Predominância de begomovírus em tomateiros na região produtora da Ibiapaba, Ceará, e sua detecção natural em plantas daninhas

O tomateiro, Lycopersicon esculentum Mill., hortaliça de grande importância econômica para o Brasil, apresenta muitos problemas fitossanitários, dentre os quais as viroses. Os vírus associados à cultura no país pertencem aos gêneros Begomovirus, mais frequentemente relatado, Potyvirus, Cucumovirus, Tospovirus e Tobamovirus. No Ceará, apesar de relatos da incidência de viroses em tomateiros na Chapada da Ibiapaba, maior região produtora do estado, há escassez de informações sobre a situação atual da ocorrência de begomovírus, nas diversas lavouras daquele agropólo. Assim, foram objetivos deste trabalho: realizar levantamento da presença de begomovírus nas cultivares e híbridos de tomateiro explorados comercialmente na Ibiapaba; verificar a ocorrência de plantas daninhas infectadas e investigar a transmissão artificial de begomovírus isolados de tomateiro e de plantas daninhas para tomateiro. Os testes sorológicos e a PCR realizados detectaram begomovírus em 'Alambra', 'Densus', 'Monalisa', 'Santa Clara', 'Sheila', 'Sofia', 'Raisa-N' e 'TY- Fanny', cultivares e híbridos mais cultivados nas lavouras. Além de begomovírus, Cucumber mosaic virus (CMV) e Potato virus Y (PVY) foram também detectados. As plantas daninhas Amaranthus spinosus, A. viridis, Ageratum conyzoides e Bidens pilosa foram identificadas como hospedeiras naturais de begomovírus. A transmissão de begomovírus de tomateiro para tomateiro ocorreu em inoculações por enxertia e via extrato foliar e de plantas daninhas infectadas para tomateiros sadios somente por enxertia. O levantamento revelou que, à semelhança do que ocorre no restante do país, begomovírus são predominantes nas lavouras de tomate da Ibiapaba e que as plantas invasoras ali encontradas podem ser fontes de infecção viral para a cultura.

Identificação do Vírus do Frisado Amarelo do Tomateiro (TYLCV) e do Vírus do Mosaico do Tomateiro (ToMV), na Cultura de Tomate na Ilha Santiago, Cabo Verde.

Sintomas atribuídos ao vírus do Frisado Amarelo do Tomateiro (TYLCV) e ao vírus do Mosaico do Tomateiro (ToMV) são frequentemente registados em solanáceas em Cabo Verde e a eles associam-se prejuízos em culturas, sobretudo de tomate. Para confirmar a presença de TYLCV e ToMV em solanáceas em Cabo Verde, avaliaram-se por teste DAS-ELISA 16 amostras de plantas das espécies Solanum lycopersicum, S. melanogena, Capsicum annum e C. frutescens com sintomas de viroses. Determinou-se ainda a presença de TYLCV e ToMV em seis lotes de sementes de três cultivares de tomateiro, “Calor”, “CV01” e “Produtor”, produzidas no país em 2008 e 2009 e em plantas provenientes dessas sementes. Finalmente avaliou-se a incidência de viroses e a produtividade em ensaios instalados com plantas obtidas dessas sementes. TYLCV foi encontrado em 10 das amostras de solanáceas estudadas, constituindo S. lycopersicum, S. melanogena e C. annum plantas hospedeiras do vírus em Cabo Verde. Por sua vez, ToMV foi registado numa amostra de S. lycopersicum. TYLCV foi detectado em sementes das três cultivares estudadas e ToMV nas sementes da cv. CV01. Nos ensaios de campo detectou-se apenas TYLCV que surgiu em amostras de plantas de todas as modalidades (cultivar x ano da semente). A média da incidência de viroses registada nos ensaios de campo foi de 0,8% na cv. CV01, 44,5% na cv. Produtor e 51,5% na cv. Calor e as médias das produções no ensaio de S. Domingos foram de 20,6 t/ha em ‘CV01’, 17,4 t/ha em ‘Produtor’ e 11,6 t/ha em ‘Calor’. Mostrou-se que “Tomatinho”, variedade espontânea de S. lycopersicum, e plantas de S. melanogena que são mantidas nos campos para além do ciclo do tomateiro aparecem infectadas por TYLCV, constituindo importante reservatório do vírus.

