Analysis of the Nicotiana tabacum Stigma/Style Transcriptome Reveals Gene Expression Differences between Wet and Dry Stigma Species

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Nicotiana tabacum as an experimental host for the study of plant-Xylella fastidiosa interactions

Xylella fastidiosa causes citrus variegated chlorosis (CVC). Information generated from the X. fastidiosa genome project is being used to study the underlying mechanisms responsible for pathogenicity. However, the lack of an experimental host other than citrus to study plant-X. fastidiosa interaction has been an obstacle to accelerated progress in this area. We present here results of three experiments that demonstrated that tobacco could be an important experimental host for X. fastidiosa. All tobacco plants inoculated with a citrus strain of X. fastidiosa expressed unequivocal symptoms, consisting of orange leaf lesions, approximately 2 months after injection of the pathogen. CVC symptoms were observed in citrus 3 to 6 months after inoculation. The pathogen was readily detected in symptomatic tobacco plants by polymerase chain reaction (PCR) and phase contrast microscopy. In addition, X. fastidiosa was reisolated on agar plates in 4 of 10 plants. Scanning electron microscopy analysis of cross sections of stems and petioles revealed the presence of rod shaped bacteria restricted to the xylem of inoculated plants. The cell size was within the limit typical of X. fastidiosa.

Overexpression of mitochondrial uncoupling protein 1 (UCP1) induces a hypoxic response in Nicotiana tabacum leaves

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Targeting dsRNA-specific single-chain Fv antibody fragments to different cellular locations in Nicotiana tabacum L.

Expression of antibodies or antibody fragments in plants is a useful tool for producing active antibody derivatives for diagnostic or pharmaceutical purposes as well as for immunomodulation. We investigated the effect of cellular expression site on the stability and yield of double-stranded RNA (dsRNA)-specific single-chain Fv-fragments (scFv) in transgenic tobacco. Two antibodies (J2 and P6) belonging to the V23(J558) heavy chain variable gene family but differing in the light chain variable domain were used. scFvs were targeted to the cytoplasm – with or without anchoring them in the plasma membrane –, into the endoplasmic reticulum (ER) and to the apoplast. Although high mRNA concentrations were detected in all cases, scFv proteins accumulated only when scFvs were made ER-resident by appropriate signal sequences. When the ER retention signal was removed to allow scFv-secretion to the apoplast, no scFv-proteins were detected. Despite the strong homology of the VH-sequences of J2 and P6 antibodies, only P6 provided a stable scFv scaffold for intracytoplasmic expression. J2-scFv could not be stabilised neither by adding a C-terminal stabilisation signal nor by anchoring the protein at the cytoplasmic side of the plasma membrane (PM). It was found that dsRNA-specific J2-scFvs are active in vivo and enhance Potato Virus Y induced symptoms in infected tobacco. This is the first report describing the expression and biological effect of RNA-specific antibodies in plants.

Characterisation of the tritrophic interactions between tobacco yellow dwarf virus, its vector and host-plants

