193 resultados para Reação em cadeia da polimerase - Teses
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Resumo:
A tuberculose (TB) uma doena infecto-contagiosa causada pelo complexo Mycobacteruim tuberculosis. A melhor forma de preveno se baseia na deteco e na cura dos casos. Um diagnstico acurado de TB seria essencial para a identificao e tratamento dos pacientes. O diagnstico laboratorial recomendado baseia-se na baciloscopia e na cultura de material clnico. Novos mtodos, os quais empregam tcnica gentica baseada na amplificao e deteco do DNA bacteriano ou do RNA, visam melhorar a velocidade, sensibilidade e especificidade da deteco da bactria. O principal teste desse grupo o mtodo da reação da cadeia da polimerase (PCR). Entretanto, h discordncia na literatura quanto as dados de validade da PCR aplicada ao diagnstico de tuberculose. O presente estudo realizou uma meta-anlise sobre o teste da PCR no diagnstico de TB. O mtodo estatstico usado estimou efeitos do teste entre os estudos primrios. A sensibilidade e a especificidade foram calculadas de acordo com as suas definies: Sensibilidade = TPR, taxa de verdadeiros positivos e Especificidade = 1 FPR, onde FPR = taxa de falsos positivos. Calculamos os logit de TPR e FPR a soma e suas diferenas e fizemos uma back transformao aos eixos de TPR vs. FPR com posterior construo da curva SROC (Moses & Shapiro, 1993). A curva SROC representa uma estimativa da medida de acurcia do teste ndice a qual ajustada pelo ponto de corte tanto quanto pela interdependncia dos valores de sensibilidade e especificidade obtidos de cada estudo. Foram localizados 1375 artigos atravs de busca base de dados do Medline no perodo de 1988 a 2000. Considerando os critrios de elegibilidade, foram aceitos 111 artigos. A caracterizao dos estudos, a validade e a sua aplicabilidade foram apreciadas. A medida combinada de todos os estudos foi de 0,86 para a sensibilidade e 0,95 para a especificidade usando-se o mtodo de efeitos aleatrios. A PCR in-house apresentou melhor performance do que a Amplicor. O AMTD obteve os maiores valores de acurcia possivelmente devido o rRNA apresentar mltiplas cpias por clula. Diante das evidncias, a PCR se constitui num teste complementar para tuberculose devendo ter critrios prprios para a sua utilizao. No entanto, este teste no contempla os atributos requeridos para a substituio da baciloscopia na rotina diagnstica.
Resumo:
A Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) um patotipo emergente e heterogneo que causa a diarria aguda ou persistente em indivduos de diferentes faixas etrias e em pacientes imunocomprometidos. Alm disso, EAEC um dos principais agentes etiolgicos da diarria dos viajantes. O padro de aderncia agregativa de EAEC est associado ao plasmdeo de aderncia agregativa (pAA). Genes presentes no plasmdeo e no cromossomo codificam protenas envolvidas na secreo extracelular de fatores de virulncia na superfcie ou diretamente na clula hospedeira. A capacidade de produo de muco e biofilme, elaborao de toxinas, aderncia e induo de inflamao intensa na mucosa intestinal so importantes caractersticas da patogenicidade de EAEC. Nesse estudo, determinamos o perfil genotpico de genes do sistema de secreo Tipo V (SST5) e sistema de secreo Tipo VI (SST6) em cepas de EAEC. Os genes do SST5 ocorreram com mais frequncia que os genes do SST6. A presena de pelo menos um gene do SST5 foi detectada em 79% das cepas, enquanto que os genes relacionados ao SST6 foram detectados em apenas 42% das cepas analisadas. A produo de biofilme foi observada em teste quantitativo e verificamos que 67% das cepas produziram biofilme. No teste qualitativo, o tipo de biofilme que predomina o biofilme moderado (11 cepas), seguido do biofilme forte (9 cepas) e do biofilme discreto (4 cepas). A presena ou ausncia de genes do SST5 e SST6 no parece interferir com a capacidade de produo de biofilme, nem com o tipo de biofilme formado. Em ensaios de citotoxicidade, apenas 25% das cepas EAEC (sobrenadante) causaram reduo significativa na viabilidade de clulas T84 avaliada pelo teste de reduo com MTT. Nossos resultados mostram que as cepas EAEC isoladas de crianas com diarria aguda ou de grupo controle so invasoras para clulas T84. Ao compararmos a capacidade invasora das cepas clinicas e controle, observamos que a mdia do ndice de internalizao obtido nas 15 cepas do grupo clinico foi de 5,7% 1,7 e para as 9 cepas do grupo controle foi de 2.4 % 0,7; entretanto essa diferena observada no foi estatisticamente significativa. No foi possvel correlacionar o perfil genotpico dos genes do SST5 e SST6 com o perfil fenotpico analisado (formao de biofilme, citotoxicidade e invaso).O que pode ser atribudo a heterogeneidade genotpica e fenotpica, uma caracterstica relevante de cepas EAEC.