Surto epidemiológico do vírus do mosaico amarelo do pimentão em tomateiro na região serrana do Espírito Santo

Este trabalho relata a ocorrência de um surto epidemiológico causado pelo vírus do mosaico amarelo do pimentão (Pepper yellow mosaic virus - PepYMV) em tomateiro (Lycopersicon esculentum) 'Alambra' na região serrana do Estado do Espírito Santo. Os sintomas consistiam de mosaico, definhamento e redução de produção. Visando a caracterização do agente causal foram realizados estudos sorológicos por ELISA, observações ao microscópio eletrônico e determinação da gama parcial de hospedeiros. Ao microscópio eletrônico de transmissão foram observadas, em amostras de tomateiro, partículas alongadas e flexuosas e inclusões cilíndricas típicas de vírus do gênero Potivirus. O PepYMV foi confirmado como agente causal por ELISA indireto. Levantamentos realizados em campos de cultivo demonstraram que a disseminação do vírus é muito rápida. Este é o primeiro relato da ocorrência do PepYMV na cultura do tomate no Brasil, causando sérios danos.

Análise ultra-estrutural de folhas de três espécies de Solanaceae após inoculação com o vírus da necrose branca do tomateiro (VNBT - Tymovirus)

Foi estudada a ultra-estrutura foliar das solanáceas Nicotiana glutinosa L., Lycopersicon pimpinellifolium L. e Physalis angulata L. inoculadas com o vírus da necrose branca do tomateiro (VNBT - Tymovirus). As plantas mantidas em casa-de-vegetação com temperatura constante de 25 °C foram inoculadas quando apresentavam três a quatro folhas totalmente expandidas. Quinze dias após a inoculação, foram coletadas amostras do terço médio do limbo da 3ª ou da 4ª folha a partir do ápice. As amostras foram preparadas para análise em microscopia eletrônica de transmissão segundo técnicas convencionais. A análise ultra-estrutural das células do clorênquima revelou principalmente vesiculação e vacuolação dos cloroplastos e de mitocôndrias, além da ocorrência de corpos multivesiculares e ligeira dilatação dos plasmodesmos em N. glutinosa e L. pimpinellifolium. Nestas duas espécies foram observadas "virus-like-particles" no citoplasma e nos vacúolos. Plantas de P. angulata não mostraram alterações de ultra-estrutura. As observações macroscópicas, os testes de retroinoculação e as análises ultra-estruturais revelaram sintomas locais e sistêmicos em N. glutinosa, latência em L. pimpinellifolium e imunidade em P. angulata.

Análise ultra-estrutural de folhas de três espécies de Solanaceae após inoculação com o vírus da necrose branca do tomateiro (VNBT - Tymovirus)

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Marcador microssatélite associado ao alelo Ty-1 de resistência a Begomovirus em tomateiro

O objetivo deste trabalho foi associar um marcador microssatélite ao alelo Ty-1 de resistência a Begomovirus em tomateiro, e avaliar a eficiência desta associação na seleção de linhagens resistentes ao vírus. Os marcadores SSR-47 e SSR-48 foram testados em linhagens isogênicas contrastantes quanto à presença do alelo Ty-1 (LA-3473, LA-3474, LA-3475). O marcador SSR-47, por ter detectado polimorfismo nas linhagens, foi o único utilizado nas etapas subsequentes da pesquisa. Detectada a associação entre o SSR-47 e o alelo Ty-1, testou-se sua eficiência na seleção de genótipos avançados de tomateiro. Para confirmar a eficiência da seleção, foi realizada a avaliação fenotípica das plantas com padrões contrastantes de bandas para SSR-47, quanto à resistência a Begomovirus. Plantas que apresentaram banda única de 191 pb foram resistentes ao Begomovirus, pelo teste de inoculação por enxertia; aquelas com banda única de 180 pb foram suscetíveis; e as plantas com bandas de 191 e 180 pb foram resistentes. A distância máxima entre o Ty-1 e o marcador SSR-47 foi de 2,7 cM. Este marcador foi efetivo em caracterizar genótipos portadores do alelo Ty-1. As respostas das plantas à infecção pelo Begomovirus, induzida via enxertia, são consistentes com as reações previstas com o uso do marcador molecular SSR-47.

