados com a amplitude de maré e o upwelling, durante os meses da época reprodutiva deste caranguejo. Os nossos resultados demonstraram um padrão cíclico de fornecimento de megalopas de C. maenas aos estuários na costa ocidental de Portugal, relacionado com a amplitude de maré e favorecido pelos ventos de sul. O assentamento de megalopas nos substratos artificiais de assentamento mostrou-se desacoplado do fornecimento nos dois estuários. Os dados obtidos sugerem que as megalopas são transportadas para a costa após a acção de ventos de downwelling, e o fornecimento para os estuários ocorre por transporte selectivo por corrente de maré. A utilização de substratos artificiais para medir densidades de juvenis de Carcinus maenas deve ser ponderada, uma vez que se verificou que em habitats estruturalmente menos complexos os juvenis utilizam os colectores como refúgio; em habitats mais complexos, os juvenis preferiram refugiar-se nas ervas marinhas existentes. No entanto, a estimativa de abundâncias diárias medidas nos colectores permitiu a descrição das abundâncias dos vários estádios de desenvolvimento juvenis, bem como as respectivas taxas de crescimento. As capacidades locomotoras de diferentes classes de tamanho de juvenis de C. maenas foram estimadas mediante o cálculo de um índice de locomoção. Os nossos resultados sugerem que os juvenis mais pequenos estão relativamente protegidos em habitats com vegetação densa, provavelmente porque este tipo de habitats inibe os movimentos dos juvenis de maiores dimensões. Foram também encontradas evidências da existência de segregação temporal na actividade locomotora das diferentes classes de juvenis, que funcionará como um mecanismo que permite reduzir o canibalismo e, consequentemente, aumentar a capacidade de suporte dos habitats juvenis. Foi realizado um estudo sobre o canibalismo nos juvenis de C. maenas na Ria de Aveiro, in situ e utilizando densidades reais. Verificou-se que as presas mais pequenas eram as mais vulneráveis, sendo os juvenis de maiores dimensões os predadores mais eficazes. Por outro lado, as taxas de canibalismo foram menores em habitats com elevadas densidades de refúgio (Zostera noltii). A estimativa das taxas diárias de mortalidade devidas ao canibalismo são aproximadamente metade das taxas diárias de mortalidade devidas aos processos de pré-assentamento, indicando que esta população de C. maenas será regulada pelo fornecimento larvar, i.e., será uma população regulada essencialmente por mecanismos préassentamento.

Study of pesticide effects on non-target organisms

A utilização insustentável de pesticidas, especialmente em zonas com elevado valor ecológico constitui uma ameaça à integridade dos ecossistemas. Sendo um problema à escala mundial, e também no contexto nacional, o presente trabalho pretende ser um contributo para a avaliação dos efeitos de pesticidas em organismos não alvo terrestres e, principalmente, aquáticos, em contextos de progressiva relevância ecológica. Neste sentido, o estudo foi direccionado para áreas (A1 e A2) integradas numa zona agrícola extensa em Portugal, utilizada para a produção de milho e, principalmente, de arroz (Baixo Mondego), a qual sustenta uma elevada biodiversidade. O estudo teve início na área A1, onde a monitorização físico-química e os ensaios com amostras naturais (ensaios WET - whole effluent tests) provenientes desta área evidenciaram que, apesar da ausência de pesticidas, as amostras de água colhidas no canal que atravessava os arrozais foram as mais nocivas para o crescimento de Pseudokirchneriella subcapitata e Chlorella vulgaris. Uma vez que outras fontes de contaminação (produção de gado) actuavam em A1, o estudo prosseguiu apenas na área A2. Assim, em A2, começou-se por determinar a toxicidade individual e da mistura de dois herbicidas formulados aplicados nos campos de arroz (Viper®) e milho (Mikado®) em condições laboratoriais. Viper® foi o herbicida mais tóxico, tanto para o crescimento de P. subcapitata e C. vulgaris, como para a sobrevivência, reprodução e crescimento de Daphnia longispina e Daphnia magna. Adicionalmente, estimou-se que a mistura Viper®/Mikado® induz efeitos antagonistas no crescimento de P. subcapitata e efeitos sinérgicos no crescimento de C. vulgaris e na sobrevivência dos dafnídeos. A avaliação da toxicidade destes herbicidas formulados e seus ingredientes activos no comportamento de minhocas terrestres (Eisenia andrei), usando solos naturais, demonstrou que Viper® e penoxsulam causaram uma % de evitamento superior nos organismos expostos. Contudo, o risco para E. andrei será à partida reduzido se as taxas de aplicação dos herbicidas forem respeitadas. Ensaios WET foram novamente usados para testar amostras naturais da área A2. Verificou-se que a qualidade do sistema aquático e do arrozal diminuiu durante a estação agrícola, em paralelo com a presença de nutrientes e pesticidas. O crescimento algal foi inibido, apesar dos parâmetros de história de vida dos dafnídeos terem sido estimulados. O resultado desta avaliação subestimou, em certos casos, os impactos reais causados pela aplicação de pesticidas. A avaliação in situ simultânea à aplicação de herbicidas nos arrozais demonstrou que os efeitos registados foram de facto restritos aos pulsos de herbicidas. A inibição das taxas de alimentação de D. longispina e D. magna forneceram um sinal precoce de alterações no sistema, seguido pela diminuição da sua sobrevivência e do crescimento de P. subcapitata. Em suma, as diferentes fases da avaliação efectuada confirmaram a existência de condições desfavoráveis devido às práticas agrícolas, reforçando a necessidade de se conjugar ensaios laboratoriais com avaliações in situ de maior relevância ecológica, para reduzir o grau de incerteza aliado à determinação dos riscos.