Resumo:
Streptococcus pneumoniae um importante agente etiolgico de infeces invasivas e no invasivas, incluindo meningite, pneumonia e otite mdia. A cpsula polissacardica o principal fator de virulncia desse microrganismo, sendo tambm considerada um importante marcador em estudos epidemiolgicos. Dentre os mais de 90 tipos capsulares conhecidos, o sorotipo 14 se destaca pela prevalncia elevada em vrias regies, inclusive no Brasil. A avaliao da diversidade gentica desse microrganismo tambm inclui a aplicao de mtodos moleculares, como PFGE e MLST. Entretanto, essas metodologias so relativamente onerosas, consomem muito tempo e os resultados obtidos com a tcnica de PFGE so de difcil comparao entre diferentes laboratrios. A tcnica de anlise do polimorfismo numrico de segmentos repetitivos em mltiplos loci [MLVA, do ingls Multiple Loci VTNR (Variable-Number Tandem Repeat) Analysis] se apresenta como uma alternativa, embora ainda necessite de padronizao e avaliao mais ampla para a espcie em questo. No presente estudo, 60 amostras de Streptococcus pneumoniae pertencentes ao sorotipo 14, isoladas de diversas fontes clnicas, em diferentes locais e perodos de tempo, foram caracterizadas pelas tcnicas de MLVA (baseada na anlise de 18 loci distintos), MLST, PFGE e tipagem do gene pspA. O gene pspA2 predominou entre as amostras analisadas, seguido pelo gene pspA1. Os tipos de MLVA, perfis de PFGE, e STs encontrados apresentaram resultados, em geral, concordantes, indicando o elevado poder discriminatrio da verso da tcnica de MLVA empregada. Cinco complexos clonais (CC) de MLVA e cinco singletons puderam ser definidos. O CC de MLVA denominado de L7 foi o predominante, compreendendo 36,7% da amostragem estudada. O CC L7 mostrou-se relacionado com genes pspA da famlia 2, com o CC1 de MLST, com o CC Pen14-H de PFGE, e com a no susceptibilidade penicilina, Entre os complexos clonais de MLST, o CC1 foi o prevalente e incluiu predominantemente o ST156, pertencente ao clone internacional Spain9V-3. O CC L3 e o singleton L17 de MLVA apresentaram-se associados ao CC de PFGE Eri14-A, a famlia 1 de PspA e ao CC2 de MLST, que por sua vez tambm estava relacionado com o clone internacional England14-9. O CC L15 de MLVA esteve associado ao CC de PFGE Pen14-A, ao gene pspA2, aos CC3 e CC4 de MLST e ao clone internacional do PMEN Tennessee14-18. A tcnica de MLVA revelou-se significativamente mais discriminatria que as tcnicas de PFGE e MLST, conforme exemplificado pela deteco de 21 perfis de MLVA, 13 perfis de PFGE e cinco STs, entre as 22 amostras pertencentes ao CC de MLVA L7. Uma verso de MLVA, compreendendo um painel com os oito loci de maior poder discriminatrio, pde ser proposta a partir da anlise dos resultados obtidos. Estes aspectos, aliados ao menor tempo e custo de execuo, indicam que a tcnica de MLVA constitui uma alternativa importante e satisfatria para uso em estudos sobre a diversidade gentica de S. pneumoniae.
Resumo:
Por serem organismos filtradores, os mexilhes devem ser extrados para consumo somente de guas com padres microbiolgicos regulamentados pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente, uma vez que intoxicaes alimentares de origem bacteriana so as consequncias mais comuns relacionadas ao consumo destes moluscos. Aps a retirada dos costes, estes organismos passam por processos de fervura, lavagem, acondicionamento em sacos plsticos e transporte at a chegada ao mercado onde so comercializados; etapas estas, realizadas sem cuidados asspticos. Objetivando avaliar a qualidade microbiolgica de mexilhes Perna perna coletados na praia de Itaipu, Niteri, RJ; aps a sua fervura; e comercializados no Mercado So Pedro, foram realizadas contagens de coliformes totais e termotolerantes e pesquisa de Escherichia coli, Salmonella spp. e Vibrio spp. por metodologia convencional e molecular em amostras obtidas destes locais. Pelo teste de disco-difuso foi observado o perfil de resistncia das cepas isoladas. Do total de amostras analisadas (27) apenas 3 dos mexilhes que sofreram processo de aferventao, 1 do comercializado e 3 do in natura, se encontravam dentro dos padres aceitveis pela legislao. No houve diferena significativa entre as contagens de coliformes termotolerantes dos diferentes mexilhes analisados, mas sim entre os perodos seco e chuvoso. Somente uma das nove coletas de gua mostrou-se prpria para o cultivo de mexilhes (at 14 CF/mL). Foram isoladas e caracterizadas fisiolgicamente, 77 estirpes da espcie E. coli, sendo confirmadas molecularmente por PCR os sorotipos EPEC, STEC e EAEC; 4 cepas Salmonella spp. sendo apenas uma confirmada por PCR; e das 57 cepas caracterizadas como Vibrio spp., 51 foram confirmadas por PCR, sendo 46 Vibrio spp., 2 V. cholerae, 1 V. vulnificus, 1 V. parahaemolyticus e 1 V. mimicus. Entre as estirpes de E. coli, 13% apresentaram multirresistncia e 15,6% apresentaram resistncia mltipla. A estirpe de Salmonella spp. se mostrou sensvel a todos os antimicrobiados testados. Das estirpes de Vibrio spp. testadas, 68,6% apresentaram multirresistncia e 72,5% apresentaram resistncia mltipla. A partir da pesquisa de genes direto do caldo de enriquecimento foi possvel detectar todos os genes pesquisados, com exceo para os sorotipos de Salmonella e V. cholerae. Baseado nos resultados do presente trabalho pode-se inferir que os mexilhes, amplamente comercializados no municpio de Itaip, podem se constituir em risco para a sade pblica dos consumidores no Rio de Janeiro, necessitando dos rgos competentes uma eficiente fiscalizao nos pontos de venda e cultivo destes moluscos.