Resistência de genótipos de tomateiro a um isolado de geminivírus do cinturão verde de Campinas, São Paulo

Plantas de tomateiro (Lycopersicon esculentum) apresentando sintomas de amarelecimento do limbo foliar principalmente nas nervuras, redução de crescimento e distorções foliares foram coletadas em lavouras do cinturão verde de Campinas, São Paulo, e mantidas no Centro Experimental de Campinas (IAC), para utilização em experimentos de avaliação de resistência de genótipos à virose. A partir de análises moleculares, o vírus foi identificado como Tomato yellow vein streak virus (TYVSV). Foram feitas avaliações em campo (infecção natural) e em telado (infecção natural e controlada), usando-se diversos genótipos, abrangendo cultivares, híbridos, linhagens e populações, além de espécies selvagens de tomateiro. Alguns dos genótipos e híbridos contêm o gene de resistência Ty-1. Em campo, destacou-se o híbrido 'BX 1016158' com as menores incidências de doença. Em telado (infecção natural), híbridos interespecíficos de L. esculentum x L. peruvianum, e a linhagem PI 134417 (L. hirsutum) mostraram-se os mais resistentes ao isolado. O método de avaliação precoce em telado (infecção controlada) mostrou-se adequado para discriminar genótipos resistentes ao isolado. Por meio desse método, constatou-se a resistência das linhagens 'LA 444-1' (L. peruvianum), F4(TySw5) e a série IAC 14-2, e dos híbridos 'Franco' e BX1653088 ('Densus'), os quais receberam notas próximas de um ou não apresentaram sintomas.

Caracterização de uma nova estirpe do Tomato mosaic virus isolada de tomateiro no Estado de São Paulo

Um vírus isolado em Guaratinguetá, SP, de tomateiro (Lycoporsicon esculentum) 'Santa Clara' com sintomas característicos de virose, foi estudado por meio de plantas indicadoras e de hospedeiras diferenciais pertencentes a linhagens homozigotas de tomateiro, ensaios de estabilidade in vitro, purificação, contrastação negativa, testes sorológicos de ELISA-PTA e imunomicroscopia eletrônica, utilizando-se anti-soros contra diferentes vírus do gênero Tobamovirus. O isolado infetou plantas de espécies de amarantáceas, quenopodiáceas e solanáceas. Plantas de Chenopodium amaranticolor reagiram com sintomas locais e sistêmicos; Nicotiana sylvestris e N. rustica reagiram com lesões locais e a linhagem homozigota de tomateiro Tm-2 mostrou-se imune ao vírus. Nas preparações purificadas de contrastação negativa, foram observadas partículas rígidas e alongadas com cerca de 300 nm. O isolado foi identificado como um tobamovírus, com anti-soros contra o Tomato mosaic virus (ToMV) e Tobacco mosaic virus (TMV). As hospedeiras diferenciais indicaram se tratar de ToMV. Por meio de RT-PCR, com oligonucleotídeos para o gene da capa protéica de espécies do gênero Tobamovirus do subgrupo 1, amplificaram-se fragmentos com 850 pb que foram clonados e seqüenciados. A similaridade de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos variou entre 85 e 91% quando a seqüência do ToMV-SP foi comparada com outras sequências de ToMV, 75 e 83% quando comparada com as do TMV e 67 e 72% quando comparada com a do Odontoglossum ringspot virus (ORSV). As comparações com outras espécies de tobamovírus apresentaram valores de similaridade inferiores a 65%. Confirmou-se a identidade dos vírus como sendo uma nova estirpe do ToMV.