Ultrastructure and phylogeny of peridinioid dinoflagellates

Os dinoflagelados são um grupo muito diverso de protistas que possuem um conjunto de características pouco comuns. Os peridinióides são dinoflagelados com teca que é formada por seis séries latitudinais de placas, incluindo a série cingular e um anel incompleto de placas intercalares anteriores, embora as últimas estejam ausentes em algumas espécies de Peridiniopsis. São dinoflagelados com simetria bilateral em relação ao plano apical que contem o eixo dorso-ventral. Na série sulcal há apenas uma placa posterior que contacta com o limite ventral de duas grandes placas antapicais. Entre os peridinióides, a presença ou ausência de um poro apical e o número de placas no cíngulo são geralmente consideradas marcas filogenéticas importantes ao nível de género ou família. Actualmente, a definição de Peridinium Ehrenberg, o dinoflagelado mais comum de água doce, inclui organismos com combinações diferentes destas duas características. Trabalhos anteriores sobre a ultrastrutura e afinidade filogenética das espécies tipo de Peridinium, P. cinctum, e Peridiniopsis Lemmermann, P. borgei também sugerem a necessidade de reexaminar as relações taxonómicas dos peridinióides. Esta tese combina o estudo ultrastrutural de uma selecção de espécies com hipóteses filogenéticas baseadas nas sequências de LSU rDNA, para aumentar o nosso conhecimento das diferenças e afinidades dentro dos peridinióides. Tem como objectivo aumentar o nosso conhecimento das características individuais das células que possam levar a reconhecer sinapomorfias que possam ser usadas como marcadores dos peridinióides como um todo e dos seus subgrupos. As espécies escolhidas para exame pormenorizado foram: Peridinium palatinum Lauterborn, de um grupo com duas placas intercalares anteriores, seis placas cingulares e sem poro apical; Peridinium lomnickii Wo!oszy"ska, de um grupo com poro apical, três placas intercalares e seis cingulares; Peridiniopsis berolinensis (Lemmermann) Bourrelly, uma espécie heterotrófica com poro apical, sem placas intercalares e com seis placas cingulares; e Sphaerodinium cracoviense Wo!oszy"ska, um membro de um género de formas com teca com um tipo de tabulação marginalmente peridinióide, com um suposto poro apical e quatro placas intercalares anteriores. Peridinium palatinum difere de Peridinium e Peridiniopsis típicos, quer em características da teca, quer internas. As diferenças estimadas entre as sequências parciais de LSU rDNA de P. palatinum e a espécie próxima P. pseudolaeve, relativamente a P. cinctum são comparativamente grandes e, juntamente com a topologia da árvore filogenética, apoiam a separação de P. palatinum e formas próximas ao nível de género. Palatinus nov. gen. foi, então, descrito com as novas combinações Palatinus apiculatus nov. comb. (espécie tipo; sin. Peridinium palatinum), P. apiculatus var. laevis nov. comb. e P. pseudolaevis nov. comb.. As características distintivas de Palatinus incluem uma superfície das placas lisa ou um tanto granulosa, mas não areolada, um grande pirenóide central penetrado por canais citoplasmáticos e de onde radiam lobos plastidiais, e a presença de uma fiada microtubular homóloga à de um pedúnculo. As células de Palatinus saem da teca pela zona antapicalpos- cingular. Peridinium lomnickii apresenta tabulação semelhante às formas marinhas, produtoras de quistos calcários, do género Scrippsiella A.R. Loeblich. Para comparação, adicionámos novas observações ultrastruturais de S. trochoidea. Peridinium lomnickii tem uma combinação de características diferente de Peridinium, Peridiniopsis e Scrippsiella. As hipóteses filogenéticas baseadas em DNA colocam P. lomnickii no mesmo ramo que Pfiesteria Steidinger et Burkholder, Tyrannodinium e outras Pfiesteriaceae, com as quais partilha um "microtubular basket" e uma ligação peculiar entre duas placas do sulco. As características distintivas do novo género proposto Chimonodinium gen. ined. incluem, além da tabulação, a ausência de pirenóides, a presença de um "microtubular basket" com quatro ou cinco fiadas sobrepostas de microtúbulos associados a um pequeno pedúnculo, um sistema pusular com tubos pusulares bem definidos ligados aos canais flagelares, e a produção de quistos não calcários. Peridiniopsis berolinensis partilha várias características significativas com Pfiesteria e afins, como um "microtubular basket" com a capacidade de suportar um tubo de alimentação, quimiossensibilidade para encontrar presas apropriadas, o modo de natação junto às presas e a organização geral da célula. Hipóteses filogenéticas com base em LSU rDNA confirmam a afinidade entre P. berolinensis e Pfiesteria bem como a relação mais remota com a espécie tipo de Peridiniopsis, P. borgei. Estas razões justificam a proposta de Tyrannodinium gen. nov., uma nova Pfiesteriaceae que difere de outros membros do grupo por viver em água doce e nos pormenores da tabulação. Sphaerodinium cracoviense revelou a tabulação típica do género Sphaerodinium, que apresenta um número de placas intercalares superiores e pos-cingulares maior que o que é típico em peridinióides: 4 e 6, respectivamente. Observações em SEM mostraram uma estrutura apical diferente da dos peridinióides, e um sulco apical numa das placas fazendo lembrar a área apical de alguns woloszynskióides. Os pormenores do aparelho flagelar e do sistema pusular ligam o Sphaerodinium aos woloszynskióides em geral e ao género Baldinia em particular, mas não aos peridinióides. O volumoso estigma de S. cracoviense revelou ser extraplastidial e de um modelo único, composto por elementos que se encontram em woloszynskióides, mas nunca encontrados anteriormente juntos. A análise filogenética baseada nas sequências parciais de LSU rDNA também sugerem uma maior proximidade de S. cracoviense com os woloszynskióides do que com os peridinióides. Futuras análises pormenorizadas de dinoflagelados peridinióides, em especial entre os do numeroso grupo de espécies com poro apical, serão necessárias para clarificar as suas relações taxonómicas; e a produção de descrições melhoradas das características finas particulares das células serão um requisito para perceber a evolução dos caracteres dos peridinióides por forma a podermos identificar marcadores filogenéticos.