Resumo:
A doena de Parkinson (DP) a segunda doena neurodegenerativa mais frequente no mundo, afetando 1-2% da populao acima de 65 anos, caracterizada clinicamente por tremor em repouso, bradicinesia, instabilidade postural e rigidez muscular. Essas manifestaes surgem devido degenerao neuronal progressiva e presena de incluses proteicas ricas em α-sinuclena. A DP decorrente da interao entre fatores ambientais e genticos, e entre os fatores genticos, variantes exnicas de transmisso dominante nos genes LRRK2 (leucine-rich repeat kinase 2), VPS35 (vacuolar protein sorting 35) e EIF4G1 (eukaryotic translation initiation factor 4-gamma 1) tm sido associadas etiologia da doena. Entretanto, estudos sobre o efeito dessas variantes na populao brasileira so raros ou inexistentes. Por essa razo, neste trabalho rastreamos mutaes nos genes VPS35 (p.D620N; p.R524W), EIF4G1 (p.R1205H; p.A502V) e LRRK2 (p.G2019S) em uma amostra de 582 pacientes brasileiros com DP no aparentados e 329 indivduos controles saudveis. Alm disso, conduzimos o primeiro estudo caso-controle para anlise de variantes exnicas raras (p.Q1111H, p.T1410M, p.M1646T, p.S1761R, p.Y2189C) e comuns (p.N551K, p.R1398H, p.K1423K) no gene LRRK2 em um subgrupo de 329 pacientes brasileiros com DP, no aparentados, naturais da regio sudeste. Esse subgrupo foi analisado e comparado com 222 indivduos controles saudveis a fim de verificar associaes dessas variantes e a DP. Em relao s mutaes dos genes VPS35 e EIF4G1, no foram encontradas alteraes nos pacientes com DP. A mutao p.G2019S no gene LRRK2 foi encontrada em 15 probandos (2,6%), dos quais 9 so do sexo feminino (64,3%). O tremor em repouso foi observado em 47,36% dos pacientes com a mutao p.G2019S como primeiro sintoma motor. As anlises das variantes raras no gene LRRK2 no revelaram qualquer associao estatisticamente significante. Entre as variantes comuns, a p.K1423K mostrou evidncia de associao de risco com a DP (p<0,05) na estratificao contendo o grupo de indivduos com histria familiar da doena e para as variantes p.N551K e p.R1398H no foram observadas associaes. A anlise do hapltipo p.N551K-p.R1398H-p.K1423K revelou associao de proteo na amostra sudeste e na estratificao Rio de Janeiro (p<0,05). Esse hapltipo no est em desequilbrio de ligao na amostra de 222 indivduos controles brasileiros analisados (r2≤45). Os resultados obtidos neste estudo representam contribuies valiosas ao entendimento da relao entre as variantes genticas estudadas e o risco de desenvolvimento da doena de Parkinson, principalmente no que se refere aos endofentipos associados.
Resumo:
Uma vez que <i>C. pseudotuberculosis</i> o agente etiolgico de processos infecciosos em animais caprinos e ovinos e que tambm pode ser isolado de processos infecciosos em seres humanos as investigaes direcionadas para a espcie em questo so necessrias, visto que a escassez de dados epidemiolgicos e de conhecimento relativo ao comportamento do microrganismo em hospedeiros animais e humanos em nosso pas dificulta o diagnstico laboratorial da espcie, semelhana do observado com outra espcie de transmisso zoontica, o <i>C. ulcerans</i>. Uma preocupao adicional o fato da espcie em questo tambm ser capaz de albergar bacterifagos codificadores da toxina diftrica, representando uma ameaa circulao dos bacterifagos. Assim, o presente estudo tem como objetivo geral analisar as caractersticas fenotpicas e genotpicas de amostras de <i>C. pseudotuberculosis</i>. Neste sentido, foram propostos os seguintes objetivos: Avaliar as caractersticas bioqumicas das amostras atravs de testes bioqumicos convencionais; avaliar as caractersticas bioqumicas das amostras utilizando o sistema semi-automatizado API Coryne; diferenciar amostras de <i>C. pseudotuberculosis</i> de </i>C. ulcerans</i> utilizando a tcnica de PCR multiplex; pesquisar a presena de gene tox. Os resultados demonstraram que amostras de <i>C. diphtheriae</i>, <i>C. ulcerans</i> e <i>C. pseudotuberculosis</i> podem ser caracterizadas por mtodos bioqumicos convencionais e por taxonomia numrica (API Coryne System). <i>C. ulcerans</i> e <i>C. pseudotuberculosis</i>, com potencial de circulao zoontica, da mesma forma que <i>C. diphtheriae</i> so capazes de albergar o gene da toxina diftrica. A reação m-PCR foi capaz de discernir as amostras de <i>C. diphtheriae</i>, <i>C. ulcerans</i> e <i>C. pseudotuberculosis</i> e ainda definir o potencial das amostras em produzir a toxina diftrica. Os dados enfatizam a necessidade da tcnica multiplex PCR para o diagnostico e para o controle de espcies associadas a quadros de difteria em populaes humana.
