Arrecifes de corales de aguas frías como posibles indicadores de emisiones de hidrocarburos en el banco de Galicia y determinación de su edad mediante racemizacion de aminoácidos

Este proyecto tiene como objetivo analizar la posible relación entre los corales de aguas frías encontrados en el Banco de Galicia con los procesos tectónicos y las estructuras relacionadas con la migración y la emisión de fluidos ricos en hidrocarburos (debido a su interés económico), así como la creación de un algoritmo que establezca una relación entre el grado de racemización sufrido por los aminoácidos de las muestras y la edad de estas. Para ello, se han recopilado datos y muestras en el área de estudio, gracias a los cuales se ha creado una base de datos que contiene una clasificación de las muestras recogidas junto a los datos más relevantes de que están relacionados con el objetivo de este trabajo. Estas muestras han sido proporcionadas por el IGME y fueron recogidas mayoritariamente en la campaña oceanográfica DIVA ARTABRIA II. Con estas muestras se han llevado a cabo análisis de laboratorio como el estudio de racemización de aminoácidos, el análisis de biomarcadores y la datación por uranio-torio de los esqueletos aragoníticos de los corales de aguas frías. Para finalizar, se han estudiado dichos datos con el objeto de comprobar la hipótesis de que los corales de aguas frías colonizan zonas con emisiones de hidrocarburos, conocer su edad y en última instancia crear un algoritmo capaz de datar dichos corales a partir del grado de racemización de sus aminoácidos. Palabras clave: corales de aguas frías, Banco de Galicia, campaña oceanográfica, DIVA ARTABRIA II, base de datos, racemización, aminoácidos, biomarcadores, datación uranio-torio, hidrocarburos, algoritmo. ABSTRACT This project studies the relationship between cold-water corals found in the Galicia Bank with tectonic processes and with the structures related to migration and hydrocarbon-rich fluids emissions. Firstly, data and samples in the study were collected, through to classify the collected samples with the most relevant characteristics to our research scope. Sampling and data collection provided by the IGME were collected in the DIVA ARTABRIA II oceanographic cruise. Secondly, the current work presents a systematic laboratory analysis that allowed the study of aminoacid racemization as well as the analysis of biomarkers and the uranium-thorium dating of aragonitic cold-water coral skeletons. Finally, this data was studied to test the hypothesis that cold-water corals colonize areas with emissions of hydrocarbons, know its age and ultimately create and algorithm capable of dating these corals from the degree of racemization in its amino acids. Keywords: cold-water corals, Galicia Bank, oceanographic cruise, DIVA ARTABRIA II, database, racemization, amino acids, biomarkers, uranium-thorium datation, hydrocarbons, algorithm.

Contaminación y efectos secundarios en suplementos deportivos (proteínas, aminoácidos, creatina y suplementos para la pérdida de peso).

En muchos países la producción de suplementos deportivos no está correctamente regulada a nivel gubernamental. Esto implica la posibilidad de que los ingredientes declarados como componentes del producto no concuerden con los que se indican en la etiqueta del mismo. La literatura ha descrito casos de doping positivo debido a que las sustancias no declaradas en las etiquetas de dichos suplementos se encuentran en la lista de sustancias prohibidas. Este Trabajo Fin de Grado tiene por objetivo realizar una revisión bibliográfica de los estudios y/o análisis que clarifiquen qué suplementos de proteínas, aminoácidos, creatina y orientados a la pérdida de peso y qué marcas o laboratorios son los más fiables y los que no tanto. Dicho estudio se ha enfocado a suplementos que se consumen tanto en el alto rendimiento como a nivel recreativo y social, donde el desconocimiento en este sentido es mucho mayor. También se expondrán los efectos secundarios asociados a su contaminación y/o a su uso inapropiado. ABSTRACT In many countries, the production of sport supplements is not properly regulated by the government. This means that it is possible the ingredients do not match the label claims. In some cases, undeclared substances contained in supplements may include some that are banned by anti-doping laws. This End of Degree Project aims to make a literature review of studies and / or analysis which clarify what kind of protein, amino acids, creatine and fat loss supplements and which brands or laboratories are less reliable, as well as to inform those that do are, not only in high performance sport, but also at the social and recreational level, where the lack of knowledge in this sense is much higher. Also, associated side effects to such contamination and inappropriate use found in the review will be exposed.

Contaminación y efectos secundarios en suplementos deportivos (proteínas, aminoácidos, creatina y suplementos para pérdida de peso).

En muchos países la producción de suplementos deportivos no está correctamente regulada a nivel gubernamental. Esto implica la posibilidad de que los ingredientes declarados como componentes del producto no concuerden con los que se indican en la etiqueta del mismo. La literatura ha descrito casos de doping positivo debido a que las sustancias no declaradas en las etiquetas de dichos suplementos se encuentran en la lista de sustancias prohibidas. Este Trabajo Fin de Grado tiene por objetivo realizar una revisión bibliográfica de los estudios y/o análisis que clarifiquen qué suplementos de proteínas, aminoácidos, creatina y orientados a la pérdida de peso y qué marcas o laboratorios son los más fiables y  los que no tanto. Dicho estudio se ha enfocado a suplementos que se consumen tanto en el alto rendimiento como a nivel recreativo y social, donde el desconocimiento en este sentido es mucho mayor. También se expondrán los efectos secundarios asociados a su contaminación y/o a su uso inapropiado.

La influencia de la temperatura en la datación de conchas por racemización de aminoácidos de los yacimientos de El Perro y La Fragua (Santoña, Cantabria)

Los yacimientos de El Perro y La Fragua se sitúan en el Monte Buciero (Santoña), separados únicamente por apenas 600 metros, en una zona que presenta un microclima particular que provoca el desarrollo de una vegetación con variedad de especies mediterráneas relictas y otras de carácter más atlántico. Ambos presentan niveles del Magdaleniense, Aziliense y Mesolítico que han sido datados empleando el método del carbono-14. En todos los niveles se encuentran abundantes restos de moluscos, incluyendo representantes del género Patella, que se analizaron mediante el método de racemización de aminoácidos. Las edades obtenidas con este método son superiores a las de radiocarbono y a la atribución cultural de los materiales.