Tobacco yellow dwarf virus (TbYDV, family Geminiviridae, genus Mastrevirus) is an economically important pathogen causing summer death and yellow dwarf disease in bean (Phaseolus vulgaris L.) and tobacco (Nicotiana tabacum L.), respectively. Prior to the commencement of this project, little was known about the epidemiology of TbYDV, its vector and host-plant range. As a result, disease control strategies have been restricted to regular poorly timed insecticide applications which are largely ineffective, environmentally hazardous and expensive. In an effort to address this problem, this PhD project was carried out in order to better understand the epidemiology of TbYDV, to identify its host-plant and vectors as well as to characterise the population dynamics and feeding physiology of the main insect vector and other possible vectors. The host-plants and possible leafhopper vectors of TbYDV were assessed over three consecutive growing seasons at seven field sites in the Ovens Valley, Northeastern Victoria, in commercial tobacco and bean growing properties. Leafhoppers and plants were collected and tested for the presence of TbYDV by PCR. Using sweep nets, twenty-three leafhopper species were identified at the seven sites with Orosius orientalis the predominant leafhopper. Of the 23 leafhopper species screened for TbYDV, only Orosius orientalis and Anzygina zealandica tested positive. Forty-two different plant species were also identified at the seven sites and tested. Of these, TbYDV was only detected in four dicotyledonous species, Amaranthus retroflexus, Phaseolus vulgaris, Nicotiana tabacum and Raphanus raphanistrum. Using a quadrat survey, the temporal distribution and diversity of vegetation at four of the field sites was monitored in order to assess the presence of, and changes in, potential host-plants for the leafhopper vector(s) and the virus. These surveys showed that plant composition and the climatic conditions at each site were the major influences on vector numbers, virus presence and the subsequent occurrence of tobacco yellow dwarf and bean summer death diseases. Forty-two plant species were identified from all sites and it was found that sites with the lowest incidence of disease had the highest proportion of monocotyledonous plants that are non hosts for both vector and the virus. In contrast, the sites with the highest disease incidence had more host-plant species for both vector and virus, and experienced higher temperatures and less rainfall. It is likely that these climatic conditions forced the leafhopper to move into the irrigated commercial tobacco and bean crop resulting in disease. In an attempt to understand leafhopper species diversity and abundance, in and around the field borders of commercially grown tobacco crops, leafhoppers were collected from four field sites using three different sampling techniques, namely pan trap, sticky trap and sweep net. Over 51000 leafhopper samples were collected, which comprised 57 species from 11 subfamilies and 19 tribes. Twentythree leafhopper species were recorded for the first time in Victoria in addition to several economically important pest species of crops other than tobacco and bean. The highest number and greatest diversity of leafhoppers were collected in yellow pan traps follow by sticky trap and sweep nets. Orosius orientalis was found to be the most abundant leafhopper collected from all sites with greatest numbers of this leafhopper also caught using the yellow pan trap. Using the three sampling methods mentioned above, the seasonal distribution and population dynamics of O. orientalis was studied at four field sites over three successive growing seasons. The population dynamics of the leafhopper was characterised by trimodal peaks of activity, occurring in the spring and summer months. Although O. orientalis was present in large numbers early in the growing season (September-October), TbYDV was only detected in these leafhoppers between late November and the end of January. The peak in the detection of TbYDV in O. orientalis correlated with the observation of disease symptoms in tobacco and bean and was also associated with warmer temperatures and lower rainfall. To understand the feeding requirements of Orosius orientalis and to enable screening of potential control agents, a chemically-defined artificial diet (designated PT-07) and feeding system was developed. This novel diet formulation allowed survival for O. orientalis for up to 46 days including complete development from first instar through to adulthood. The effect of three selected plant derived proteins, cowpea trypsin inhibitor (CpTi), Galanthus nivalis agglutinin (GNA) and wheat germ agglutinin (WGA), on leafhopper survival and development was assessed. Both GNA and WGA were shown to reduce leafhopper survival and development significantly when incorporated at a 0.1% (w/v) concentration. In contrast, CpTi at the same concentration did not exhibit significant antimetabolic properties. Based on these results, GNA and WGA are potentially useful antimetabolic agents for expression in genetically modified crops to improve the management of O. orientalis, TbYDV and the other pathogens it vectors. Finally, an electrical penetration graph (EPG) was used to study the feeding behaviour of O. orientalis to provide insights into TbYDV acquisition and transmission. Waveforms representing different feeding activity were acquired by EPG from adult O. orientalis feeding on two plant species, Phaseolus vulgaris and Nicotiana tabacum and a simple sucrose-based artificial diet. Five waveforms (designated O1-O5) were observed when O. orientalis fed on P. vulgaris, while only four (O1-O4) and three (O1-O3) waveforms were observed during feeding on N. tabacum and the artificial diet, respectively. The mean duration of each waveform and the waveform type differed markedly depending on the food source. This is the first detailed study on the tritrophic interactions between TbYDV, its leafhopper vector, O. orientalis, and host-plants. The results of this research have provided important fundamental information which can be used to develop more effective control strategies not only for O. orientalis, but also for TbYDV and other pathogens vectored by the leafhopper.