Resumo:
A mortalidade na Fibrose Cstica (FC) decorrente de infeces pulmonares causadas comumente por: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e espcies do Complexo Burkholderia cepacia (CBc). Mais recentemente, tem sido observada a emergncia de BGN-NF raros, como Achromobacter xylosoxidans, porm, sua prevalncia, potencial de transmisso e significado clnico so desconhecidos. O objetivo deste trabalho foi verificar a ocorrncia de colonizao crnica por A. xylosoxidans e avaliar a possibilidade de transmisso cruzada entre os pacientes acompanhados em dois centros de referncia na cidade do Rio de Janeiro. Foram includos 39 pacientes com FC, com pelo menos uma cultura positiva para o gnero Achromobacter spp., em um total de 897 analisadas, do perodo de janeiro de 2003 a dezembro de 2008. A frequncia de isolamento de Achromobacter spp. nas culturas analisadas foi de 14,5% (130 em 897 culturas). A maioria (n=122; 93,8%) foi identificada como A. xylosoxidans por testes fenotpicos e pelo sequenciamento do gene rrs que codifica o 16S rRNA. A anlise do polimorfismo gentico dos isolados de A. xylosoxidans pela tcnica de PFGE, mostrou 22 grupos clonais. Destes, sete foram compartilhados entre pacientes distintos sugerindo transmisso cruzada. Apenas o clone G foi amplamente disseminado entre 56,4% dos pacientes estudados, sugerindo a possibilidade de um surto. Os 15 clones restantes constituram-se em clones exclusivos por pacientes. Os cinco pacientes colonizados cronicamente por A. xylosoxidans mostraram a prevalncia de clones nicos. At o momento, este o primeiro caso da ocorrncia de surto por A. xylosoxidans em pacientes com Fibrose Cstica. A. xylosoxidans um microrganismo que vem se destacando em frequncia e como um possvel patgeno pulmonar nesses pacientes. Entretanto, at o momento os dados so insuficientes para avaliar a sua contribuio para a evoluo da doena pulmonar. Estudos que busquem elucidar as caractersticas de A. xylosoxidans que o permitem colonizar persistentemente o pulmo dos pacientes com FC, bem como seu potencial de virulncia, so necessrios.
Resumo:
O cncer de colo do tero o segundo carcinoma mais frequente em mulheres no mundo e um dos cnceres femininos mais incidentes no Brasil. Em leses pr-malignas e malignas do colo uterino, a protena p16INK4a, que participa do controle do ciclo celular, apresenta um aumento considervel de sua expresso, devido possivelmente presena de oncoprotenas do papilomavrus humano (HPV). Dois polimorfismos no gene p16INK4a, p16 500C>G e p16 540C>T, esto localizados na regio 3 no traduzida (3UTR), que est envolvida na regulao ps-transcricional da expresso gnica. O objetivo deste estudo foi avaliar possveis associaes entre os polimorfismos p16 500C>G e p16 540C>T e o desenvolvimento de neoplasias cervicais e/ou a severidade das leses, considerando os nveis de expresso da protena p16INK4a nas leses cervicais e certos fatores de risco clssicos para o cncer cervical, incluindo a infeco pelo HPV. Para isso, foram selecionadas 567 mulheres residentes no Rio de Janeiro, 319 com citologia cervical alterada (grupo de casos) e 248 sem histria prvia de alterao citolgica do colo uterino (grupo de comparao). Amostras de sangue perifrico de todas as participantes foram utilizadas na anlise molecular dos polimorfismos p16 500C>G e p16 540C>T atravs da tcnica de PCR-RFLP (reação em cadeia da polimerase - polimorfismo de comprimento de fragmento de restrio), usando as enzimas de restrio MspI e HaeIII, respectivamente. A expresso da protena p16INK4a em 137 bipsias de mulheres pertencentes ao grupo de casos foi avaliada por imunohistoqumica. A deteco de DNA do HPV em clulas cervicais foi feita em todas as amostras do grupo de comparao e em 194 amostras do grupo de casos pela tcnica de PCR, usando dois pares de oligonucleotdeos, MY09/MY11 e GP05+/GP06+. Os dois grupos de estudo se encontram em equilbrio de Hardy-Weinberg. As distribuies genotpicas para p16 500C>G e p16 540C>T e as distribuies de combinaes haplotpicas nos dois grupos no apresentaram diferenas significativas. A anlise do subgrupo HSIL+cncer (casos com leso intraepitelial de alto grau ou carcinoma invasivo) em comparao com o subgrupo LSIL (casos com leso intraepitelial de baixo grau) revelou diferena significativa entre as distribuies das combinaes haplotpicas (p = 0,036) e diferenas marginais entre as distribuies genotpicas para p16 500C>G (p = 0,071) e p16 540C>T (p = 0,051). O alelo p16 540G, em heterozigose ou homozigose (OR = 1,91, IC 95% = 1,08-3,37), e a combinao haplotpica p16 500C-540C 500G-540C (OR = 2,34, IC 95% = 1,202-4,555) mostraram-se associados com a severidade da leses cervicais. J o gentipo p16 540T/T (OR = 0,25, IC 95% = 0,08-0,79), e a combinao haplotpica p16 500C-540T 500C-540T (OR = 0,27, IC 95% = 0,088-0,827) exibiram papel protetor contra o desenvolvimento de leses mais severas. As anlises de interao entre os polimorfismos de p16INK4a e a expresso de p16 ou a infeco pelo HPV foram comprometidas pelo nmero reduzido de amostras analisadas. No se observou qualquer interao entre os polimorfismos estudados e os fatores de risco clssicos para o cncer de colo uterino. Nossos resultados apontam para a importncia dos polimorfismos do gene p16INK4a como marcadores de severidade da neoplasia cervical.