La datación por racemización de aminoácidos de muestras malacológicas de yacimientos arqueológicos

La racemización de aminoácidos como herramienta geocronológica se ha revelado como un excelente método para poder datar yacimientos arqueológicos empleando tanto restos óseos como moluscos. Dada la escasa cantidad de material necesaria y el bajo coste analítico, presenta una serie de ventajas sobre otros métodos como el carbono-14 ya que para datar un nivel se emplean varias muestras lo que, entre otras cuestiones, permite identificar resultados anómalos así como aproximarse al time-average de un yacimiento

Primeros resultados sobre la aplicación de la técnica de racemización de aminoácidos en la Región de Murcia (SE de la Península Ibérica) y su interés en estudios de paleosismología

Geochronology is a critical issue in paleoseismological research. The aminoacid racemization technique shows important advantages respect to more traditional dating methods; not just for the lower costs and promptness, also because the object to analyze is relatively frequent, in this study: terrestrial gastropods. Furthermore, the costs of the analysis are by far faster and cheaper compared to other dating techniques. Racemization results allow comparing the relative age from different sedimentary units from one trench to another.Additionally, the racemization technique can also be used as a geochronological tool, provided a calibration curve has been first obtained for the particular climate for the area and, ideally, for a particular genus. In this study we show the results obtained from the analysis of 40 samples of terrestrial gastropods from 7 different trenches located in the Murcia Region (SE Spain). Making use of the D/L ratio of aspartic acid we show the coherence found between relative stratigraphic ages and the racemization age. Finally, we show a provisional conversion equation between age of racemization, obtained from Torres et al. (1997) algorithm, and the likely age of the samples. RESUMEN: El control geocronológico es una cuestión crítica en los estudios de paleosismología. La técnica de racemización de aminoácidos ofrece importantes ventajas respecto a otros métodos de datación, tanto en los costes y rapidez, como en la facilidad de encontrar el objeto de análisis; en este estudio, gasterópodos terrestres. Los resultados permiten comparar la edad relativa entre unidades sedimentarias diferentes de unas zanjas a otras. La técnica de racemización también es una herramienta geocronológica, si bien es necesario primero establecer una curva de calibración para el ambiente climático de la zona e, idealmente, para un género concreto. En este estudio se muestran los resultados obtenidos en 40 muestras de gasterópodos terrestres recogidas en 7 zanjas de investigación paleosismológica en la Región de Murcia. Haciendo uso de la relación D/L del ácido aspártico mostramos la coherencia entre las edades relativas estratigráficas y su edad de racemización. Finalmente, proponemos una relación provisional de conversión entre las edades de racemización obtenidas por el algoritmo de Torres et al. (1997) para gasterópodos de la zona central de la Península Ibérica y la edad probable de las muestras.

Dataciones mediante racemización de aminoácidos en la cueva de Arlanpe (Lemoa, Bizkaia)

Se presentan los resultados de la datación por racemización de aminoácidos obtenidas de muestras del nivel D de Arlanpe.

Function of C1A barley peptidases and their inhibitors (cystatins) in barley seed germination : Funcion de las peptidasas C1A de cebada y sus inhibidores (cistatinas) en la germinacion de la semilla