Expression of HPV-11 L1 protein in transgenic Arabidopsis thaliana and Nicotiana tabacum

Background We have investigated the possibility and feasibility of producing the HPV-11 L1 major capsid protein in transgenic Arabidopsis thaliana ecotype Columbia and Nicotiana tabacum cv. Xanthi as potential sources for an inexpensive subunit vaccine. Results Transformation of plants was only achieved with the HPV-11 L1 gene with the C-terminal nuclear localization signal (NLS-) encoding region removed, and not with the full-length gene. The HPV-11 L1 NLS- gene was stably integrated and inherited through several generations of transgenic plants. Plant-derived HPV-11 L1 protein was capable of assembling into virus-like particles (VLPs), although resulting particles displayed a pleomorphic phenotype. Neutralising monoclonal antibodies binding both surface-linear and conformation-specific epitopes bound the A. thaliana-derived particles and - to a lesser degree - the N. tabacum-derived particles, suggesting that plant-derived and insect cell-derived VLPs displayed similar antigenic properties. Yields of up to 12 μg/g of HPV-11 L1 NLS- protein were harvested from transgenic A. thaliana plants, and 2 μg/g from N. tabacum plants - a significant increase over previous efforts. Immunization of New Zealand white rabbits with ∼50 μg of plant-derived HPV-11 L1 NLS- protein induced an antibody response that predominantly recognized insect cell-produced HPV-11 L1 NLS- and not NLS+ VLPs. Evaluation of the same sera concluded that none of them were able to neutralise pseudovirion in vitro. Conclusion We expressed the wild-type HPV-11 L1 NLS- gene in two different plant species and increased yields of HPV-11 L1 protein by between 500 and 1000-fold compared to previous reports. Inoculation of rabbits with extracts from both plant types resulted in a weak immune response, and antisera neither reacted with native HPV-11 L1 VLPs, nor did they neutralise HPV-11 pseudovirion infectivity. This has important and potentially negative implications for the production of HPV-11 vaccines in plants. © 2007 Kohl et al; licensee BioMed Central Ltd.

Efectos del hombre grande (Quassia amara), tabaco (Nicotiana tabacum) y neem (Azadirachta indica) en el control de garrapatas del ganado bovino en la Finca Puerto Rico, municipio de Matiguás, departamento de Matagalpa

Con la finalidad de buscar alternativas con productos de origen natural para el control de garrapatas en bovinos, se realizó un experimento en la finca "Puerto Rico" localizada en las coordenadas 12" 48'18" latitud norte y 85" 23' 39" longitud oeste, en la comarca las Limas a llKms del municipio de Matiguás, departamento de Matagalpa, Nicaragua, donde se usaron extractos de las plantas: hombre grande (Quassia amara), tabaco (Nicotiana tabacum) y neem (Azadirachta indica), al 0.15% para evaluar su efecto acaricida. Se utilizó un diseño completamente aleatorio (DCA), para lo cual se tomaron 60 novillos que se dividieron en 4 grupos conformados por 15 animales cada uno, a los que se les aplicó los tratamientos con las plantas antes mencionadas y un grupo que no recibió ningún tratamiento y que fue considerado como testigo, la aplicación de los tratamientos se hizo por medio de baños por aspersión con mochila de fumigar a los 1 y 21 días. Se realizó recuento de garrapatas antes de realizar el primer baño a los animales y a los 7, 21 y 30 días post tratamiento. El análisis estadístico se hizo utilizando el programa SAS (Stadistic Analisis System), con el cual se realizó análisis de varianza (ANDEVA). Cuando se determinó que existían diferencias significativas en las fechas de recuento, áreas de recuento y tratamientos aplicados, se procedió a realizar separaciones de medias con la prueba de Duncan. De los 3 productos utilizados en el experimento, por el comportamiento demostrado entre cada periodo aplicado, el extracto acuoso de tabaco demostró ser el más efectivo, siguiéndolo en orden de importancia el extracto acuoso de hombre grande y por último el extracto acuoso de aceite de neem al 0.15%.