Population genetics of C. Maenas : oceanography and larval dispersal

Decifrar a complexa interacção entre os ciclos de vida de espécies marinhas e a oceanografia revela-se fundamental para a compreensão do fluxo genético e da conectividade no meio marinho. Nas espécies marinhas com desenvolvimento indirecto o fluxo de genes entre populações depende da distância que separa as populações, bem como da interacção entre a duração do desenvolvimento larvar, do comportamento das larvas e dos padrões de circulação oceânica. A conectividade larvar influencia uma variedade de processos como a dinâmica de stocks e de populações, a distribuição e limites geográficos das espécies, a estrutura genética das populações e a dispersão de espécies invasivas e reveste-se consequentemente de uma importância fundamental na identificação das unidades populacionais evolucionariamente relevantes e para a gestão e conservação marinhas. Os marcadores genéticos e os Modelos Individuais Acoplados a Modelos Físico-Biológicos (“ICPBMs”) são actualmente ferramentas fundamentais para o estudo dos padrões de dispersão larvar e para avaliar o nível de conectividade populacional. A presente tese respeita à avaliação das escalas espaciais de conectividade de populações de uma espécie costeira, o caranguejo Carcinus maenas, e utiliza conjuntamente informação de marcadores genéticos, análise de séries temporais de fornecimento de larvas e um modelo numérico de circulação oceânica. O primeiro capítulo introduz a temática da conectividade em espécies marinhas e inclui algumas referências aos métodos moleculares, analíticos e de modelação seguidos ao longo da tese. Através da utilização de múltiplas ferramentas – avaliação da estrutura genética geográfica de C. maenas na sua distribuição nativa com recurso a marcadores de DNA (microssatélites) (Capítulo 2), avaliação da estrutura genética temporal das larvas que formam os eventos de fornecimento larvar à Ria de Aveiro, NW Portugal (Capítulo 3), descrição da variabilidade inter-anual do fornecimento larvar à Ria de Aveiro, NW Portugal (Capítulo 4) e validação de um modelo ICPBM que descreve os padrões observados de fornecimento (Capítulo 5) – esta tese espera poder contribuir para uma melhor compreensão dos mecanismos que regulam o fluxo de genes e a conectividade entre populações de organismos marinhos. No Capítulo 6 são apresentadas as principais conclusões da investigação. A análise genética com recurso a microssatélites indicou que as populações de C. maenas são geneticamente homogéneas ao longo de várias centenas de km, dentro da distribuição nativa da espécie. Paralelamente, não foram encontrados indícios da existência de reprodução por “sweepstakes” em C. maenas de populações da costa oeste da Península Ibérica, visto que não se obtiveram diferenças genéticas significativas entre os eventos larvares. Também não se encontrou qualquer estrutura familiar entre as larvas que formam cada episódio de fornecimento, e não houve nenhuma redução significativa da variabilidade genética das larvas quando comparada com a de caranguejos adultos. A análise de séries temporais de suprimento de larvas na Ria de Aveiro em cinco anos estudados indica que este é um fenómeno episódico e variável, sendo os maiores episódios de fornecimento coincidentes com as marés vivas e acentuados por fortes ventos de sul. O modelo ICPBM foi validado com sucesso e parece fornecer uma estimativa realística das escalas espaciais e temporais de dispersão larvar, de acordo com as observações da estrutura genética e da ausência de reprodução por “sweepstake” em C. maenas da costa oeste da Península Ibérica