Plant proteolysis is a metabolic process where specific enzymes called peptidases degrade proteins. In plants, this complex process involves broad metabolic networks and different sub-cellular compartments. Several types of peptidases take part in the proteolytic process, mainly cysteine-, serine-, aspartyl- and metallo- peptidases. Among the cysteine-peptidases, the papain-like or C1A peptidases (family C1, clan CA) are extensively present in land plants and are classified into catepsins L-, B-, H- and Flike. The catalytic mechanism of these C1A peptidases is highly conserved and involves the three amino acids Cys, His and Asn in the catalytic triad, and a Gln residue which seems essential for maintaining an active enzyme conformation. These proteins are synthesized as inactive precursors, which comprise an N-terminal signal peptide, a propeptide, and the mature protein. In barley, we have identified 33 cysteine-peptidases from the papain-like family, classifying them into 8 different groups. Five of them corresponded to cathepsins L-like (5 subgroups), 1 cathepsin B-like group, 1 cathepsin F-like group and 1 cathepsin H-like group. Besides, C1A peptidases are the specific targets of the plant proteinaceous inhibitors known as phytocystatins (PhyCys). The cystatin inhibitory mechanism is produced by a tight and reversible interaction with their target enzymes. In barley, the cystatin gene family is comprised by 13 members. In this work we have tried to elucidate the role of the C1A cysteine-peptidases and their specific inhibitors (cystatins) in the germination process of the barley grain. Therefore, we selected a representative member of each group/subgroup of C1A peptidases (1 cathepsin B-like, 1 cathepsin F-like, 1 cathepsin H-like and 5 cathepsins L-like). The molecular characterization of the cysteine-peptidases was done and the peptidase-inhibitor interaction was analyzed in vitro and in vivo. A study in the structural basis for specificity of pro-peptide/enzyme interaction in barley C1A cysteine-peptidases has been also carried out by inhibitory assays and the modeling of the three-dimensional structures. The barley grain maturation produces the accumulation of storage proteins (prolamins) in the endosperm which are mobilized during germination to supply the required nutrients until the photosynthesis is fully established. In this work, we have demonstrated the participation of the cysteine-peptidases and their inhibitors in the degradation of the different storage protein fractions (hordeins, albumins and globulins) present in the barley grain. Besides, transgenic barley plants overexpressing or silencing cysteine-peptidases or cystatins were obtained by Agrobacterium-mediated transformation of barley immature embryos to analyze their physiological function in vivo. Preliminary assays were carried out with the T1 grains of several transgenic lines. Comparing the knock-out and the overexpressing lines with the WT, alterations in the germination process were detected and were correlated with their grain hordein content. These data will be validated with the homozygous grains that are being produced through the double haploid technique by microspore culture. Resumen La proteólisis es un proceso metabólico por el cual se lleva a cabo la degradación de las proteínas de un organismo a través de enzimas específicas llamadas proteasas. En plantas, este complejo proceso comprende un entramado de rutas metabólicas que implican, además, diferentes compartimentos subcelulares. En la proteólisis participan numerosas proteasas, principalmente cisteín-, serín-, aspartil-, y metalo-proteasas. Dentro de las cisteín-proteasas, las proteasas tipo papaína o C1A (familia C1, clan CA) están extensamente representadas en plantas terrestres, y se clasifican en catepsinas tipo L, B, H y F. El mecanismo catalítico de estas proteasas está altamente conservado y la triada catalítica formada por los aminoácidos Cys, His y Asn, y a un aminoácido Gln, que parece esencial para el mantenimiento de la conformación activa de la proteína. Las proteasas C1A se sintetizan como precursores inactivos y comprenden un péptido señal en el extremo N-terminal, un pro-péptido y la proteína madura. En cebada hemos identificado 33 cisteín-proteasas de tipo papaína y las hemos clasificado filogenéticamente en 8 grupos diferentes. Cinco de ellos pertenecen a las catepsinas tipo L (5 subgrupos), un grupo a las catepsinas tipo-B, otro a las catepsinas tipo-F y un último a las catepsinas tipo-H. Las proteasas C1A son además las dianas específicas de los inhibidores protéicos de plantas denominados fitocistatinas. El mecanismo de inhibición de las cistatinas está basado en una fuerte interacción reversible. En cebada, se conoce la familia génica completa de las cistatinas, que está formada por 13 miembros. En el presente trabajo se ha investigado el papel de las cisteín-proteasas de cebada y sus inhibidores específicos en el proceso de la germinación de la semilla. Para ello, se seleccionó una proteasa representante de cada grupo/subgrupo (1 catepsina tipo- B, 1 tipo-F, 1 tipo-H, y 5 tipo-L, una por cada subgrupo). Se ha llevado a cabo su caracterización molecular y se ha analizado la interacción enzima-inhibidor tanto in vivo como in vitro. También se han realizado estudios sobre las bases estructurales que demuestran la especificidad en la interacción enzima/propéptido en las proteasas C1A de cebada, mediante ensayos de inhibición y la predicción de modelos estructurales de la interacción. Finalmente, y dado que durante la maduración de la semilla se almacenan proteínas de reserva (prolaminas) en el endospermo que son movilizadas durante la germinación para suministrar los nutrientes necesarios hasta que la nueva planta pueda realizar la fotosíntesis, en este trabajo se ha demostrado la participación de las cisteínproteasas y sus inhibidores en la degradación de las diferentes tipos de proteínas de reserva (hordeinas, albúmins y globulinas) presentes en el grano de cebada. Además, se han obtenido plantas transgénicas de cebada que sobre-expresan o silencian cistatinas y cisteín-proteasas con el fin de analizar la función fisiológica in vivo. Se han realizado análisis preliminares en las semillas T1 de varias líneas tránsgenicas de cebada y al comparar las líneas knock-out y las líneas de sobre-expresión con las silvestres, se han detectado alteraciones en la germinación que están además correlacionadas con el contenido de hordeinas de las semillas. Estos datos serán validados en las semillas homocigotas que se están generando mediante la técnica de dobles haploides a partir del cultivo de microesporas.

Geocronología de la Terraza Compleja de Arganda en el valle del río Jarama (Madrid, España)

La Terraza Compleja de Arganda (TCA), situada en el tramo bajo del río Jarama (Madrid), está formada por sucesivos apilamientos de secuencias fluviales denominados de abajo a arriba Arganda I, II, III y IV, en los que se han encontrado importantes yacimientos arqueológicos y paleontológicos del Pleistoceno (Áridos 1 y 2, Valdocarros o HAT), y numerosos conjuntos de industria lítica del Paleolítico inferior y medio. Hasta ahora, la única referencia cronológica disponible para la TCA era la proporcionada por el estadio evolutivo de los micromamíferos de los yacimientos Áridos 1 en Arganda I y Valdocarros en Arganda II. En este trabajo, se propone la equivalencia de las distintas unidades de la TCA con terrazas escalonadas y se establece un marco cronológico numérico, obtenido mediante dataciones de termoluminiscencia, luminiscencia ópticamente estimulada y racemización de aminoácidos. Arganda I (≈ T+30-32 m) se situaría hacia el final del MIS 11 o en el inicio del MIS 9, Arganda II (≈T+23-24 m) se correspondería con el inicio del MIS 7, Arganda III (≈T+18-20 m) se situaría entre el MIS 7 y el MIS 5, y Arganda IV comenzaría su deposición en el MIS 5 finalizando su sedimentación en el MIS 1 al sur de Arganda del Rey (Madrid).

Influencia de la radiación UV en las propiedades mecánicas y en el comportamiento en fractura de un polimero artificial bioinspirado en la seda de araña

En el presente trabajo se estudia la influencia de la radiación UV sobre las propiedades mecánicas y las superficies de fractura de un polímero artificial bioinspirado en la seda de araña. Las fibras de seda de araña constituyen un material enormemente atractivo ya que su elevada resistencia y deformabilidad lo convierten en el material con mayor trabajo hasta rotura de los conocidos hasta el momento. Además se ha encontrado que posee una elevada biocompatibilidad y un comportamiento biodegradable. Debido a estas excelentes propiedades se han dedicado importantes esfuerzos a intentar producir fibras inspiradas en la seda de araña. Fruto de estos esfuerzos es el polímero artificial estudiado en este trabajo. Dicho polímero presenta una secuencia de aminoácidos inspirada en la spidroína 1, que es una de las dos proteínas que conforman la seda de araña natural. Uno de los factores más perjudiciales para los polímeros es la radiación ultravioleta (UV), de presencia ubicua en aplicaciones al aire libre, ya que puede provocar la modificación de sus enlaces covalentes y, como consecuencia, modificar sus propiedades mecánicas. Para evaluar el efecto de la radiación UV sobre el material bioinspirado se ha estudiado el comportamiento a tracción simple de fibras sometidas a diferentes tiempos de irradiación con luz UV de longitud de onda de 254 nm. Se ha observado que la radiación UV de 254 nm modifica considerablemente las propiedades mecánicas de este material a tiempos de exposición elevados (a partir de 3 días de irradiación). Además se ha estudiado el comportamiento a fractura de este material cuando es irradiado con luz UV. Se ha observado que a medida que aumenta el tiempo de irradiación las superficies de fractura comienzan a ser cada vez más planas, obteniéndose un aspecto extremadamente especular para muestras irradiadas durante 16 días