Estudo da interação de um begomovírus isolado de tomateiro com a mosca branca

No estudo da interação de um begomovírus isolado de tomateiro (Lycopersicon esculentum) em Anápolis-GO, denominado GO-ANPL (taxonomicamente relacionado ao Tomato rugose mosaic virus, ToRMV) com o vetor Bemisia tabaci biótipo B, determinaram-se o período de acesso de aquisição do vírus (PAA), o período de acesso de inoculação (PAI), o período de latência (PL), a sua retenção e transmissão à progênie. Nos experimentos empregaram-se plantas de tomateiro 'Santa Clara' e cinco insetos por planta. Constatou-se um PAA mínimo de 15 min com o qual 6% dos tomateiros foram infetados. Este percentual aumentou para 65% quando o PAA foi estendido para 24 h. O PAI mínimo foi de 30 min registrando-se 18% de infecção, o qual foi elevado para 67% com 24 h de PAI. Observou-se o término do PL 16 h após o vetor adquirir o vírus. Na detecção do GO-ANPL no vetor via PCR, testes com mais de 2.500 espécimens constataram o vírus em ninfas desenvolvidas em tomateiro infetado, em adultos com diferentes PAAs, mas não em ovos de fêmeas avirulíferas ovipositados em planta infetada. Observou-se a passagem transestadial em 100% dos adultos testados que transmitiram o vírus em 33% dos casos. Evidenciou-se a transmissão à progênie pela detecção do vírus em ovos, ninfas e adultos provenientes de fêmeas virulíferas, contudo, a transmissão do vírus pelos adultos não foi observada. Os resultados obtidos indicam que a interação vírus-vetor é estabelecida desde a fase inicial do desenvolvimento do inseto e podem ser considerados relevantes para os estudos epidemiológicos dos begomovírus associados ao biótipo B de B. tabaci no país.

Espécies vegetais hospedeiras de begomovírus isolados de tomateiro em Goiás e no Distrito Federal

A determinação da gama de hospedeiros de begomovírus isolados de tomateiro (Lycopersicon esculentum) é de elevada importância nos estudos conduzidos com esses patógenos, uma vez que contribui para o entendimento da larga disseminação dos vírus em condições de campo e oferece subsídios para o estudo da variabilidade genética de espécies e estirpes identificadas em diversas regiões do país. Visando a determinação e a comparação da gama de hospedeiros de dois isolados de begomovírus de tomateiro obtidos de lavouras da região de Anápolis-GO (GO-ANPL) e do Distrito Federal (DF-BR2) inocularam-se 31 espécies vegetais pertencentes a oito famílias botânicas, sob duas modalidades de inoculação: mecânica e com a mosca branca, Bemisia tabaci biótipo B. Constatou-se que o GO-ANPL e o DF-BR2 infetaram exclusivamente plantas da família Solanaceae como Datura stramonium, Nicandra physalodes e Nicotiana benthamiana. Para o GO-ANPL, o número de espécies vegetais infetadas com o emprego do inseto vetor foi superior ao obtido pela inoculação mecânica, diferindo dos resultados obtidos para o DF-BR2 em que as plantas hospedeiras foram igualmente infetadas em ambos os métodos de inoculação. A comparação entre as hospedeiras dos dois isolados e destes com as de outros begomovírus de tomateiro da região Nordeste revelaram que há variação tanto nas espécies hospedeiras como na sintomatologia exibida pelas plantas infetadas. Os testes foram todos confirmados com hibridização com sondas moleculares, em "dot blot".

Resistência de cultivares e linhagens de tomateiro a Tomato chlorotic spot virus e a Potato virus Y

Linhagens avançadas do programa de melhoramento do tomateiro (Lycopersicon esculentum) do IAC foram avaliadas em condições de campo em Campinas (SP) para resistência a tospovírus e a potyvírus, nos anos agrícolas 2002/2003 e 2003/2004, respectivamente. No primeiro ano, a única espécie de tospovírus que ocorreu na área experimental foi Tomato chlorotic spot virus (TCSV). As sete linhagens do grupo IAC exibiram baixa porcentagem de plantas sintomáticas em duas avaliações, com médias abaixo de 28%; as cultivares testadas mostraram-se altamente suscetíveis, com médias acima de 85%, à exceção de 'Franco', que apresentou cerca de 55% de infecção. No segundo experimento, conduzido em 2003/2004, dez linhagens do grupo IAC foram comparadas com cinco cultivares de polinização aberta e híbridos F1, além do acesso LA-444-1 de L. peruvianum. Nesse experimento, por meio de testes biológicos e sorológicos, verificou-se ocorrência generalizada de Potato virus Y (PVY). Foi determinado o percentual de plantas com sintomas e avaliada a intensidade dos sintomas mediante uso de escala de notas. Com base nos dois critérios, verificou-se que LA-444-1 apresenta alta resistência a PVY, que 'Tyrade' exibe comportamento intermediário, enquanto todos os demais genótipos demonstram alta suscetibilidade ao vírus. O comportamento dos genótipos avaliados neste trabalho mostra a necessidade de se considerar, nos programas de melhoramento do tomateiro, a introgressão de fatores de resistência não só a vírus de importância atual nas regiões produtoras, como geminivírus, mas também a outros vírus potencialmente nocivos à cultura, como tospovírus e potyvírus.