Mercury in feral fish: distribution, accumulation and toxicity

O principal objectivo desta dissertação foi estudar a acumulação de mercúrio em vários tecidos de peixes marinhos, a sua relação com factores biológicos e as respectivas respostas bioquímicas. O trabalho realizado permitiu obter novos conhecimentos sobre a acumulação de mercúrio em peixes, possibilitando avaliar a influência da biodisponibilidade do elemento e as suas possíveis implicações no ambiente. O trabalho foi desenvolvido na Ria de Aveiro (Portugal), uma zona costeira onde existe um gradiente ambiental de mercúrio, o que oferece a oportunidade de estudar a sua acumulação e os seus efeitos tóxicos em condições realísticas. As amostragens foram efectuadas em dois locais considerados críticos em termos de contaminação por mercúrio – Largo do Laranjo (L1 e L2) e num local afastado da principal fonte de poluição, usado como termo de comparação (Referência; R); L1 e L2 corresponderam a locais moderadamente e altamente contaminados, respectivamente. Foram escolhidos juvenis de duas espécies ecologicamente diferentes e representativas da comunidade piscícola local, a tainha garrento (Liza aurata) e o robalo (Dicentrarchus labrax). Em cada local foram recolhidas amostras de água e de sedimento para determinação de mercúrio. Foram quantificadas as concentrações de mercúrio total (T-Hg) e orgânico (O-Hg) em vários tecidos dos peixes, escolhidos tendo em conta a sua função relativamente à toxicocinética e toxicodinâmica de metais. As respostas antioxidantes (Catalase- CAT, glutationa peroxidase- GPx, glutationa reductase- GR, glutationa –S-transferase- GST e conteúdo em glutationa total- GSHt), o dano peroxidativo (LPO) e o conteúdo em metalotioninas (MTs) foram também avaliados. A acumulação de T-Hg foi semelhante para as duas espécies de peixes estudadas, embora D. labrax tenha apresentado concentrações tendencialmente maiores. Ambas as espécies demonstraram capacidade de reflectir o grau de contaminação ambiental existente, indicando claramente que a acumulação depende da concentração ambiental. A acumulação revelou-se específica de cada tecido. O padrão da acumulação em L. aurata foi rim > fígado > músculo > cérebro > guelras > sangue e em D. labrax foi fígado > rim > músculo > cérebro ≈ guelras > sangue. Relativamente à acumulação de OHg, verificou-se que D. labrax exibiu concentrações mais elevadas que L. aurata. Todos os tecidos foram capazes de reflectir diferenças entre R e L2. Os níveis de O-Hg no fígado, músculo e nos conteúdos intestinais foram diferentes entre espécies, sendo mais elevados para D. labrax. As guelras e o intestino foram os tecidos onde se obtiveram os valores mais baixos de O-Hg e observaram-se valores idênticos para as duas espécies. Com excepção das guelras, as concentrações de O-Hg variaram em função do valor observado nos conteúdos intestinais, indicando que a alimentação é a via dominante da acumulação. As concentrações de O-Hg nos conteúdos intestinais revelaram ser uma informação relevante para prever a acumulação de O-Hg nos tecidos, pois verificou-se uma razão praticamente constante entre o teor de mercúrio no fígado, no músculo e nos conteúdos intestinais. A percentagem de O-Hg no músculo e no fígado variou de acordo com o grau de contaminação ambiental e com o tipo de assimilação preferencial do elemento (alimentação vs. água), sugerindo que o fígado exerce um papel protector em relação à acumulação de mercúrio nos outros órgãos. Ambas as espécies de peixes demonstraram ser boas sentinelas da contaminação ambiental com mercúrio (T-Hg e O-Hg), sendo o cérebro e o músculo os tecidos que melhor reflectiram o grau de acumulação com o elemento. A análise conjunta dos dados de bioacumulação e de respostas ao stress oxidativo permitiram estabelecer uma relação entre as concentrações de mercúrio nas guelras, fígado, rim e cérebro e a sua toxicidade. As respostas do cérebro aos efeitos tóxicos do mercúrio revelaram ser específicas de cada espécie. Enquanto que para o cérebro de L. aurata se verificou um decréscimo de todos os parâmetros antioxidantes estudados nos locais contaminados, sem haver evidência de qualquer mecanismo compensatório, no D. labrax observaram-se respostas ambivalentes, que indicam por um lado a activação de mecanismos adaptativos e, por outro, o decréscimo das respostas antioxidantes, ou seja, sinais de toxicidade. Embora em ambas as espécies de peixe fosse evidente uma condição pró-oxidante, o cérebro parece possuir mecanismos compensatórios eficientes, uma vez que não se verificou peroxidação lipídica. As respostas antioxidantes do cérebro de D. labrax foram comparadas em diferentes períodos do ano - quente vs. frio. O período quente mostrou ser mais crítico, uma vez que no período frio não se verificaram diferenças nas respostas entre locais, ou seja, a capacidade antioxidante do cérebro parece ser influenciada pelos factores ambientais. As guelras revelaram susceptibilidade à contaminação por mercúrio, uma vez que se verificou uma tendência para o decréscimo da actividade de CAT em L2 e ausência de indução em L1. O fígado e o rim demonstraram mecanismos adaptativos face ao grau de contaminação moderada (L1), evidenciados pelo aumento de CAT. O rim também demonstrou adaptabilidade face ao grau elevado de contaminação (L2), uma vez que se verificou um aumento GST. Embora o grau de susceptibilidade tenha sido diferente entre os órgãos, não se verificou peroxidação lipídica em nenhum. A determinação do conteúdo em MTs em D. labrax e em L. aurata revelou que este parâmetro depende não só da espécie, mas também do tecido em causa. Assim, em D. labrax foi observado um decréscimo de MTs no cérebro, bem como a incapacidade de síntese de MTs no sangue, guelras, fígado, rim e músculo. Em L. aurata observou-se um aumento do conteúdo em MTs no fígado e no músculo. Estes resultados indicam que a aplicabilidade das MTs como biomarcador de exposição ao mercúrio parece ser incerta, revelando limitações na capacidade de reflectir os níveis de exposição ao metal e por consequência o grau de acumulação. Este trabalho comprova a necessidade de se integrarem estudos de bioacumulação com biomarcadores de efeitos, de modo a reduzir os riscos de interpretações erróneas, uma vez que as respostas nem sempre ocorrem para os níveis mais altos de contaminação ambiental com mercúrio.