Efecto de la distancia de siembra en el rendimiento de dos variedades de tabaco (Nicotiana tabacum L.) burley

Durante el ciclo agrícola 1993-1994, en la localidad de Estelí, se realizó un experimento para determinar el efecto de tres distancias de siembra (0.51 m x 1.0 m, 0.56 m x 1.0 m y 0.61 m x 1.0 m) sobre los rendimientos en cantidad y calidad de dos variedades de tabaco (Nicotiana tabacum L.) Burley KY-17 y Burley TN-90. Se empleó un diseño experimental de Bloques al Azar con arreglo combinatorio bifactorial. Los resultados obtenidos no demostraron diferencias significativas en los rendimientos por unidad de área (kg/ha) ni de calidad entre las dos variedades de tabaco y las diferentes distancias de siembra estudiadas. Se logró determinar una relación directa entre el rendimiento en peso seco por unidad de área y el aumento de la densidad poblacional como producto de las distancias de siembra entre planta y planta. La mejor relación beneficio/costo se estableció con la interacción Burley TN-90 con estructura de siembra 0.51 m x 1.0 m.

Determinación de los niveles críticos fósforo, potasio y curva de respuesta al nitrógeno, en el cultivo de tabaco (Nicotiana tabacum L)

Durante el cíclo agrícola 1990-1991 se realizaron 38 experimentos en las localidades de Jalapa, Condega y Estelí, con el objetivo de determinar el nivel crítico para el Fósforo y el Potasio, además de la curva de respuesta al Nitrógeno en el cultivo de tabaco. El diseño experimental usado fue el de ensayos dispersos, descritos en el boletín No. 11 de la FAO, en el cual los tratamientos evaluados fueron: 0-0-0, 90-45-0 y 90-45-60. Los mejores resultados obtenidos se dieron con las aplicaciones de 90 y 45 kg/ha de Nitrógeno y Fósforo, tanto para producción como para calidad. Aplicaciones de Potasio en suelos de contenido mayor que 1 meq de k/100 gr de suelo redujeron de manera no significativa los rendimientos y la calidad del tabaco.

Estudios preliminares para determinar las causas que provocan la mancha verde en los tabacos negros (Nicotiana tabacum L.) en la región I

Durante el periodo comprendido entre 1986 y 1990 se realizaron seis trabajos de investigación en el tabaco negro (Nicotiana. ta.ba.cum L.) variedad S-98, con el objetivo de estudiar las causas que provocan la mancha verde. El estudio se inició en el ciclo 1986-1987 con tres trabajos simultáneos ubicados en Esteli y Jalapa, uno a nivel de macetera para determinar el efecto en términos seneralea del suelo, agua y medio ambiente. Otro a nivel de campo realizado en tres fincas de Esteli y tres de Jalapa donde se analizaron loe elementos minerales, lo que incluyó análisis de macro micronutrientea del suelo y hojas, análisis de calidad del agua y agroquimicos. El tercero consistió en un análisis de residuos de plaguicidas en el suelo y agua que descartara la posibilidad de un efecto fitotóxico en las plantas de tabáco. Como resultado de estos trabajos se descartó el suelo y el agua como un factor que incidiera en la mancha verde; pero si se observó una relación entre la cantidad de polvo aplicado, su frecuencia y el porciento de afectación, por lo que se decidió evaluar en el siguiente ciclo (1987-1988) la influencia de tres tratamientos en polvo (zineb, propineb y bentonita) con diferente número de aplicaciones (2, 4, 8 y 12). Los resultados indicaron que las parcelas tratadas con bentonita presentaron los mayores porcentajes de hojas con síntomas de mancha verde y que esto se relacionaba con la cantidad de producto aplicado. No obstante, producto de la disposición, tamaño de las parcelas y dificultades de la aplicación, se pudo apreciar que existió movimiento de producto de una parcela a otra. Por este motivo se programó otro experimento bajo condiciones de aislamiento. El ensayo se estableció a nivel de macetera en el Centro Experimental de Estelí para determinar en condiciones de aplicación controlada el efecto de la bentonita y su número de aplicaciones en polvo (4, 12 y aplicación a hojas individuales) en la incidencia de la mancha verde. Todos los tratamientos presentaron mancha verde, incluyendo el testigo, lo que descarta la posibilidad de que la bentonita sea la causante de la mancha verde, pues ésta aparece o no en hojas tratadas y simultáneamente en hojas no tratadas en una misma planta. Algunas observaciones de técnicos involucrados en la producción de tabaco indican que el porcentaje de afectación aumenta a medida que el período de deshidratación se prolonga, por lo que se planificó en el ciclo 1989-1990 un trabajo de investigación para determinar el efecto del periodo de deshidratación en la incidencia de la mancha verde. Se estudió de 1 a 8 dias de deshidratación. En el corte 3 en dos fincas seleccionadas de Esteli y Jalapa. La severidad de la mancha verde se vió influenciada por el periodo de deshidratación, disminuyendo ésta si reducimos los dias de deshidratación.