Efecto del nivel de la proteína bruta del pienso y del peso inicial de las pollitas sobre los parámetros productivos y la calidad del huevo en gallinas ponedoras rubias

Las aves, al igual que el resto de animales monogástricos no precisan de un nivel de proteína bruta (PB) en el pienso sino de niveles adecuados de aminoácidos (AA) indispensables (Keshavarz and Austic, 2004; Junqueira et al., 2006; Novak et al., 2006). Sin embargo, en la práctica es frecuente que los nutricionistas soliciten niveles de PB en exceso de lo recomendado por el NRC (1999) o FEDNA (2008). De hecho, muchos nutricionistas formulan piensos para inicio de puesta en gallinas rubias con más de 18.5% PB, cuando niveles de 16.5% PB podrían ser adecuados. La razón de utilizar niveles altos de PB es desconocido pero podría estar relacionado con el mayor margen de seguridad lo que evitaría que un aminoácido (AA) indispensable no contemplado afecte al tamaño del huevo y a la productividad. Por contra, un nivel alto de PB aumenta el precio del pienso cuando el coste de las fuentes proteicas es elevado. La inclusión de grasa en el pienso mejora el tamaño del mismo y puede mejorar el peso vivo de las aves (FEDNA, 2008). Un problema de la industria productora de huevos es el relacionado con el peso inicial de las pollitas y su influencia sobre las diversas variables productivas. El PV de las aves podría verse afectado por las características del pienso. El objetivo de este ensayo fue estudiar la influencia del nivel proteico de piensos isonutritivos en relación con la EMAn y los aminoácidos indispensables, sobre la productividad en gallinas rubias.

Influencia de la micronización y el origen de la harina de soja en los redimientos productivos en lechones destetados

La harina de soja (HS) es la fuente de proteína de elección en dietas para cerdos. La HS contiene diversos factores anti nutricionales (FAN), tales como los inhibidores de tripsina (IT; Huisman y Jansman, 1991) y los oligosacáridos (Clarke y Wiseman, 2005) que afectan al crecimiento y limitan los niveles de inclusión en dietas para lechones. El procesado térmico del haba y su composición (De Coca Sinova et al., 2008) afectan al contenido de nutrientes así como la respuesta de los animales a su inclusión en piensos. Morgan et al. (1984) y Dilger et al. (2004) han demostrado que un aumento en el contenido de fibra bruta de la dieta o de la HS utilizada disminuye la digestibilidad de los nutrientes en monogástricos y De Coca et al. (2008) observaron una relación lineal entre el contenido de proteína bruta (PB) y la digestibilidad de los aminoácidos en HS. Por lo tanto, la inclusión de HS de alto contenido en PB (AP-HS) en sustitución de HS de menor contenido proteico (BP-HS) podría mejorar el crecimiento de los lechones. Los concentrados de soja (CPS) tienen un alto contenido en PB y bajo contenido de fibra bruta y en FAN (Shon et al., 1994). Por lo tanto, la sustitución de HS por CPS, podría mejorar el rendimiento de los cerdos al destete. Los efectos del tamaño medio de partícula (GMD) del pienso sobre el crecimiento es un tema de debate (Goodband et al., 1995). La mayoría de estudios llevados a cabo con cereales han encontrado una relación directa positiva entre la GMD y el índice de conversión (IC) en cerdos (Goodband y Hines, 1988; Healy et al., 1994). Sin embargo, los resultados disponibles sobre los efectos de la molturación fina de la HS sobre la productividad en lechones son escasos y no concordantes (Fastinger y Mahan, 2003; Lawrence et al., 2003; Valencia et al., 2008). El objetivo de este experimento fue evaluar los efectos de la inclusión de diferentes tipos de soja en los que variaba el contenido de PB y el tamaño de partícula sobre el crecimiento de los lechones.

Identificación y caracterización de la ruta mediada por la proteína G heterotrimérica de Arabidopsis thaliana en la respuesta inmune

