Development of non-viral vectors for gene therapy for pathologies of the retina

Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2015

The success of gene therapy relies on efficient gene transfer and stable transgene expression. Our goal was to develop non-viral vectors optimized for retinal gene therapy with continued gene expression. Polymers, chitosan and hyaluronic acid or the modified polymers (thiolated chitosan and aminated hyaluronic acid) were chosen considering their biocompatibility and biodegradability to prepare several formulations. Vectors were formulated and characterized regarding their physical properties, biocompatibility and gene transfer efficiency in vitro on both retinal pigment epithelial and HEK293 cells and gene expression in the mouse retina. Our results show that our vectors exhibit size and surface charge consistent with gene delivery. They also present long-term stability in both storage and physiological conditions, remain stable after several freeze-thaw cycles and are capable of efficiently protecting DNA from nuclease degradation. Transfection studies show that transfection efficiency and transgene expression is affected by cell type, polymer molecular weight and mode of integrase delivery with the polyplexes. The incorporation of hyaluronic acid affected formulation stability, as expected, but it did not affect DNA loading and protection. The combination of chitosan and hyaluronic acid in polyplexes showed a significant improvement of transfection efficiency compared to chitosan-based vectors. In order to achieve sustained gene transfer vectors were combined with phiC31-integrase to promote transgene integration. The combined strategy of chitosan-based delivery and integrase demonstrate prolonged gene expression of both small (GFP, 1 Kb) and large genes (CEP290, 8Kb) several weeks post-transfection. In vivo sub-retinal administration of our vectors showed efficient transfection and sustained transgene expression in RPE cells at least 6 months post- injection. Our results indicate this chitosan-based approach may overcome size limitations found in commonly used adeno-associated viruses mediated gene transfer, while maintaining a high safety profile and prolonged, sustained gene expression, thus constituting an alternative for retinal gene delivery.