Hipersensibilidade e necrose sistêmica em Nicotiana benthamiana transformada com o gene de resistência Sw-5 de tomateiro

O gene Sw-5 do tomateiro confere resistência a várias espécies de tospovírus e codifica uma proteína contendo domínios de ligação a nucleotídeos e repetições ricas em leucina. Tomateiros com Sw-5 exibem reações necróticas nas folhas inoculadas com tospovírus. Estas reações e a estrutura da proteína Sw-5 indicam que a resistência ocorre por meio do reconhecimento do patógeno e desencadeamento da resposta de hipersensibilidade. A capacidade de Sw-5 de conferir resistência a tospovírus em tabaco selvagem (Nicotiana benthamiana Domin.) foi avaliada em plantas transgênicas. Uma construção com a seqüência aberta de leitura de Sw-5 e sua região 3’ não-traduzida sob controle do promotor 35S do CaMV foi utilizada para transformação de N. benthamiana via Agrobacterium tumefaciens. Plantas de progênies R1 foram inoculadas com um isolado de tospovírus e avaliadas quanto à ocorrência de reação de hipersensibilidade e resistência à infecção sistêmica. Em uma progênie com segregação 3:1 (resistente:suscetível), foi selecionada uma planta homozigota e sua progênie avaliada quanto ao espectro da resistência a tospovírus. Plantas com o transgene exibiram resposta de hipersensibilidade 48 h após a inoculação, sendo resistentes à infecção sistêmica. O fenótipo da resistência foi dependente do isolado viral e um isolado de Tomato chlorotic spot virus (TCSV) causou necrose sistêmica em todas as plantas inoculadas, enquanto que isolados de Groundnut ringspot virus (GRSV) e um isolado relacionado a Chrysanthemum stem necrosis virus (CSNV) ficaram restritos ao sítio de infecção. Comparações do espectro da resistência obtido neste trabalho com aquele observado em outros membros da família Solanaceae indicam que as vias de transdução de sinais e as respostas de defesa ativadas por Sw-5 são conservadas dentro desta família e polimorfismos genéticos nas vias de transdução de sinais ou em componentes das respostas de defesa podem resultar em diferentes níveis de resistência.

Diversidade genética de begomovírus em cultivos de tomateiro no Centro-Oeste Paulista

A diversidade genética de vírus pertencentes ao gênero Begomovirus em tomateiro (Lycopersicon esculentum Mill) foi analisada em regiões produtoras do Centro-Oeste paulista. No período de janeiro de 2003 a fevereiro de 2004, cento e sessenta e seis amostras de tomate foram coletadas e a presença de begomovírus observada em 60% das amostras, por PCR, utilizando-se oligonucleotídeos universais para o gênero Begomovirus. O sequenciamento direto do produto de PCR de 16 dessas amostras indicou a possível presença do Tomato severe rugose virus (ToSRV), Sida mottle virus (SiMoV-[BR]) e da espécie tentativa Tomato yellow vein streak virus (ToYVSV-[BR]). Em duas amostras foi detectada uma possível nova espécie de begomovírus. A presença do ToSRV e do SiMoV ainda não havia sido verificada em tomateiro no estado de São Paulo. Estes resultados indicam a existência de diversidade de espécies de begomovírus infectando o tomateiro nesta região, servindo como um alerta para melhoristas que trabalham na busca de fontes de resistência a esse importante grupo de patógenos.