La resistencia de las plantas a los hongos necrótrofos como Plectosphaerella cucumerina es genéticamente compleja y depende de la activación coordinada de distintas rutas de señalización (Llorente et al, 2005; Sanchez-Vallet et al, 2010). Entre éstas se encuentran las mediadas por la proteína G heterotrimérica, un complejo formado por tres subunidades (Gα, Gβ y Gγ) que regula tanto la respuesta de inmunidad a diferentes patógenos como distintos procesos de desarrollo (Temple and Jones, 2007). En esta Tesis hemos demostrado que, en Arabidopsis, el monómero funcional formado por las subunidades Gβ y Gγ1/Gγ2 es el responsable de la regulación de la respuesta de defensa, ya que mutantes nulos en estas subunidades (agb1 y agg1 agg2) presentan una alta susceptibilidad al hongo P. cucumerina. Además, hemos identificado varios aminoácidos (Q102, T188 y R235) de la proteína AGB1 esenciales en la interacción con los efectores correspondientes para la regulación de la respuesta inmune (Jiang et al, enviado). Para determinar las bases moleculares de la resistencia mediada por la proteína G heterotrimérica, llevamos a cabo un análisis transcriptómico comparativo entre los genotipos agb1 y Col-0, el cual reveló que la resistencia mediada por AGB1 no depende de rutas defensivas implicadas en la resistencia a hongos necrotrofos, como las mediadas por el ácido salicílico (SA), etileno (ET), jasmónico (JA) o ácido abscísico (ABA), o la ruta de biosíntesis de metabolitos derivados del triptófano. Este estudio mostró que un número significativo de los genes desregulados en respuesta a P. cucumerina en el genotipo agb1 respecto a las plantas silvestres codificaban proteínas con funciones relacionadas con la pared celular. La evaluación de la composición y estructura de la pared de los mutantes de las subunidades de la proteína G heterotrimérica reveló que los genotipos agb1 y agg1 agg2 presentaban alteraciones similares diferentes de las observadas en plantas silvestres Col-0, como una reducción significativa en el contenido de xilosa en la pared. Estos datos sugieren que la proteína G heterotrimérica puede modular la composición/estructura de la pared celular y contribuir, de esta manera, en la regulación de la respuesta inmune (Delgado- Cerezo et al, 2011). La caracterización del interactoma de la proteína G heterotrimérica corroboró la relevancia funcional que presenta en la regulación de la pared celular, ya que un número significativo de las interacciones identificadas estaban comprendidas por proteínas relacionadas directa o indirectamente con la biogénesis y remodelación de la pared celular (Klopffleisch et al, 2011). El papel en inmunidad de algunos de estos potenciales efectores ha sido validado mediante el análisis de la resistencia a P. cucumerina de los mutantes de pérdida de función correspondientes. Con el objetivo de caracterizar las rutas de señalización mediadas por AGB1 e identificar efectores implicados en esta señalización, llevamos a cabo una búsqueda de mutantes supresores de la susceptibilidad de agb1 a P. cucumerina, identificándose varios mutantes sgb (supressor of Gbeta). En esta Tesis hemos caracterizado en detalle el mutante sgb10, que presenta una activación constitutiva de las rutas de señalización mediadas por SA y JA+ET y suprime el fenotipo de susceptibilidad de agb1. SGB10 y AGB1 forman parte de rutas independientes en la regulación de la respuesta inmune, mientras que interaccionan de forma compleja en el control de determinados procesos de desarrollo. La mutación sgb10 ha sido cartografiada entre los genes At3g55010 y At3g56408, que incluye una región con 160 genes. ABSTRACT Plant resistance to necrotrophic fungi Plectosphaerella cucumerina is genetically complex and depends on the interplay of different signalling pathways (Llorente et al, 2005; Sanchez-Vallet et al, 2010). Among others, the heterotrimeric G protein complex has a relevant role. The G protein that is formed by three subunits (Gα, Gβ and Gγ) is a pleiotropic regulator of immune responses to different types of pathogens and developmental issues (Temple and Jones, 2007). Throughout the Thesis, we have demonstrated that Arabidopsis’ functional monomer formed by the Gβ and Gγ1/Gγ2 subunits is a key regulator of defense response, as null mutants (agb1 and agg1 agg2) are equally hypersusceptible to P. cucumerina infection. In addition we have identified several AGB1 aminoacids (Q102, T188 y R235) essentials to interact with specific effectors during the regulation of immune response (Jiang et al, sent).To determine the molecular basis of heterotrimeric G protein mediated resistance we have performed a microarray analysis with agb1-1 and wild type Col-0 plants before and after P. cucumerina challenge. A deep and exhaustive comparative transcriptomical analysis of these plants revealed that AGB1 mediated resistance does not rely on salicilic acid (SA), ethylene (ET), jasmonates (JA), abscisic acid (ABA) or triptophan derived metabolites biosynthesis. However the analysis revealed that a significant number of cell wall related genes are misregulated in the agb1 mutant after pathogen challenge when compared to wild-type plants. The analysis of cell wall composition and structure showed similar cell wall alterations between agb1 and agg1 agg2 mutants that are different from those of wild-type plants, so far the mutants present a significant reduction in xylose levels. All these results suggest that heterotrimeric G protein may regulate immune response through modifications in the cell wall composition/structure (Delgado-Cerezo et al, 2011). The characterization of Heterotrimeric G protein interactome revealed highly connected interactions between the G-protein core and proteins involved in cell wall composition or structure (Klopffleisch et al, 2011). To test the role in immunity of several effectors identified above, we have performed resistance analysis of corresponding null mutants against P. cucumerina. In order to characterize AGB1 mediated signalling pathway and identify additional effectors involved in AGB1-mediated immune response against P. cucumerina, we have performed a screening to isolate mutants with suppression of agb1 phenotype. One of the mutants, named sgb10, has been characterized during the Thesis. The mutant shows constitutive expression of SA, JA+ET-mediated defense signaling pathways to suppres agb1 hypersusceptibility. SGB10 and AGB1 proteins seem to be part of independent pathways in immunity, however its function during development remains unclear. At present, we have mapped the sgb10 mutation between At3g55010 and At3g56408 genes. This region contains 160 genes.

Empleo de biomarcadores para la reconstrucción paleoclimática. El registro pleistoceno del Mar de Fuentillejo (Ciudad Real)

