Influência das proteínas motoras e CK2 no processo de interação Leishmania braziliensis-macrófago.

O gênero Leishmania é responsável por um grupo de parasitoses que podem variar desde lesões auto-limitadas até severa injúria de tecido. Estes protozoários são parasitos obrigatoriamente intracelulares, tendo o macrófago como célula hospedeira. Durante o processo de fagocitose os macrófagos utilizam a maquinaria presente em seu citoesqueleto, a qual compreende a participação de miosinas e actinas, para a formação do fagossoma. Estas proteínas estão envolvidas em processos como citocinese, tráfego intracelular de organelas e vesículas, podendo interferir com a penetração do parasito. Alguns trabalhos vêm sendo realizados visando analisar a expressão, localização e o papel de miosina e de actina em Leishamania. Estudos associados à participação destas proteínas motoras em processo vitais para a biologia do parasito podem auxiliar na compreensão de seu ciclo e permitir a geração de conhecimentos que apontem novos alvos para intervenções terapêuticas. Uma vez que a miosina é necessária no transporte intracelular, alguns estudos tentam analisar a expressão e a localização intracelular de miosinas na Leishmania. Estudos mostram a presença de atividades cinásicas do tipo CK2 em diversos tripanossomatídeos, ligadas ao crescimento celular, morfologia e infectividade de promastigotas para macrófagos. Desta maneira, como objetivo desta tese temos o estudo da participação das miosinas, actina e CK2 na infectividade da Leishmania braziliensis. Além disso, investigamos a influência destas proteínas na produção de citocinas pelos macrófagos e em sua atividade microbicida. Lipoxina, latrunculina, nocodazol e TBB promoveram uma inibição de, pelo menos, 50% no crescimento de L. braziliensis. A CK2 secretada pelo parasito foi purificada de seu sobrenadante através de coluna de HPLC e a fração 44 mostrou ser a fração correspondente a esta enzima. A lipoxina e o TBB promoveram a inibição da atividade desta enzima ao contrário da latrunculina que forneceu aumento dessa atividade. O pré-tratamento dos parasitos ou dos macrófagos com lipoxina, latrunculina, nocodazol e TBB promoveram uma inibição de cerca de 50% no índice de associação entre Leishmania e macrófagos não-ativados ou ativados por LPS e IFN-γ. Latrunculina e TBB aumentaram a produção de NO em macrófagos não ativados e não infectados enquanto que em macrófagos ativados à exceção do TBB, todas as drogas diminuíram a produção de NO. A liberação de IL-10 foi diminuída após tratamento com todas as drogas em macrófagos não ativados em ausência de promastigotas e ativados em presença do parasito. Para a produção de TNF-α há uma redução significativa em macrófagos ativados não infectados tratados com latrunculina, nocodazol e TBB. Quando ativados e infectados, os macrófagos tratados com lipoxina tiveram a produção dessa citocina aumentada, ao contrário do TBB em que houve redução. Quando avaliamos a integridade da actina verificamos que todos os compostos foram capazes de influenciar a distribuição dessa proteína, levando a uma redução no índice de associação. Ao transfectarmos a cauda da miosina Va fusionada a GFP nos macrófagos observamos que houve uma diminuição de 94% no índice de associação. Nossos dados confirmam a importância da CK2, actina e miosina Va no processo de interação parasito- macrófago.

The members of the genus Leishmania are responsible for a group of parasitic diseases that vary from self-limited lesions to severe tissue injury. These parasites are obligatory intracellular protozoa that use human macrophages as hosts. Their entry into macrophages occurs through phagocytosis that involves the cytoskeleton, comprised of actin and myosin, to form the phagosomes. Actin and myosin are also involved in other cellular processes including cytokinesis, intracellular trafficking of organelles and vesicles, which may interfere with parasite entry. Previous studies have analyzed the expression, localization and role of both actin and myosin in Leishmania. Their participation in various processes vital to the biology of the parasite suggests new targets for therapeutic intervention. Since myosin is required for intracellular transport, attempts have been made to examine the intracellular localization and expression of Leishmania myosin. Studies have shown the presence of kinase activity of CK2 in various trypanosomes linked to cell growth, morphology and infectivity of macrophages by promastigotes. Therefore, the objective of this thesis was to investigate the role of myosin, actin and CK2 for infectivity of Leishmania brasiliensis. In addition, the influence of these proteins in cytokine production and microbiocidal activity in human macrophages was investigated. Drug-based inhibition using lipoxin, latrunculin, nocodozole and TBB caused at least a 50% decrease in growth of L. brasiliensis. The CK2 secreted by the parasite was purified from the supernatant of cultures by HPLC and fraction 44 was determined to correspond to this protein. Lipoxin and TBB were shown to inhibit CK2 activity, contrary to latrunculin that increased its activity. Pretreatment of parasites or macrophages with either lipoxin, latrunculin, nocodozole or TBB lead to a ~50% decrease in the association index between L. brasiliensis and macrphages, with or without preactivation with LPS and INF-γ. Latrunculin and TBB increased the NO in non-activated macrophages and parasites did not infect activated macrophages treated with latrunculin. The other drugs all decreased the production of NO. The release of IL-10 was decreased after treatment with all drugs in non-activated macrophages in the presence of parasites and in activated macrophages in the presence of parasites. For the production of TNF-α, there was a significant decrease in activated macrophages by latrunculin, nocodozole and TBB. When macrophages were activated and infected, treatment with lipoxin showed an increase in the production of this cytokine, opposite to the reduction observed with TBB. When evaluating the integrity of actin, all compounds were determined to influence the organization of actin leading to a decrease in the association index. The transfection of the tail of myosin Va fused to eGFP into macrophages was observed to decrease the association index by 94%. The data confirm the importance of CK2, actin and myosin Va in the process of interactions between parasites and macrophages.