Contaminated soil exposure assessment in Portugal and in the EU

Este estudo baseou-se na análise dos mecanismos de transferência de elementos potencialmente tóxicos (PTE’s) entre o solo, a solução do solo e as plantas como forma de realizar uma avaliação mais eficaz do risco em áreas agrícolas. Foram aplicados conceitos recentemente desenvolvidos para a avaliação da reactividade biogeoquímica de contaminantes no solo e da sua partição sólido:solução recorrendo-se a modelos empíricos (tipo Freundlich). Estes modelos permitiram analisar a transferência de PTE’s ao longo da cadeia alimentar e avaliar o impacto da contaminação do solo na qualidade da alimentação animal (forragens) e Humana (vegetais e carne) em Portugal. Os modelos empíricos de transferência solo-planta de PTE’s foram utilizadas para obter limites críticos para estes elementos em solos agrícolas em Portugal, a partir dos seus limites legais nos alimentos para animais e teores máximos nos géneros alimentícios. Simultaneamente, modelos de exposição Humana a contaminantes do solo, desenvolvidos noutros países da UE foram analisados e foi proposto um modelo de exposição para Portugal. Este trabalho é uma contribuição para o desenvolvimento de critérios de qualidade de solos para áreas agrícolas em Portugal, tendo em vista a protecção da saúde animal e Humana. Contribuiu também para o desenvolvimento de uma estratégia de harmonização de políticas de protecção do solo (nomeadamente no que diz respeito aos problemas de contaminação) na União Europeia.

Estudo epidemiológico sobre a saúde de estudantes universitários

Os factores de risco nos adultos jovens são fortes preditores da incidência de doença cardiovascular e mortalidade na idade mais avançada. Em Portugal, desconhecem-se estudos que avaliem os factores de risco para as doenças crónicas, em jovens adultos, na transição do ensino secundário para o universitário. Este estudo pretendeu contribuir para a promoção do conhecimento dos determinantes sócioculturais e ambientais no diagnóstico e detecção de factores de risco para as doenças crónicas, nomeadamente as doenças cardiovasculares, em estudantes universitários. Teve como objectivo principal a investigação do efeito da vida académica nos factores de risco modificáveis, estilos de vida e determinantes da saúde. Teve como objectivos específicos identificar a(s) prevalência(s) dos factores de risco cardiovascular numa população universitária, a identificação dos intervalos de referência para a homocisteína total no soro de adultos jovens portugueses, a determinação do perfil lípidico, comportamentos de saúde e dieta alimentar de tipo mediterrânico entre os estudantes universitários de acordo com o género e a área científica de frequência e a avaliação longitudinal do impacto da exposição à vida académica no estado de saúde dos estudantes universitários Participaram no estudo 781 estudantes sendo a média de idades de 20,6. Os factores de risco estudados para as doenças crónicas, foram o hábito tabágico, a pressão arterial, o índice de massa corporal, a composição do sangue (lípidos, homocisteina e glicose), a alimentação e a actividade física. O estudo mostra que a prevalência de: sedentarismo é significativamente mais elevada nos rapazes (p<0,001); dislipidemia e a hipertrigliceridemia é significativamente mais elevada nas raparigas. Mais de um quarto dos estudantes tem colesterol elevado sendo a hipercolesterolemia significativamente mais elevada nas raparigas (p<0,001); a hipertensão verificou-se em ambos os sexos (6,0%) mas foi significativamente mais elevada nos rapazes (p=0,001). O estudo identificou o intervalo de referência para a homocisteína em adultos jovens portugueses independentemente do sexo (6,2 a 11,6 μmol/) sendo que, acima de 11,6 μmol/l é condição para vigilância médica em populações jovens adultas. Quando se estudou a exposição à vida académica comparada com aqueles que acabaram de entrar na universidade, verificou-se uma associação significativa no que respeita às concentrações de lípidos no sangue, à pressão arterial sistólica e à actividade física, tendo sido as raparigas aquelas que mais se afastavam dos padrões saudáveis (p<0,001). No que respeita à adesão à dieta mediterranica, não foram encontradas associações entre este tipo de alimentação e os vários factores de risco independentemente do género. Os resultados forneceram, evidências empíricas acerca da importância da detecção dos principais factores de risco na idade adulta (jovem) na prevenção das doenças cardiovasculares e vieram corroborar as orientações do Plano de Desenvolvimento Estratégico do Instituto Nacional de Saúde Português para as doenças crónicas, nomeadamente o estabelecimento de valores de referência nacionais para análises biológicas e as orientações do Plano de Acção Estratégica Global para a Prevenção e Controle das Doenças Não-Transmissíveis-2008/2013 da Organização Mundial de Saúde.