El registro sedimentario del lago volcánico conocido como maar de Fuentillejo (Centro de España) ofrece la oportunidad de determinar la evolución paleoambiental durante el Pleistoceno medio y superior de la parte Centro-Sur de la Península Ibérica, objetivo principal de esta Tesis Doctoral. Se ha recopilado información sobre otras reconstrucciones paleoambientales en maares de todo el mundo y estudios paleoclimáticos realizados en el registro de la turbera de Padul, relativamente próxima al maar de Fuentillejo. Con ello, se pudo realizar el estado del arte.A lo largo del sondeo continuo (142,25 m) perforado en la parte central del maar de Fuentillejo en el año 2002, se han tomando un total de 613 muestras a intervalos de 20 cm para el análisis de biomarcadores. Los biomarcadores se obtuvieron mediante un equipo de extracción acelerada de disolventes (Dionex ASE 200) y fueron analizados con un cromatógrafo de gases (HP 6890) con detector selectivo de masas (HP 5973). La datación de sedimentos del maar de Fuentillejo ha sido complicada debido a la ausencia de restos orgánicos terrestres. Se seleccionaron seis muestras de sedimento para intentar datar por el método de racemización de aminoácidos: los resultados obtenidos no fueron buenos. Finalmente, el modelo de edad-profundidad se ha llevado a cabo mediante paleomagnetismo, dataciones 14C y U/Th. En base a una interpolación lineal de las edades medias calibradas se ha datado la base del registro en aproximadamente 355 ka. Se han identificado y cuantificado los n-alcanos, n-metil cetonas, ácidos n- alcanoicos y azufre orgánico del sedimento a lo largo del registro. La interpretación de los diferentes índices establecidos a partir de éstos permite independizar tres Unidades Geoquímicas generales (UG) y nueve Subunidades (S) que definen condiciones paleoambientales distintas (predominio en el aporte de vegetación terrestre/de macrofitas/acuática, lámina de agua más alta vs. más baja, periodos más húmedos vs. más secos).A partir de análisis estadísticos de los índices de n-alcanos (matriz de correlación y análisis de agrupaciones) se han definido tres asociaciones: Grupo 1 (condiciones ambientales más húmedas y fase con lámina de agua elevada), Grupo 2 (con condiciones intermedias) y Grupo 3 (las fases más secas y con lámina de agua más baja). Además, se establece un Indicador Paleoambiental (I.P.) que muestra variaciones notables correlacionables con escenarios paleoambientales distintos (más húmedos vs. más secos) distinguiendo veintiséis Episodios (E): cinco Secos, nueve Húmedos y doce Intermedios.En general, se encuentra una buena correspondencia entre estos Episodios (E) y los eventos paleoclimáticos cortos descritos por Vegas et al. (2010) en este registro, en base a la palinología y geoquímica, así como los Episodios del Oxígeno Marino (MIS) y Eventos Heinrich, que permiten suponer que las oscilaciones paleoclimatológicas registradas en el maar tienen un origen global. Esta correspondencia se confirma por el análisis espectral, que revela que los ciclos interpretados (103, 41, 26 y 23 ka) evidencian influencia orbital. Además, se ha realizado una correlación tentativa entre los episodios paleoambientales de larga duración obtenidos a partir del perfil suavizado del porcentaje relativo de C27 de la Cuenca de Padul (Granada, Sur de la Península Ibérica) y el perfil I.P. suavizado del maar de Fuentillejo, aunque hay diferencias que podrían ser explicadas por la vecindad de Padul a la zona de nieves perpetuas de Sierra Nevada lo que origina marcadas diferencias hidrológicas entre ambos sitios. El análisis por cadenas de Markov ha permitido determinar que los cambios paleoambientales reflejados por los biomarcadores no fueron, en la mayoría de los casos, bruscos pasando, normalmente, por estados transicionales.

Mejora del valor proteico para rumiantes de la harina de girasol mediante tratamientos combinados con ácidos (málico y fosfórico) y calor = Improvement of the protein value for ruminants of sunflower meal by combined treatments with acids (malic and orthophosphoric) and heat