Dinâmica temporal e espacial da begomovirose causada por Tomato yellow vein streak virus em tomateiro na região de Campinas-SP

O objetivo desse trabalho foi caracterizar os padrões temporal e espacial do Tomato yellow vein streak virus (ToYVSV) em tomatais cultivados em condições de campo, no município de Sumaré, e de estufa plástica, na região de Elias Fausto, Estado de São Paulo. No ensaio de campo, plantado com a variedade Alambra, foram avaliadas 4.032 plantas, distribuídas em oito blocos. Em oito estufas plásticas, com plantios escalonados da variedade Ikram, foram avaliadas 6.016 plantas. As avaliações foram feitas com base nos sintomas característicos induzidos por esse vírus. A confirmação da identidade do vírus foi feita por meio da análise da seqüência de nucleotídeos de parte do DNA-A viral (genes AV1 e AC3). No ensaio em condições de campo, a incidência da doença evoluiu lentamente, desde um mínimo de 0,002 (proporção de plantas sintomáticas) até um máximo de 0,0497. Mesmo assim, foi possível constatar um efeito de borda, pois a incidência média de plantas doentes nos blocos situados nos bordos da área foi 2,1 vezes maior do que naqueles internos. O progresso da incidência da doença foi linear, o que indica que novas infecções foram devidas principalmente a um influxo constante de vetores virulíferos de fora para dentro da área avaliada. Nos plantios em estufas plásticas, os níveis finais de doença foram fortemente dependentes da época de plantio, com médias variando de 4,8% a 69,3%. A distribuição espacial de plantas sintomáticas nesses plantios foi fortemente agregada. Essa agregação provavelmente não se deve a infecções secundárias dentro das estufas plásticas, mas sim à concentração de plantas sintomáticas nos bordos das estufas, conseqüência da migração de vetores virulíferos a partir de áreas externas à estufa. Com base nesses resultados, sugere-se a eliminação de fontes de inóculo representadas por plantios mais velhos de tomateiro e por hospedeiras do vírus na vegetação espontânea como uma das principais medidas para o manejo da doença.

Hipersensibilidade e necrose sistêmica em Nicotiana benthamiana transformada com o gene de resistência Sw-5 de tomateiro

O gene Sw-5 do tomateiro confere resistência a várias espécies de tospovírus e codifica uma proteína contendo domínios de ligação a nucleotídeos e repetições ricas em leucina. Tomateiros com Sw-5 exibem reações necróticas nas folhas inoculadas com tospovírus. Estas reações e a estrutura da proteína Sw-5 indicam que a resistência ocorre por meio do reconhecimento do patógeno e desencadeamento da resposta de hipersensibilidade. A capacidade de Sw-5 de conferir resistência a tospovírus em tabaco selvagem (Nicotiana benthamiana Domin.) foi avaliada em plantas transgênicas. Uma construção com a seqüência aberta de leitura de Sw-5 e sua região 3 não-traduzida sob controle do promotor 35S do CaMV foi utilizada para transformação de N. benthamiana via Agrobacterium tumefaciens. Plantas de progênies R1 foram inoculadas com um isolado de tospovírus e avaliadas quanto à ocorrência de reação de hipersensibilidade e resistência à infecção sistêmica. em uma progênie com segregação 3:1 (resistente:suscetível), foi selecionada uma planta homozigota e sua progênie avaliada quanto ao espectro da resistência a tospovírus. Plantas com o transgene exibiram resposta de hipersensibilidade 48 h após a inoculação, sendo resistentes à infecção sistêmica. O fenótipo da resistência foi dependente do isolado viral e um isolado de Tomato chlorotic spot virus (TCSV) causou necrose sistêmica em todas as plantas inoculadas, enquanto que isolados de Groundnut ringspot virus (GRSV) e um isolado relacionado a Chrysanthemum stem necrosis virus (CSNV) ficaram restritos ao sítio de infecção. Comparações do espectro da resistência obtido neste trabalho com aquele observado em outros membros da família Solanaceae indicam que as vias de transdução de sinais e as respostas de defesa ativadas por Sw-5 são conservadas dentro desta família e polimorfismos genéticos nas vias de transdução de sinais ou em componentes das respostas de defesa podem resultar em diferentes níveis de resistência.