Gene expression in understanding mechanisms of toxicity in amphibians

De uma forma geral os anfíbios são conhecidos como organismos que apresentam uma grande sensibilidade a vários tipos de contaminantes. Contudo existem casos, como o de Pelophylax perezi (rã-verde), em que estes organismos habitam áreas extremamente contaminadas. Este facto verifica-se na mina de urânio desactivada, da Cunha Baixa (Viseu, centro de Portugal), em que uma população destas rãs habita na lagoa de efluente ácido mineiro (M). Estudos ecotoxicológicos anteriores com estes organismos revelaram apenas efeitos de toxicidade ténues levantando algumas questões. Com o objectivo de elucidar quais os mecanismos que permitem a P. perezi permanecer neste local, sem sofrer aparentemente efeitos perniciosos, encetamos este trabalho. Numa primeira abordagem, avaliámos o sistema de defesa antioxidante de rãs adultas, bem como o conteúdo em metais de alguns órgãos. Desta forma verificámos alterações enzimáticas, principalmente no pulmão e acumulação de metais nos vários órgãos. Posteriormente foi realizado um estudo de expressão genética diferencial, também em organismos adultos e desta feita foram sugeridos alguns mecanismos de protecção basal que estarão por detrás da capacidade de suportar este ambiente extremamente contaminado. Numa etapa seguinte abordámos os efeitos em fases larvares, fazendo inicialmente uma exposição in situ, a vários efluentes, caracteristicamente diferentes, do complexo mineiro. Avaliámos o crescimento, a acumulação de metais e a actividade de alguns biomarcadores de stress oxidativo. Como resultado pudemos constatar que nas fases larvares para além de alguma mortalidade existe acumulação de metais bem como algumas alterações a nível de biomarcadores de stress oxidativo. Numa última abordagem realizamos uma exposição crónica dos girinos a efluente da mina com diversos níveis de pH para distinguir os efeitos da toxicidade do pH, dos efeitos da toxicidade pelo conteúdo de metais. Para tal avaliámos novamente biomarcadores de stress oxidativo, crescimento, acumulação de metais e efectuamos ainda um estudo de expressão genética diferencial. Esta última aproximação permitiu verificar que a toxicidade do efluente resulta primariamente do pH ácido, assumindo a contaminação por metais um papel secundário. Contudo o crescimento dos girinos de P. perezi apresenta-se estimulado por pHs mais baixos. São apontados ainda alguns mecanismos, em girinos, para lidar com o stress causado pela contaminação por metais.De uma forma geral pôde-se constatar que quer anfíbios adultos quer girinos expostos ao efluente apresentam valores altos de metais acumulados. Os biomarcadores de stress oxidativo na sua maioria não apresentaram respostas coerentes mediante as várias exposições. Este trabalho apresentase como um contributo importante para a ecotoxicologia de anfíbios, aumentando os níveis actuais de conhecimento sobre o efeito de contaminação proveniente de efluentes mineiros, sugerindo ainda mecanismos de resistência quer em larvas, quer para adultos.

Diversity and biology of polychaeta of Diopatra Genus

Os anelídeos poliquetas são elementos importantes em ambientes estuarinos e costeiros, pela sua elevada biodiversidade e abundância e pelo papel que têm nas cadeias tróficas. Algumas espécies são intensivamente exploradas para serem utilizadas como isco na pesca desportiva e profissional, como é o caso de Diopatra neapolitana. Apesar da importância económica, existem poucos estudos sobre a sua biologia e ecologia. No decorrer deste estudo foram identificadas duas outras espécies do género Diopatra em Portugal: D. marocensis, inicialmente descrita para a costa de Marrocos e cuja distribuição actual se sabe estender-se a toda a costa Portuguesa e Norte de Espanha e, D. micrura, espécie nova para a ciência. O presente estudo tem como objectivos principais estudar a diversidade e reprodução do género Diopatra, bem como a capacidade de regeneração da espécie D. neapolitana. Este trabalho aborda a distribuição espacial de D. marocensis ao longo da costa Portuguesa e descreve a espécie D. micrura, uma nova espécie do género Diopatra Audouin and Milne Edwards, 1833. As três espécies coabitam em águas transicionais, onde as espécies D. micrura e D. marocensis facilmente se confundem com juvenis de D. neapolitana. Foi realizada uma comparação morfológica e genética entre as três espécies. A espécie D. neapolitana coexiste em algumas áreas da Ria de Aveiro com a D. marocensis. Apesar destas duas espécies apresentarem padrões reprodutivos muito diferentes, Maio a Agosto é o período principal para a reprodução de ambas as espécies. D. neapolitana apresenta um desenvolvimento larvar planctónico, e os óocitos presentes na cavidade celómica são esverdeados e apresentam um diâmetro de 40-240 μm (média = 164.39±40.79 μm) e as fêmeas contêm no celoma milhares de óocitos. Contrariamente, a espécie D. marocensis reproduz-se por desenvolvimento directo no interior do tubo parental. Os óocitos observados no celoma são amarelos com um diâmetro entre 180 e 740 μm (média = 497.65 ± 31.38 μm) e o seu número varia entre 44 e 624 (276.85 ± 161.54). Por seu turno, o número de ovos observados no interior dos tubos varia entre 75 e 298, com um diâmetro entre 600 e 660 μm, e o número de larvas entre 60 e 194. A proporção machos: fêmeas foi de 1:1 para a população de D. neapolitana e entre 1:2 e 1:4 para a população de D. marocensis, em que as fêmeas dominam a população durante todo o ano. O estudo da capacidade de regeneração da espécie D. neapolitana, avaliada a partir de experiências de laboratório, revelou que esta espécie é capaz de sobreviver à perda de alguns setígeros. Durante a captura de D. neapolitana para vender como isco são normalmente cortados mais de 20 setígeros e de acordo com os nossos resultados a extremidade posterior que fica no tubo não é capaz de regenerar a extremidade anterior; a espécie consegue no entanto recuperar de ataques por predadores.