El objetivo principal de esta tesis fue incrementar el valor proteico para rumiantes de la harina de girasol mediante tratamientos combinados con ácidos y calor para proteger sus proteínas frente a la degradación ruminal. Estos estudios comprenden dos experimentos realizados sobre ovinos mediante tecnologías in vitro (experimento 1) o in situ e in vivo (experimento 2), empleando siempre dos ácidos: málico u ortofosfórico. Aprovechando este último experimento, también se consideraron otros objetivos de carácter metodológico con el fin de mejorar la precisión de las estimas de i) la degradabilidad ruminal y la digestibilidad intestinal de la proteína y los aminoácidos (AAs) de los alimentos y ii) la síntesis microbiana ruminal y su contribución al flujo post-ruminal de nutrientes al animal. En el experimento 1 (capítulo 2) se efectuaron cuatro ensayos in vitro para estudiar la influencia de distintos factores que puedan afectar la eficacia de estos tratamientos. En cada ensayo se utilizó una réplica por tratamiento (dos para el tratamiento control) y dos bolsas vacías (empleadas para corregir la contaminación microbiana) en cada una de las cuatro botellas del incubador (ANKOM Daisy II). Cada botella contenía 2 l de medio de incubación, saturado con CO2 para asegurar la anaerobiosis. Este medio consistió en una mezcla de solución McDougall y liquido ruminal filtrado en relación 4:1. El liquido ruminal fue obtenido de 2 corderos canulados en rumen, utilizándose bien solo o mezclado con el del otro cordero en una relación 3:1. Así, cada botella de incubación contenía un inoculo ruminal diferente. Las incubaciones se realizaron a 39 ºC durante 20 h, siendo las bolsas lavadas con agua corriente y almacenadas a -20 ºC. Tras ser descongeladas, se lavaron 3 veces durante 5 min en una mini-lavadora de turbina, se desecaron a 80 ºC durante 48 h y se destinaron íntegras al análisis de N-Kjeldahl. En el ensayo 1 se estudió el efecto del volumen de disolución de dos dosis de ácido ortofosfórico (0,4 y 1,2 equivalentes gramo (eq)/kg de harina de girasol), testando cinco volúmenes de disolución (80, 160, 240, 320 and 400 ml/kg de harina) para cada dosis, desecándose las harinas a 60 ºC hasta sequedad al tacto. La proteína bruta (PB) indegradada se incremento con la dosis de ácido empleada y también (como tendencia, P < 0,1) con el volumen de dilución. En base a ello en los siguientes ensayos se utilizo el volumen de dilución mayor (400 ml/kg). En el ensayo 2 se estudió el efecto de la dosis y del tipo de ácido a cuatro dosis (1,2; 2,4; 3,6 y 4,8 eq/kg), secándose igualmente las muestras tratadas a 60 ºC. La PB indegradada aumentó con la dosis de ácido, siendo también mayor para el ácido málico, tanto en este ensayo como en los posteriores. En el ensayo 3 se estudiaron los efectos de los dos ácidos, cuatro concentraciones (0,6; 1,2; 1,8 y 2,4 eq/kg) y tres tratamientos térmicos para el secado de las muestras (100, 150 and 200 ºC durante 60, 30 y 20 minutos, respectivamente). Con los tratamientos térmicos a 100 y 150 ºC no hubo un incremento de protección para concentraciones superiores a 0,8 eq/kg para ambos ácidos. Para incrementar la protección fue necesario aumentar la temperatura a 200 ºC y la dosis a 1,2 eq/kg, no observándose un aumento de protección a dosis mayores. En el ensayo 4 se estudiaron los efectos sobre la lisina disponible, la solubilidad de la PB en saliva artificial de McDougall y la PB indegradada in vitro de tratar la harina solo con agua o con disoluciones de ambos ácidos a dosis de 0,8 eq/kg y temperaturas de secado de 100 ó 150 ºC en las mismas condiciones que en el ensayo 3. No se apreciaron efectos sobre la lisina disponible para ninguno de los tratamientos. El efecto específico de los ácidos quedo demostrado tanto por la fuerte reducción de la solubilidad de la PB como por el aumento de la PB indegradada frente al tratamiento con agua. En conjunto, los resultados de este experimento mostraron que la eficacia de estos tratamientos depende del tipo y dosis de ácido y de su dilución, así como de las condiciones de secado. Como tratamiento de mayor interés a aplicar posteriormente en el experimento 2 se consideró una dosis de 0,8 eq/kg de harina, aplicada en un volumen de 400 ml/kg (correspondiente a soluciones 1 M y 0,67 M para los ácidos málico y ortofosfórico, respectivamente) y desecación a 150 ºC. El experimento 2 (capítulos 3 a 7) se realizó con un diseño en cuadrado latino 3x3, empleando tres corderos canulados en rumen y duodeno y tres dietas isoproteicas: U, M y P, que incluían harinas de girasol sin tratar (control) y tratadas con acido málico u ortofosfórico, respectivamente. La harina de girasol se trató en las condiciones ya indicadas siendo necesarias 6 horas para su secado en estufa. Las dietas incluían 40% de heno de raigrás italiano y 60% de concentrado a base de harina de girasol (tratada y/o sin tratar), trigo y corrector vitamínico-mineral, siendo suministradas a 75 g/kg P0.75 (equivalente a 2,3 × mantenimiento). La relación harina de girasol sin tratar y tratada fue de 100:0 en la dieta U y entorno a 40:60 en las dietas M y P. Tras 10 días de adaptación a la dieta, se estudiaron sucesivamente: i) el tránsito hasta el duodeno de las partículas del heno (solo en la dieta control) y de la harina de girasol marcadas previamente con europio e iterbio, respectivamente; ii) la fermentación ruminal durante el periodo postprandial, iii) la degradación ruminal in situ de la harina de girasol específica de cada dieta (y del trigo y el heno en la dieta control) y iv) la magnitud y composición del contenido ruminal mediante el vaciado manual del rumen-retículo. Durante todo el periodo experimental se infundio de forma continua una solución de sulfato amónico enriquecido en 15N (98 átomos %) para corregir la contaminación microbiana ruminal en los estudios in situ y para establecer las diferencias de composición química entre las bacterias libres (BAL) y adherentes (BAS) del rumen. Esta solución incluyó en los dos últimos días Li-Cr- EDTA para determinar la tasa de dilución ruminal. Posteriormente, y tras un periodo de al menos 10 días para eliminar el enriquecimiento en 15N de la digesta, se estudió la digestibilidad intestinal de los distintos alimentos mediante la técnica de bolsas móviles. La determinación del bypass (BP) o de la degradabilidad efectiva (DE) de la materia seca (MS) y de la PB se realizó por el método tradicional de integración matemática; estos valores se obtuvieron también para la PB y los AAs generando una muestra representativa del flujo post-ruminal del alimento en estudio en cada animal. Ello se realizó mediante la mezcla de los distintos residuos de incubación en base a la función que describe el flujo de alimento indegradado que abandona el rumen. Todos estos trabajos se realizaron considerando la tasa de salida de partículas del rumen (kp) y, según casos, considerando también la tasa de conminución y mezcla de las partículas en este compartimento (kc). Para este último caso se ha desarrollado también el modelo matemático que describe este flujo y permite este cálculo. Los valores no corregidos por la contaminación microbiana del BP (o de DE) de la PB resultantes de ambos métodos se han comparado tanto en las harinas de girasol como en los restantes alimentos de la dieta, obteniéndose valores similares, sin apreciarse desviaciones sistemáticas. Sobre las muestras compuestas representativas de la composición química del BP se determino la digestibilidad intestinal efectiva (DIE) de la MS, PB y AAs. Todos los valores resultantes de esta técnica fueron corregidos para la contaminación microbiana de las partículas que tiene lugar en el rumen. Los estudios de transito digestivo se realizaron tras suministrar en el comedero a los corderos una dosis simple de los alimentos marcados, seguida de la toma de muestras de la digesta duodenal durante 82 h. En la dieta testigo se suministraron simultáneamente el