Resumo:
Novas metodologias de anlise molecular voltadas para estudos populacionais, clnicos, evolutivos, da biodiversidade e identificao forense foram desenvolvidas com base em marcadores microsstelites ou STR Short Tandem Repeats. Os marcadores STR, que esto amplamente espalhados nos genomas e se caracterizam por apresentar alto grau de polimorfismo, podem ser analisados a partir da amplificao por PCR (Reação em Cadeia da polimerase). A anlise foi facilitada a partir do desenvolvimento de sistemas de amplificao simultnea de mltiplos STR (multiplex STR) e com a deteco automatizada dos produtos de amplificao marcados por fluorescncia. Recentemente, o uso de marcadores STR do cromossomo X (X-STR) tornou-se significativo na prtica forense. Devido ao seu modo de transmisso, os X-STR so teis em situaes particulares de investigao de relaes de parentesco, apresentando vantagens sobre o uso de STR autossmicos. Este estudo teve como principal objetivo o desenvolvimento e validao de sistema multiplex, denominado LDD (X-STR) Decaplex, capaz de amplificar dez loci X-STR (DXS7133, DXS7424, DXS8378, DXS6807, DXS7132, DXS10074, DXS7423, DXS8377, GATA172D05 e DXS10101) para aplicao em gentica populacional, identificao e anlises forenses. Utilizando o LDD (X-STR) Decaplex 170 indivduos autodenominados afrodescendentes, no aparentados geneticamente, foram genotipados. As freqncias allicas e genotpicas no apresentaram desvio do equilbrio de Hardy-Weinberg e esto em concordncia com aquelas observadas em outros estudos. Os hapltipos observados foram nicos em indivduos de amostra masculina. A anlise de desequilbrio de ligao no revelou associao entre os marcadores X-STR. A diversidade gentica foi elevada, variando entre 0,6218 para o locus DXS7133 a 0,9327 para o locus DXS8377. Os parmetros de Probabilidade de Vinculao (PV), ndice de Vinculao (IV), Poder de Excluso (PE), Poder de Discriminao e Razo de Verossimilhana foram tambm elevados, demonstraram que os dez X-STRs so altamente polimrficos e discriminativos na populao estudada. A concentrao mnima de DNA para a amplificao dos loci do LDD (X-STR) Decaplex de 0,5 ng e verificamos que amplificao por PCR pode ser afetada quando so adicionados mais de 5 ng de DNA nas reaes. Os percentuais de bandas stutter foram elevados para os loci DXS7132 e DXS8377. No teste de reprodutibilidade observamos consistncia entre as tipagem de diferentes amostras biolgicas, incluindo as de restos mortais. No teste de mistura a proporo limite em que observamos a coexistncia de duas espcies biolgicas foi de 2,5:1ng (feminino-masculino). Os resultados evidenciaram que os loci do LDD (X-STR) Decaplex so altamente informativos, consistindo, em conjunto, uma ferramenta importante em estudos de identificao humana e de relaes de parentesco.
Resumo:
Os INDELs so polimorfismos de comprimento, gerados a partir de inseres e/ou delees de um ou mais nucleotdeos. Os marcadores INDELs, que esto amplamente distribudos pelo genoma e se caracterizam pela alta estabilidade devido baixa taxa mutacional (10-9), podem ser analisados a partir da amplificao por PCR (Reação em Cadeia da Polimerase). A facilidade de anlise e a possibilidade de construo de sistemas multiplex capazes de gerar amplicons curtos (menores que 100 pb) tornam os INDELs uma importante ferramenta para identificao humana por DNA. Para avaliar a eficincia e validar a metodologia que emprega os polimorfismos de insero/deleo na identificao humana, utilizamos o sistema Indel-plex ID, capaz de amplificar simultaneamente 38 loci INDELs biallicos de cromossomos autossomos. Diferentes amostras biolgicas (cabelo, saliva, sangue, smen e urina) foram genotipadas apresentando reprodutibilidade entre todas as tipagens. A concentrao mnima de DNA necessria para amplificao dos 38 loci INDELs foi de 0,5 ng. Artefatos do tipo split peaks foram observados em algumas amostras. Os produtos da PCR foram purificados em resina Sephadex proporcionando melhores condies de anlise, reduo de artefatos e aumento na intensidade mdia de fluorescncia dos alelos amplificados. A eficincia do sistema Indel-plex ID na amplificao de DNA degradado foi verificada durante as anlises das amostras de DNA extradas de restos mortais (ossos e dentes). Comparativamente ao sistema Identifiler, o Indel-plex ID, se mostrou mais eficiente em termos de nmero de loci genotipados e qualidade de amplificao. Nas investigaes de vnculos genticos realizadas com o sistema Indel-plex ID foi possvel corroborar resultados anteriores obtidos pela anlise de marcadores STR. Nas anlises com amostras in vivo foram obtidos valores mximos de Probabilidades de Paternidade de 99,99998%. Para casos envolvendo supostos pais falecidos, o sistema Indel-plex ID reforou resultados obtidos com o sistema Identifiler e Minifiler. A Probabilidade de Paternidade de 99,953%, obtida com o sistema Indel-plex ID, conjugada com a Probabilidade de Paternidade de 99,957%, obtida como o sistema Minifiler, possibilitou um ndice final de 99,99998%. Os resultados evidenciaram que os loci INDELs do sistema Indel-plex ID so altamente informativos, constituindo uma ferramenta importante em estudos de identificao humana e de relaes de parentesco
Resumo:
Citocinas so molculas que controlam e modulam a atividade de numerosas clulas por se ligarem a seus receptores especficos. As diferenas observadas na produo de citocinas entre indivduos podem ser, pelo menos em parte, explicadas pelos polimorfismos genticos como o polimorfismo de um nico nucleotdeo (SNP). Em 181 indivduos saudveis no-aparentados da cidade do Rio de Janeiro (regio Sudeste - Brasil), ns analisamos os polimorfismos de citocinas em genes que codificam para Fator de Necrose Tumoral-alfa (TNF-a), Fator de Crescimento Transformante-beta (TGF-b), Interleucina-10, Interleucina-6 e Interferon-gama (IFN-g). Reação em cadeia da polimerase utilizando-se iniciadores sequencia-especficos foi realizada com auxlio do kit comercial CytGen (One Lambda Inc. Canoga Park, CA, USA). Ao todo, 8 polimorfismos foram analisados: TNF-a (-308G/A); TGF-b (cdon 10C/T, cdon 25C/G); IL-10 (-1082A/G, -819T/C, -592A/C); IL-6 (-174C/G) e IFN-g (+874T/A). Os dados observados foram comparados a trs grupos de populao de diferentes regies do Brasil (So Paulo, Paran e Bahia) e a trs populaes de outros continentes (Itlia, Eslovquia e Negros Norte-Americanos). O teste qui-quadrado foi utilizado para as comparaes. Nossa anlise da populao do Rio de Janeiro mostrou que os as freqncias allicas em IL-10, IL-6 e IFN-g so desigualmente distribudos entre Brancos, Mulatos e Negros (p<0,05). A comparao com populaes de outras regies do Brasil revelou que Rio de Janeiro e Bahia possuem freqncias allicas e genotpicas de TGF-b (cdon 25) estatisticamente diferentes (p=0,004 e p=0,002, respectivamente). Ainda, a freqncia allica na populao do Rio de Janeiro significativamente diferente quando comparada populao da Itlia [IL-6 (-174), p=0,0092; e IFN-g (+874) p=0,0418)]; Eslovquia [IL-10(-1082), p=0,006; IL-6(-174), p=0,0002; e IFN-g(+874), p=0,0335]; e Afro-Americanos [IL-10(-819), p=0,0446; IL-6(-174), p<0,0001; e IFN-g(+874), p<0,0001]. Adicionalmente, observamos que a diferena na distribuio dos hapltipos em IL-10 (-1082/-819/-592) na populao do Rio de Janeiro em comparao com a da Itlia (p=0,0293) e Afro-Americanos (p=0,0025) significativa. Portanto, conclumos que os polimorfismos em IL-10, IL-6 e IFN-g esto distribudos de acordo com a etnia na populao do Rio de Janeiro. A populao do Rio de Janeiro possui freqncias de polimorfismos diferentes das populaes de Bahia, Itlia, Eslovquia e Afro-Americanos, mas semelhantes populao de So Paulo/Paran. Nossas observaes podero ser teis para futuros estudos e associao entre polimorfismos genticos de citocinas e doenas na populao do Rio de Janeiro.
Resumo:
Os norovrus (NV) so uma importante causa de hospitalizao infantil. Crianas internadas por gastroenterite por NV (GENV) so consideradas portadoras de diarreia grave. O objetivo desse estudo, realizado na cidade do Rio de Janeiro, Brasil, descrever as caractersticas clnicas e a frequncia da diarreia por NV em crianas hospitalizadas, comparando as taxas de deteco de NV em crianas vacinadas e no vacinadas contra rotavrus (Rotarix). Foram coletadas 659 amostras de fezes de igual nmero de crianas e encaminhadas para anlise pela reação em cadeia pela polimerase, precedida de transcrio reversa no perodo de janeiro de 2004 a dezembro de 2009. O percentual de amostras positivas para os NV foi de 27,3% nesse perodo. Das 180 amostras positivas para NV, 55% tiveram origem na comunidade (aqCo) e 45% foram de aquisio nosocomial (aqNo). O percentual de GENV nos dois anos anteriores (2004 e 2005) introduo da vacina Rotarix foi de 28,3%, sendo 11,3% o percentual de amostras aqCo. Nos dois anos posteriores (2008 e 2009), a GENV significou 24,4%, e as amostras aqCo foram 14,9% (p<0,05). Em 647 crianas, 494 no receberam a vacina Rotarix, enquanto 151 crianas receberam, pelo menos, uma dose. O percentual de GENV foi de 23,8% e 39,7%, respectivamente (p<0,05). Apesar do comportamento sazonal dos casos de GENV aqCo, esse fato no teve significncia estatstica. Das 180 crianas, 61,6% tinham peso ≤ p10 do NCHS, 82,2% tinham idade ≤ 5anos. As crianas com idade ≤ 2 anos foram mais acometidas nos casos de aqCo do que quelas de aqNo (p<0,05). Foram observados em 82 crianas: vmitos (73,2%), febre (54,9%), tosse (20,7%), coriza (2,2%), sangue nas fezes (8,5%), erupo cutnea (4,9%) e broncoespasmo (7,3%). Houve significncia estatstica com relao frequncia maior de febre, coriza, tosse e broncoespasmo nas crianas com GENV de aqCo do que naquelas de aqNo (p<0,05). De 69 crianas, 73,9% apresentaram desidratao e, dessas, 76,5% necessitaram de hidratao venosa. Esses dados tiveram significncia estatstica, representada por maiores percentuais nas crianas com GENV de aqCo do que naquelas de aqNo (p<0,05). Esse estudo demonstra que os NV foram um importante agente etiolgico nos casos de gastroenterites em crianas hospitalizadas e responsvel por altas taxas de infeces nosocomiais. Estatisticamente, no foi comprovada uma tendncia de aumento dos casos de GENV no perodo do estudo, como tambm do aumento da frequncia de GENV nos anos posteriores em relao aos anos anteriores introduo da vacina Rotarix no Brasil em 2006. No entanto, houve significncia estatstica quando foi avaliado o percentual de GENV em crianas hospitalizadas vacinadas e no vacinadas contra RV. Um aumento dos casos de GENV em crianas poder vir a acontecer nos prximos anos, quando esperado que um nmero maior de crianas ser vacinado contra RV. Tosse, coriza e broncoespasmo so sintomas que devem ser mais detalhadamente investigados. Estratgias de preveno contra a disseminao dos NV so condutas importantes em unidades de internao. Uma vacina eficaz contra norovrus pode ser um benefcio significativo para reduzir o percentual de crianas hospitalizadas por diarreia.