Synchronisation in high-performance integrated circuits

A distribui ção de um sinal relógio, com elevada precisão espacial (baixo skew) e temporal (baixo jitter ), em sistemas sí ncronos de alta velocidade tem-se revelado uma tarefa cada vez mais demorada e complexa devido ao escalonamento da tecnologia. Com a diminuição das dimensões dos dispositivos e a integração crescente de mais funcionalidades nos Circuitos Integrados (CIs), a precisão associada as transições do sinal de relógio tem sido cada vez mais afectada por varia ções de processo, tensão e temperatura. Esta tese aborda o problema da incerteza de rel ogio em CIs de alta velocidade, com o objetivo de determinar os limites do paradigma de desenho sí ncrono. Na prossecu ção deste objectivo principal, esta tese propõe quatro novos modelos de incerteza com âmbitos de aplicação diferentes. O primeiro modelo permite estimar a incerteza introduzida por um inversor est atico CMOS, com base em parâmetros simples e su cientemente gen éricos para que possa ser usado na previsão das limitações temporais de circuitos mais complexos, mesmo na fase inicial do projeto. O segundo modelo, permite estimar a incerteza em repetidores com liga ções RC e assim otimizar o dimensionamento da rede de distribui ção de relógio, com baixo esfor ço computacional. O terceiro modelo permite estimar a acumula ção de incerteza em cascatas de repetidores. Uma vez que este modelo tem em considera ção a correla ção entre fontes de ruí do, e especialmente util para promover t ecnicas de distribui ção de rel ogio e de alimentação que possam minimizar a acumulação de incerteza. O quarto modelo permite estimar a incerteza temporal em sistemas com m ultiplos dom ínios de sincronismo. Este modelo pode ser facilmente incorporado numa ferramenta autom atica para determinar a melhor topologia para uma determinada aplicação ou para avaliar a tolerância do sistema ao ru ído de alimentação. Finalmente, usando os modelos propostos, são discutidas as tendências da precisão de rel ogio. Conclui-se que os limites da precisão do rel ogio são, em ultima an alise, impostos por fontes de varia ção dinâmica que se preveem crescentes na actual l ogica de escalonamento dos dispositivos. Assim sendo, esta tese defende a procura de solu ções em outros ní veis de abstração, que não apenas o ní vel f sico, que possam contribuir para o aumento de desempenho dos CIs e que tenham um menor impacto nos pressupostos do paradigma de desenho sí ncrono.

Microbiological quality of bivalves: relevance to food safety

Os moluscos bivalves constituem um recurso haliêutico de elevada importância na economia (inter)nacional pelas suas características organolépticas, valor nutritivo e relevância na gastronomia tradicional. Não obstante, representam um produto alimentar de elevado risco para a saúde pública. A contaminação microbiológica (autóctone e antropogénica), sendo crónica nos bancos de bivalves das zonas estuarino-lagunares, constitui uma das principais preocupações associadas à segurança alimentar. Aquando da filtração inerente aos processos de respiração e alimentação, os bivalves bioacumulam passivamente microrganismos incluindo os patogénicos. A sua colocação no mercado impõe pois, prévia salubrização para níveis microbiológicos compatíveis com a legislação em vigor, salvaguardando a saúde pública. Apesar da monitorização das áreas de apanha e produção, das medidas de prevenção e da depuração, a ocorrência de surtos associados ao consumo de bivalves tem aumentado. Tal deve-se à insuficiente monitorização da contaminação microbiológica dos bivalves, contribuindo para uma gestão ineficaz do produto e consequente sub-valorização. O presente trabalho pretendeu caracterizar o estado de desenvolvimento do sector de exploração de bivalves em Portugal do ponto de vista da segurança alimentar, e analisar os aspectos cruciais da monitorização e da depuração do produto apresentando alternativas abrangentes e aplicáveis ao sector. Assim, desenvolveu-se uma metodologia de base molecular passível de adaptação à monitorização dos bivalves das zonas conquícolas, como alternativa ao método de referência vigente do Número Mais Provável que é baseado apenas na quantificação de Escherichia coli. O mexilhão (Mytilus edulis) da Ria de Aveiro, bivalve de interesse comercial a nível (inter)nacional serviu de modelo para a comparação de protocolos de extração de DNA. Esta metodologia foi desenvolvida de modo a que os métodos de extração de DNA sejam passíveis de aplicação a outras matrizes biológicas ou ambientais. Para além da detecção e quantificação directa de bactérias patogénicas, esta metodologia poderá ser aplicada à monitorização da transferência vertical microbiana nos bancos de bivalves bem como à caracterização da dinâmica espacio-temporal das populações microbianas no ambiente e à monitorização dos processos de depuração. Foi ainda abordado o potencial da aplicação de bacteriófagos ou de enzimas líticas para a optimização dos processos de purificação. O trabalho realizado e as perspectivas futuras propostas pretendem contribuir para a dinamização e requalificação do sector de exploração de bivalves através da melhoria do nível de segurança alimentar dos moluscos bivalves comercializados para alimentação humana, valorizando este recurso.