heno de raigrás y la harina de girasol, mientras que en las otras dietas solo se suministró esta última. La harina de girasol mostro un mayor valor para kc frente al heno (0,5766 v. 0,0892, /h), mientras que no hubo diferencias entre los dos alimentos para kp (0,0623 v. 0,0609, /h). Para la harina de girasol no se apreciaron diferencias entre dietas para kc, pero si se redujo de manera moderada la tasa kp con los tratamientos, siendo ésta también menor al utilizar ácido ortofosfórico frente al uso de ácido malico (0,0577 v. 0,0600, /h). El empleo de las harinas tratadas no modifico los parámetros de fermentación ruminal, la composición de los contenidos ruminales o la tasa de dilución del rumen. Los valores efectivos del BP y de DIE de la MS, PB y AAs de las harinas de girasol se obtuvieron considerando kc y kp, conjuntamente. Los tratamientos de protección incrementaron el BP de MS y PB en 48,5 y 268% de media, respectivamente. Estos incrementos se debieron principalmente al descenso de la fracción soluble y de la velocidad de degradación, pero también al aumento de la fracción indegradable, especialmente usando ácido ortofosfórico. Con los tratamientos se incrementó también la DIE de la MS (108% de media) y de la PB con gran diferencia entre los ácidos málico y ortofosfórico (20,7 v. 11,8%). Como consecuencia de estos cambios la protección aumentó la fracción realmente digerida en el intestino en 211% (MS) y 325% (PB), sin efectos entre ambos ácidos. Considerando la reducción del suministro de energía fermentable para los microorganismos ruminales asociada a la protección y los parámetros indicados por el sistema PDI francés para la síntesis de proteína microbiana digestible, la eficacia de conversión de PB en proteína metabolizable aumentó de 0,244 a 0,559 y 0,515 con el tratamiento con acido málico y ortofosfórico, respectivamente. El contenido en aminoácidos (AAs) fue similar en todas las harinas salvo por una disminución de lisina en las harinas tratadas. De forma análoga a la PB, los tratamientos de protección incrementaron el BP y la DIE de la mayoría de AAs. El aporte de AAs metabolizabes de la harina se multiplico en 3,87 para los AAs azufrados y en menor medida (2,5 veces) para la lisina, como consecuencia de las pérdidas sufridas a consecuencia del tratamiento térmico. Estos tratamientos se muestran, por tanto, útiles para incrementar el valor proteico de la harina de girasol, si bien su empleo junto con concentrados proteicos ricos en lisina bypass digestible mejoraría el perfil de la proteína metabolizable. La corrección de la contaminación microbiana de las partículas que tiene lugar en el rumen se asoció en todos los alimentos testados y, de forma general, con reducciones del BP y de su DIE en todas las fracciones estudiadas. Estas reducciones fueron pequeñas en todos los concentrados, de forma acorde con los muy pequeños niveles de contaminación registrados tanto en las harinas de girasol como en el grano de trigo. Por el contrario, esta contaminación, al igual que los efectos de su corrección, fueron muy importantes en el heno de raigrás. Esta contaminación aumentó al tener en cuenta kc. Así, para la proporción de PB de origen microbiano existente en las muestras compuestas representativas del BP, este aumento fue significativo para el heno de raigrás (0,463 v. 0,706) y solo numérico para la harina de girasol (0,0170 v. 0,0208). La reducción de las estimas de DIE al corregir esta contaminación fue consecuencia de la eliminación de forma casi completa de los microorganismos adherentes en todos los residuos testados. Así, esta biomasa se redujo en 96,1% como media de 7x3 observaciones. Como resultado de las diferencias acumulativas a nivel del rumen e intestino, la no corrección de la contaminación microbiana junto con la no consideración de kc condujo a fuertes sobrestimaciones de la PB digerida en el intestino. Ésta fue de 39% en la harina de girasol (0,146 v. 0,105) y de 761% en el heno de raigrás (0,373 v. 0,0433). Estos resultados muestran que es necesario considerar tanto kc como corregir la contaminación microbiana para obtener estimas in situ precisas en forrajes, mientras que en concentrados, siempre que la contaminación microbiana sea pequeña, es más importante considerar kc. La elevada contaminación microbiana observada en el heno de raigrás se asoció también con importantes errores a nivel del N asociado a la fibra neutro (FND) y ácido (FAD) detergente (NDIN y ADIN, respectivamente) e incluso de estas fracciones de fibra, evidenciándose que estos métodos no eliminan completamente la contaminación microbiana que sufren los alimentos en su paso por el retículorumen. Así, en la muestra compuesta representativa de la composición química del flujo postruminal antes descrita, la sobrevaloración por no corregir la contaminación microbiana fue de 99,8; 24,2; 3,34 y 0,48% para NDIN, ADIN, FND y FAD, respectivamente. Las subvaloraciones asociadas para su DE fueron 34,1; 8,79; 4,41 y 0,51%, respectivamente. La DE corregida del NDIN y ADIN (0,743 y 0,728, respectivamente) mostró un aprovechamiento ruminal elevado de estos compuestos, si bien menor al de la PB total (0,85). El estudio de este aprovechamiento sobre los residuos de incubación ruminal a 6 y 72 h demostró, además, una más rápida degradación del ADIN frente al NDIN, así como un mayor potencial de degradación de este último en este alimento. Para comprobar si la digestión en el abomaso eliminaba la contaminación microbiana en la FND y FAD se estudio esta contaminación y sus posibles errores en muestras liofilizadas de contenidos ruminales y duodenales correspondientes a una dieta mixta de similar composición a la utilizada en el experimento 2, comparándose, además, las diferencias entre la extracción secuencial o directa de la FAD. Utilizando como referencia las BAS se apreciaron elevadas contaminaciones en la FND y FAD y su N asociado tanto en las muestras ruminales como en las duodenales. Sin embargo, los resultados de enriquecimiento en 15N de las partículas fueron intermedios entre los correspondientes a BAS y BAL lo que evidencia una elevada contaminación con BAL en estas muestras probablemente durante el proceso de liofilización. Ello conlleva una sobrevaloración de esta estimación. El método de extracción directa de FAD se mostró, por otra parte, marcadamente menos eficaz en la eliminación de la contaminación microbiana. Los resultados muestran la necesidad de corregir la contaminación microbiana para obtener estimaciones precisas de la degradabilidad de las proteínas de las paredes celulares vegetales. Estos errores deberían ser también considerados para FND y FAD en estudios in situ e in vivo. La elevada tasa fraccional de degradación del grano de trigo (60,9 y 42,0%/h para MS y PB, respectivamente) implico que su flujo de material indegradado (calculado solo en base a la kp obtenida para la harina de girasol) se redujera muy rápidamente, de forma que es casi nulo a 8 h tras la ingestión. Los valores corregidos de PB digerida en el intestino (0,15) representan solo el 18,7% de la proteína metabolizable, lo que muestra que el valor proteico del grano de trigo está estrechamente ligado a la síntesis de proteína microbiana derivada de su fermentación. En el experimento 2 se observaron menores concentraciones para materia orgánica, lípidos y PB, así como en la proporción N-AAs/N total en BAL que en BAS, siendo, por el contrario, mayor su enriquecimiento en 15N. Estos últimos resultados se utilizaron (junto con los de otros trabajos previos de este equipo) para validar una predicción preexistente del enriquecimiento en 15N de las BAS a partir de este valor en las BAL. Esta ecuación, de muy alta precisión (R2 = 0.995), permite calcular la subvaloración que se comete en los aportes de nutrientes correspondientes a las BAS al usar las BAL como muestra de referencia. Esta subvaloración representa aproximadamente 21, 32,5 y 60% para PB, proteína verdadera y lípidos.