Efecto de tres distancias de siembra sobre el rendimiento de tres variedades de tabaco habano (Nicotiana tabacum L.), en el municipio de Condega, Esteli

El presente estudio se desarrolló en la finca Cerro Azul, Comunidad de San Pedro, municipio de Condega, Estelí, situado a 620 msnm, 14° 72' 24'' Latitud Norte y 86° 56' 30'' Longitud Oeste, con el objetivo de evaluar el efecto de tres distancia de siembra de siembra (30.48, 35.56 y 40.64 cm) sobre el rendimiento de tres variedades de tabaco (Habano Criollo 751, Habano 2,000 y Habano 98). El ensayo se estableció en febrero del año 2,004. Se utilizó un diseño en Bloques Completos al Azar (BCA) con arreglos en Parcelas Divididas con cuatro réplicas, ubicando en las parcelas grandes las distancias de siembra. A los resultados obtenidos se les realizó un análisis de varianza (ANDEVA) y separación de medias a través de la prueba de rangos múltiples de Tukey con un 95 % de confianza (8=0.05). Los resultados del estudio determinaron que las densidades estudiadas no presentaron efecto significativo en las variables evaluadas. Por otro lado, las variedades de Habano evaluadas demostraron alta significación estadística en la altura de planta y cortes realizados. Para el caso de la distancia entre plantas, los mayores promedios se observaron a los 60 DDT en la densidad de 30,629 plantas ha-1 con 127.78 cm y el menor valor la densidad de 26 814 plantas ha-1 con 120.98 cm. La variedad Habano 2 000 mostró la mayor altura con 128.92 cm, y 121.28 cm la variedad Habano Criollo con 121.28 cm. La mayor longitud de hoja se obtuvo en la densidad de 30 629 plantas ha-1 con un valor promedio de 49.41 cm, y la menor longitud de obtuvo en 35,725 plantas ha-1. Habano Criollo y Habano 2000 presentaron longitud de 49.55 y 49.10 cm. El peso final al beneficiado presentó diferencias estadísticas a los 94 y 102 ddt, siendo la densidad de 35,725 plantas ha-1 la de mayores valores (582.78 y 692.06kg ha-1) y la de menor promedio la densidad 26,814 (483.92 y 628.57 kg ha-1). La variedad Habano 98 evaluada a los 102 ddt mostró 684.78 kg ha-1 y 624.41 kg ha-1 para Habano Criollo. El cultivar Habano 98 con la menor distancia de siembra presentó la mejor relación Beneficio/Costo, obteniendo una ganancia de 2.03 dólar por cada dólar invertido.

Estudio de tres densidades de siembra sobre el rendimiento industrial de tres variedades de tabaco habano (Nicotiana tabacum L.) en el Municipio de Condega, Estelí

El presente estudio se desarrolló en la finca “Cerro Azul”, Comunidad de San Pedro, municipio de Condega, Estelí, situado a 620 msnm, 14 ̊ 72’ 24’’ Latitud Norte y 86 ̊ 56’ 30’’ Longitud Oeste, con el objetivo de evaluar el efecto de tres densidades de siembra (26814, 30629 y 37725 plantas ha -1 ) sobre el rendimiento de tres variedades de tabaco habano (Habano Criollo 751, Habano 2000 y Habano 98). Los tratamientos se establecieron en febrero-2004 sobre un diseño en Bloques Completos al Azar con arreglos en Parcelas Divididas con cuatro réplicas. Los resultados fueron sujetos a un análisis de varianza (ANDEVA) y categorización de medias según Tukey ( ∞ =0.05). Los resultados determinaron que las distancias no presentaron efecto significativo en las variables evaluadas, con excepción del peso final al beneficiado. Asimismo, las variedades demostraron alta significación estadística en la altura de planta y cortes realizados. El cultivar Habano 98 con la menor densidad presentó la mejor relación Beneficio/Costo, obteniendo una ganancia de 2.03 dólar por cada dólar invertido.