Toxicity assessment of essential metals in aquatic detritivores

Os contaminantes provenientes quer de fontes naturais quer como consequência da atividade humana, têm contribuído para a degradação dos ecossistemas aquáticos. Entre estes encontram-se os metais que podem, ou não ser essenciais mediante o papel que desempenham no metabolismo dos organismos. O cobre e o zinco são exemplos de metais essenciais, contudo quando atingem concentrações elevadas podem tornar-se tóxicos. Os detritívoros aquáticos desempenham um papel fundamental na decomposição da matéria orgânica, alimentando-se de carcaças e partes de plantas que caem nos cursos de água. Assim, estes organismos permitem que o ciclo dos nutrientes se complete e servem como elo de ligação entre todos os grupos funcionais do ecossistema mantendo o seu equilíbrio estrutural e funcional. Sendo a matéria orgânica a sua principal fonte de energia estão sujeitos à contaminação existente no meio, pelo que é de todo o interesse proceder-se à avaliação dos efeitos da toxicidade de metais nestes organismos. Uma vez que as diferenças comportamentais consequentes desta exposição podem originar variações na densidade e diversidade, o que se refletirá a nível das comunidades, originando alterações na estrutura e funcionamento do ecossistema. Tendo em vista a avaliação dos efeitos da contaminação por metais em detritívoros, o principal objetivo deste trabalho foi comparar a sensibilidade a metais essenciais de dois detritivoros aquáticos, o camarão Atyaephyra desmarestii e o anfípode Echinogammarus meridionalis. Para tal, avaliaram-se os efeitos do cobre e do zinco a diferentes níveis de organização biológica. Primeiro, foram determinadas as preferências alimentares de A. desmarestii e E. meridionalis considerando tanto a área das folhas como a contaminação por metais das folhas. Em seguida, avaliaram-se os efeitos do cobre e do zinco na sobrevivência e inibição alimentar de ambas as espécies. Finalmente, avaliaram-se os efeitos destes mesmos metais a nível bioquímico utilizando uma bateria de biomarcadores que incluiu enzimas de stresse oxidativo, o sistema de defesa antioxidante e as colinesterases. Ambos os organismos não mostraram preferência em relação a folhas de área diferente. A presença de uma maior ou menor concentração de metais essenciais no alimento não teve qualquer influência na sua escolha pelo alimento (contaminado ou não). Os ensaios agudos de cobre e zinco mostraram que o cobre é mais tóxico para ambas as espécies do que o zinco. O camarão demonstrou ser mais sensível ao zinco que o anfípode, tendo este sido mais sensível ao cobre ( CL50 do cobre para A. desmarestii foi de 0,128 mg.l-1 e o de E. meridionalis foi de 0,050 mg.l-1; os valores correspondentes para o zinco foram 7,951 e 11,860 mg.l-1, respectivamente. Em relação aos efeitos subletais, o cobre teve efeitos notórios na taxa de alimentação de E. meridionalis, mas não afectou a de A. desmarestii. No que diz respeito à exposição ao zinco, ambas as espécies parecem apresentar tendência para inibir a alimentação. A caracterização das colinesterases revelou que a principal forma presente em ambas as espécies é a acetilcolinesterase, a qual que não foi afetada pela presença dos metais, no caso do camarão, mas parece ser inibida pelo zinco no caso do anfípode. O cobre inibiu o sistema de defesa enzimático de ambas as espécies, sem sinais de danos lipídicos. Para além disto, inibiu uma das enzimas antioxidantes (GPx) do anfípode. Apesar de não ter ocorrido dano lipídico após exposição ao cobre, observou-se um ligeiro aumento dos níveis das LPO, o que pode ser indicativo de uma potencial existência de dano oxidativo, como resultado da falha do sistema de defesa antioxidante. Por outro lado, o zinco induziu o sistema de defesa em E. meriodionalis prevenindo o dano lipídico. Enquanto em A. desmarestii o sistema enzimático antioxidante não respondeu, tendo ocorrido dano celular oxidativo considerando-se, assim, que o sistema de defesa antioxidante do camarão pode ser comprometido por exposição a metais. Ainda que os danos celulares oxidativos tivessem ocorrido a baixas concentrações de zinco. A exposição a este metal também induziu a actividade da GST de E. meriodionalis. Considerando que a taxa de alimentação foi severamente reduzida no caso deste organismo, o zinco parece ser o metal cuja concentração no ecossistema requer maior atenção. Integrando as respostas dos biomarcadores parece também evidente que A. desmarestii responde de uma maneira geral a maiores concentrações dos dois metais, enquanto a resposta de E. meridionalis ocorre a concentrações inferiores. Pelo que, E. meridionalis parece ser mais sensível ao nível bioquímico. Neste trabalho, os dois detritívoros, com ligeiras diferenças no modo como utilizam a matéria orgânica disponível, apresentam diferenças na sensibilidade aos metais essenciais a vários níveis de organização biológica, sendo o zinco o metal que poderá causar maior preocupação a nível bioquímico, enquanto o cobre parece ser o mais tóxico ao nível do organismo, causando mortalidade a concentrações mais baixas.