Resumo:
A obesidade uma doena crnica no transmissvel, caracterizada pelo excesso de gordura corporal. Ento, a gordura acumulada na regio abdominal promove resistncia insulina e conseqentemente alteraes metablicas as quais em conjunto configuram o quadro de sndrome metablica (SM). O gentipo Pro12Pro parece estar relacionado menor sensibilidade insulina, desencadeando o processo fisiopatolgico da SM. Ento, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de uma dieta hipocalrica sobre o perfil metablico e composio corporal de mulheres com e sem SM com gentipo Pro12Pro no gene PPARγ2. O presente estudo trata-se de um ensaio clnico, onde mulheres entre 30 e 45 anos, obesas grau I, sem SM (n=23) e com SM (n=7) foram submetidas dieta hipocalrica por 90 dias. A identificao do gentipo foi realizada por reação em cadeia da polimerase (PCR). No incio e nos dias 30, 60 e 90 foram avaliados peso corporal, massa magra (MM), massa gorda (MG), componentes da SM, uricemia, insulinemia, leptinemia, adiponectinemia, os ndices HOMA-IR e QUICKI. O consumo energtico foi avaliado nas 12 semanas de tratamento. Foi utilizado o teste t de Student para amostras independentes foi utilizado para comparar os grupos entre si, e o modelo pareado para comparar a evoluo dentro de cada grupo em relao ao incio do estudo. Todas as mulheres apresentaram gentipo Pro12Pro. O grupo com SM apresentou menor HDL-c (44,43,2 vs. 56,82,4 mg/dL, p=0,013), e maior triglicerdeo (180,926,7 vs. 89,76,6mg/dL, p=0,014) e VLDL-c (36,25,3 vs. 17,91,3mg/dL, p=0,014) no incio do estudo. Ambos os grupos apresentaram reduo ponderal (-3,30,7% grupo sem SM e - 4,20,9% grupo com SM) e da circunferncia da cintura (-2,40,5% grupo sem SM e - 5,91,4% grupo com SM) significativas. O grupo sem SM reduziu da MG progressivamente at os 90 dias (37,00,8 para 36,60,5%, p=0,02), e com isso aumentou MM (62,00,5 para 63,40,5%, p=0,01), o grupo com SM tambm reduziu MG ao longo do estudo (32,62,3 para 29,62,4%, p<0,01) e aumentou MM significativamente (62,21,0 para 64,31,3%). A presso arterial sistlica reduziu no primeiro ms de tratamento no grupo sem SM (de 120,41,8 para 112,32,1 mmHg, p<0,01). No que diz respeito aos parmetros metablicos, o grupo sem SM mostrou reduo da insulinemia (32,54,2 para 25,92,4U/mL, p=0,05) e aumento da adiponectinemia (4,70,6 para 5,10,8 ng/mL, p=0,02) aos 30 dias, do colesterol total (180,25,8 para 173,85,4 mg/dL, p=0,04), e da leptina (27,01,9 para 18,21,4 ng/mL, p<0,01) aos 60 dias, porm, houve reduo do QUICKI aos 90 dias (0,390,03 para 0,350,01, p=0,01). No grupo com SM, a leptinemia reduziu aos 60 dias (20,31,9 para 14,71,1 ng/mL, p=0,01) e a adiponectinemia aos 90 dias (5,71,2 para 7,11,4 ng/mL, p<0,01), tambm houve remisso de 57,1% dos casos de SM. Sugerimos que, a dieta hipocalrica foi eficaz na reduo do peso corporal e da MG, principalmente a localizada na regio abdominal. Conseqentemente, houve melhora considervel do perfil metablico relacionado obesidade no grupo sem SM, e tambm dos marcadores de sensibilidade insulina e cardioprotetores relacionados SM, alm da remisso dos casos de SM.