A terapia génica é uma abordagem terapêutica que tem mostrado grande potencial para o tratamento de doenças genéticas hereditárias ou adquiridas. Geralmente envolve a substituição ou inibição do gene mutado ou ainda a inserção de um novo gene. O sucesso de uma estratégia de terapia génica depende da eficiência da transferência genética e da expressão estável do gene transferido. Atualmente existem duas abordagens que são utilizadas no desenvolvimento de terapias génicas: a viral e a não viral. A abordagem viral, embora seja bastante eficiente, levanta preocupações com a segurança a nível imunológico e mutagénico. Por outro lado a abordagem não-viral caracteriza-se pela sua fácil utilização, capacidade de empacotamento de genes ilimitada e ausência de resposta imunitária. Apesar destas vantagens a aplicabilidade da abordagem não-viral encontra-se limitada pela sua baixa eficiência de transfeção quando comparada com a abordagem viral; deste modo, a optimização dos vetores não-virais visa sobretudo a melhoria da sua eficiência de transfeção. O nosso objectivo era desenvolver vetores não-virais para terapia génica ocular, em particular da retina. Considerando o órgão alvo, o olho apresenta características únicas para terapia génica como por exemplo o seu reduzido tamanho, relativo isolamento em relação à circulação sistémica e facilidade de acesso a diferentes tipos de tecidos por vias de administração diferentes. Grande parte das estratégias de terapia génica não-viral focam-se na utilização de lípidos ou polímeros catiónicos, mas até à data poucos estudos foram feitos sobre a sua utilização no olho e em particular na retina. Os polímeros, quitosano e ácido hialurónico ou os polímeros modificados (quitosano tiolado e ácido hialurónico aminado) foram escolhidos considerando a sua biocompatibilidade e biodegradabilidade para a preparação de diversas formulações de vectores. Estes polímeros já foram utilizados com bastante sucesso em aplicações como a entrega de fármacos, o que, aliado às propriedades referidas anteriormente, os torna bastante atrativos para aplicações de terapia génica, embora seja necessária a sua otimização. Esta otimização engloba a modificação química dos polímeros suprareferidos, tal como a modificação com cistamina que permite introduzir uma ponte dissulfeto, que pode ser clivada no meio intracelular pela glutationa, permitindo assim uma libertação do ADN mais facilitada. No caso do ácido hialurónico permite ainda adicionar grupos amina, que poderiam interagir electrostaticamente com o ADN. Experimentalmente podemos dividir este trabalho em 3 secções: i) a preparação de diversas formulações de vetores com quitosano e ácido hialurónico, que foram caracterizadas em relação às suas propriedades físicas, nomeadamente tamanho, polidispersão, carga superficial, eficiência da complexação de ADN, capacidade de proteção contra nucleases e estabilidade dos vectores em diferentes condições; ii) a caraterização dos vectores in vitro em relação à sua citotoxicidade e eficiência de transfeção em células epiteliais pigmentadas de retina e células HEK293; iii) a administração in vivo dos vectores com melhores resultados in vitro e a sua caracterização em relação à sua expressão génica na retina de ratinhos através de injeção subretiniana. Os nossos resultados mostram que os vetores têm tamanho e carga superficial adequados à entrega de genes, embora variem consoante a formulação. Apresentam também estabilidade a longo prazo tanto em condições de armazenamento como em condições fisiológicas de temperatura e pH. Os vetores mantêm-se estáveis após vários ciclos de congelação e descongelação e são capazes de proteger eficazmente o ADN da degradação por nucleases. Observouse também um efeito do peso molecular do quitosano nas propriedades dos vetores: a utilização de um polímero com maior peso molecular resultou em vetores de maiores dimensões com tendência para uma carga superficial superior, mas com uma estabilidade mais reduzida comparativamente aos vetores preparados com o polímero de menor peso molecular. Este efeito do peso molecular do polímero estendeu-se à eficiência de transfeção e vectores preparados com o polímero de menor peso molecular obtiveram melhores resultados. Os ensaios de transfeção mostram também que a eficiência de transfeção e a expressão do transgene é afectada pelo tipo de células e modo de entrega da integrase com os poliplexos. A eficiência de transfeção foi superior em células HEK293 do que em células pigmentadas da retina. A elevada estabilidade dos poliplexos tem sido associada com uma baixa eficiência de transfeção e a utilização de polímeros aniónicos tem sido usada como uma das opções para solucionar essa questão. A incorporação de ácido hialurónico nas formulações afectou a estabilidade das formulações, como era esperado, mas não afectou a complexação nem a proteção do ADN no poliplexo. A combinação de quitosano e ácido hialurónico nos poliplexos mostrou uma melhoria significativa na eficiência de transfeção comparada com vectores baseados apenas em quitosano. Os ensaios de transfeção usando vectores preparados com os polímeros modificados (quitosano tiolado e ácido hialurónico aminado) não revelaram melhorias significativas em relação aos polímeros não modificados. Pensa-se que isto poderá estar associado a interferências do contra-ião de grandes dimensões – tosilato no caso do quitosano tiolado - e a uma baixa percentagem de modificação no caso do ácido hialurónico aminado. Seria necessário repetir as reações de modificação de modo a substituir o contra-ião por cloreto e conseguir uma percentagem de modificação mais elevada do ácido hialurónico, respetivamente. De modo a obter uma expressão génica continuada os vectores foram combinados com a integrase do fago phiC31 para promover a integração do transgene no genoma da célula de forma segura e eficaz. A estratégia combinada de entrega baseada em vectores de quitosano e integrase demonstrou expressão génica prolongada tanto de genes de pequena dimensão, como o gene que codifica para a proteína verde fluorescente (com aproximadamente 1 kb) como de genes de maiores dimensões como o gene da proteína centrossomal CEP290 (com aproximadamente 8 kb) várias semanas após a transfeção. A administração subretiniana in vivo dos nossos vetores revelou transfeção eficiente e expressão do transgene continuada em células epiteliais pigmentadas de retina pelo menos 6 meses após a transfeção. Os nossos resultados indicam que esta abordagem baseada em vetores de quitosano pode ultrapassar as limitações de empacotamento encontradas nas técnicas de transferência de genes mediadas por vírus adeno-associados, mantendo um elevado perfil de segurança e expressão génica continuada, constituindo assim uma alternativa para a terapia génica na retina.

FCT - Fundação para a Ciência e Tecnologia