Resumo:
As doenas cardiovasculares possuem a maior taxa de bitos no mundo, e notavelmente nos ltimos anos as pesquisas genticas sobre as mesmas esto baseadas em estudos de associao, no qual o gene suspeito que esteja em maior frequncia entre os pacientes passa a ser considerado um possvel fator causal. Os polimorfismos genticos que ocorrem no receptor beta-adrenrgico podem resultar em mudanas significativas na funo do receptor, podendo acarretar fisiopatologias. Neste trabalho, o objetivo foi estimar a diversidade e a frequncia do polimorfismo Ser49Gly do gene do receptor beta-adrenrgico 1 a partir de uma amostra de 188 indivduos da populao do Estado do Rio de Janeiro. As frequncias tambm foram analisadas a partir da estratificao da amostra por critrio fenotpico em funo do padro de cor da pele em (negros e no negros) ou ancestralidade gentica em (afrodescendente e no afrodescendente), definida atravs da informao dos marcadores de ancestralidade Indels e SNP de cromossomo Y, para avaliar se os padres de ancestralidade ou cor da pele so fundamentais para a diferenciao e distanciamento gentico. Fragmentos de interesse foram amplificados por PCR (reação de cadeia de polimerase) com primers especficos para o marcador Ser49Gly e as reaes de genotipagem foram realizadas com enzimas de restrio Eco0109I. Os valores da heterozigosidade variaram entre 0,25-0,50 e 0,20-0,41 nos grupos estratificados por ancestralidade e cor da pele, respectivamente. No que diz respeito anlise do equilbrio de Hardy-Weinberg, no houve um desvio significativo na distribuio do marcador nas amostras gerais do Estado do Rio de Janeiro, ou mesmo nas amostras estratificadas. A distribuio dos alelos na amostra dos 188 indivduos da populao geral do Rio de Janeiro (AC_RJ) mostrou uma frequncia de 80,30% e 19,70% para o alelo selvagem e mutado Ser49Gly, respectivamente. A comparao das anlises sobre a distribuio das frequncias allicas para este marcador mostrou a ocorrncia de diferenas significativas na distribuio das frequncias allicas entre negros e no negros e afrodescendentes e no afrodescendentes. A diferena significativa observada entre os negros e afrodescendentes, foi em menor grau de distanciamento. A informao obtida em relao ancestralidade foi crucial para a obteno dos dados sobre o aumento da varivel mutada do polimorfismo Ser49Gly nas populaes negras e afrodescendentes do Estado Rio de Janeiro. Tal evidncia, em combinao com estudos clnicos podem contribuir para uma anlise pormenorizada do padro de susceptibilidade doena em questo, em falhas do mecanismo deste receptor.
Resumo:
Buscamos detectar evidncias da presena de genes envolvidos na produo de Enzimas Modificadoras de Aminoglicosdeos (EMAs), Beta-lactamases de espectro estendido (ESBLs) e Mecanismos Plasmidiais de Resistncia a Quinolonas (PMQRs) em cepas de K. pneumoniae, K. ozaenae e E. coli isoladas de amostras de gua de rios afluentes da Baa de Guanabara e de materiais clnicos de origem hospitalar, alm de avaliar o "status sanitrio" dos corpos aquticos abordados no tocante contaminao fecal recente e indicaes de contaminao hospitalar e por outros ambientes de alta seletividade. As cepas de materiais clnicos foram selecionadas entre Maio e Julho de 2010, a partir da semeadura em meio de cultura contendo 8g/mL de gentamicina. As amostras de gua foram coletadas em Abril e em Julho de 2009. Realizamos testes de colimetria, empregando para tal, a metodologia convencional e outra, na qual adicionamos 32g/mL de cefalotina e 8g/mL de gentamicina aos caldos Lactosado e Escherichia coli (caldo EC), a fim de detectar e quantificar coliformes resistentes. Para o isolamento das cepas empregamos meios de cultura contendo 32g/mL de cefalotina e 8g/mL de gentamicina. As cepas foram identificadas e submetidas a testes de susceptibilidade aos antimicrobianos (TSA), testes presuntivos para presena de ESBLs, extrao de DNA plasmidial e ensaios de Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) para a deteco dos genes. A utilizao de agentes antimicrobianos nos testes de colimetria nos permitiu detectar a presena e quantificar coliformes totais e fecais resistentes nas amostras de gua analisadas nos diferentes pontos. O TSA das cepas isoladas de amostras de gua exibiu perfis de multirresistncia, compatveis com o de bactrias de origem hospitalar, semelhante ao encontrado nas cepas isoladas de materiais clnicos. Todas as cepas isoladas de amostras de gua e 90% das cepas de materiais clnicos apresentaram pelo menos uma banda plasmidial. Os ensaios de PCR evidenciaram a presena de produtos de amplificao para EMAs, ESBLs e PMQRs, sendo que 7,4% das cepas de amostras de gua e 20% das cepas de materiais clnicos apresentaram produtos de amplificao para as trs classes de antimicrobianos. A realizao de testes de colimetria empregando antimicrobianos, como gentamicina e cefalotina, pode ser uma ferramenta adicional importante ao teste convencional, quando o interesse for, o monitoramento e a preveno de contaminao ambiental, especialmente associada a microrganismos carreando genes de resistncia. O uso criterioso de antimicrobianos em atividades de cunho hospitalar e veterinrio e medidas no sentido de preveno de lanamento de esgoto e/ou tratamento dos efluentes, so fundamentais para o controle da disseminao de elementos genticos de resistncia transferveis entre os microrganismos. A deteco e identificao de microrganismos apresentando elementos de resistncia em ambiente extra-hospitalar como em gua e solo, em particular, o emprego de testes de colimetria empregando antimicrobianos, se faz necessria, como forma de preveno e controle de disseminao destes microrganismos com potencial de causar infeces em humanos e outros animais que eventualmente entram em contato com estes ambientes.
